يعرض هذا العمل بروتوكول خطوة بخطوة لتقدير إعداد الخلايا العصبية تتميز ستيريولوجيكال غير متحيزة في أسود الدماغ الماوس باستخدام معدات الفحص المجهري القياسي (أي، مجهر ضوء، يجهز كائن جدول (x, y, z الطائرة)، وبرمجيات المجال العام لتحليل الصور الرقمية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ستيريولوجيكال تقدير عدد الخلايا العصبية تتميز في أسود الدماغ الماوس باستخدام فراكتيوناتور الضوئية ومعدات مجهرية القياسية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في بحوث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية، تحليل المسالك نيجروسترياتال، بما في ذلك تحديد مقدار الخسارة العصبية تتميز داخل أسود الدماغ، أمرا أساسيا. لتقدير عدد الخلايا العصبية تتميز الإجمالي، يعتبر غير متحيز ستيريولوجي باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية حاليا معيار الذهب. لأن النظرية وراء الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية المعقدة ونظرا لأن ستيريولوجي أمر يصعب تحقيقه دون المعدات المتخصصة، عدة نظم ستيريولوجي كاملة المتاحة تجارياً التي تشمل البرمجيات اللازمة موجودة، محض لعد أسباب الخلية. منذ شراء إعداد ستيريولوجي متخصصة ليست دائماً ممكنة، لأسباب كثيرة، يصف هذا التقرير وسيلة لتقدير ستيريولوجيكال من الخلايا العصبية تتميز بحساب استخدام معدات الفحص المجهري القياسية، بما في ذلك مجهر خفيفة، يجهز كائن الجدول (x، y، z الطائرة) مع برامج التصوير، وجهاز كمبيوتر للتحليل. ويرد شرح خطوة بخطوة حول كيفية إجراء التقدير الكمي ستيريولوجيكال باستخدام الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية، ويتم توفير ملفات مبرمجة مسبقاً لحساب عدد خلايا المقدرة. وأجرى لتقييم مدى دقة هذا الأسلوب، مقارنة بالبيانات التي تم الحصول عليها من جهاز ستيريولوجي متاحة تجارياً. أرقام الخلية القابلة للمقارنة تم العثور على استخدام هذا البروتوكول والجهاز ستيريولوجي، مما يدل على دقة هذا البروتوكول بالنسبة ستيريولوجي غير متحيزة.
المقدمة
التحديد الكمي لعدد الخلايا العصبية يعتبر عنصرا محوريا في أبحاث مرض باركنسون قبل الإكلينيكية لتحديد مستوى نيوروديجينيريشن داخل المادة الرمادية (SN)1،2. ويعتبر تقدير عدد الخلايا في منطقة لمصلحة ستيريولوجيكال غير متحيزة معيار الذهب3،،من45.
قبل مجيء ستيريولوجي غير منحازة، تم تقييم عدد الخلايا العصبية في الأقسام عن طريق التلاعب في التشكيلات الجانبية للخلية التي تم جردها لتصحيح للاحتمالات متغير أن الخلايا العصبية حيز البصر في مقطع. إحدى الطرق الأكثر استخداماً هو تصحيح عدد خلايا كمياً تصفها ابركرو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
اتبعت جميع التوجيهية الدولية والوطنية، و/أو المؤسسية المطبق لرعاية واستخدام الحيوانات. واعتمد البروتوكول السلطات المحلية في اونترفرانكين فون ريجيرونج، ويرزبيرج، ألمانيا-
1-تجهيز الأنسجة وإيمونوهيستوتشيميستري
- الفئران يوثانيزي CO 2 أو أي دولة أخرى وافقت الأسلوب.
- عمره 12 أسبوع ستة بيرفوسي C56Bl/6N الفئران الذكور ترانسكارديالي مع 10 مل من مخزنة الفوسفات 0.1 M المالحة (PBS) باستخدام إبرة 25-ز، ومضخة لضخ، تليها 70 مل بارافورمالدهيد 4% (PFA) في برنامج تلفزيوني 0.1 م.
تنبيه: منهاج عمل بيجين السامة والمسببة للحساسية، ومسببة للسرطان. - تشريح الدماغ الماوس في الطائرة الاكليلية مع مقسم طر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام أسلوب عرضها، العدد المقدر لل + تتميز الخلايا العصبية في حق التعطيل وتراوحت بين الخلايا 7,363 و 7,987، وفي اليسار التعطيل، بين الخلايا 7,446 و 7,904. وبالتالي، كان متوسط عدد الخلايا العصبية تتميز (± SEM) 7,647 الخلايا 83 ± ± 7,675 66 لليسار التعطيل وحق التعطيل. CE المحسوبة لكل الحيوانات كانت أقل من 0.08 (النطاق: 0.073 0.079) (الشكل 7). للتأكد من إمكانية المقارنة بين هذا الأسلوب مع نظم ستيريولوجي المتخصصة والمتاحة تجارياً، كانت أرقام الخلية SN أيضا كميا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويبدأ ستيريولوجي مع معالجة الأنسجة. يجب أن يتم قطع الأنسجة SN المسلسل بعناية لمنع الخسائر في الأقسام أثناء تحليل ستيريولوجيكال. بالإضافة إلى ذلك، خطوة أساسية للاحتفال واحد نصف الكرة الأرضية بغية تمييز الحق من اليسار SN عند تنفيذ ستيريولوجي. وضع ثقب صغير في الجزء العلوي من جذع الدماغ تولد نتائج أفضل في الدراسة المقدمة. وعلاوة على ذلك، منذ العمل مع متطلبات الأسلوب فراكتيوناتور الضوئية أن الأنسجة قطع في فروع سميكة من حوالي 30-40 ميكرومتر، بدلاً من ميكرومتر 5-10 أكثر شيوعاً في إيمونوهيستوتشيميستري وجسم واختراق السوائل الأنسج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
أولاً الأميركي جيم خدمت في المجالس العلمية للمستحضرات الصيدلانية ميرز وشركة تيفا؛ وقد تلقت تمويلاً للسفر من إبسن والمستحضرات الصيدلانية ميرز، ذ م م وشركة Allergan؛ وقد تلقي أتعاب المتكلم من ميرز، تيفا, وشركة Allergan خارج العمل المقدم. . ج. ف عملت كمستشار لبوسطن العلمية ومدترونيك، وأبفيي، وتلقت الأتعاب من مدترونيك والعلمية بوسطن، أبفيي، بيل، Allergan، وجلوبالكينيتيكس خارج العمل المقدم.
شكر وتقدير
الكتاب ممتنون لروم كيلي ولويزا Frieß، ومنزل هايك لخبراء المساعدة التقنية؛ إلى هيلغا برنر لرعاية الحيوان؛ وإلى جناح س. تشيستوفير لتوليد وتوزيع ديسيكتور البصرية شبكة البرنامج المساعد للبرنامج إيماجيج.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الماوس Paxinos | دماغ الفأر جورج باكسينوس كيث بي جيه فرانكلينحقوق الطبع والنشر @ 2001 بواسطة Academic Press CD Rom designet & amp تم إنشاؤه بواسطة Paul Halasz | ||
| ماوس تقطيع مصفوفة الدماغ | Zivic Instruments | BSMAS 001-1 | |
| paraformaldehyde | Merck | 1040051000 | |
| السكروز / D (+) Saccharose | Roth | 4621.1 | |
| isopentane | Roth | 3927.1 | |
| الجلسرين | Merck | 1040931000 | |
| الإيثانول | سيجما ألدريتش | 32205-1L | |
| name< / strong> | Company< / strong> | Catalog Number< / strong> | Comments< / strong> |
| phosphate المكونات الملحية المخزنة: < / كلوريد الصوديوم > | |||
| الصوديوم | سيجما ألدريتش | 31434-1KG-R | |
| فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم | ميرك | 1048731000 | |
| ثنائي الصوديوم فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم | ميرك | 1065801000 | |
| كلوريد البوتاسيوم | ميرك | 1049360500 | |
| مصل الماعز العادي | داكو | X0907 | |
| ألبومين مصل الأبقار | Sigma | A4503-100G | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ml | منظف |
| 3،3-Diaminobenzidine-tetrahydrochlorid / DAB أقراص 10 مجم درجة الحموضة 7.0 | Kem En Tec | 4170 | |
| H2< / sub>O2< / sub> / بيروكسيد الهيدروجين 30٪ | ميرك | 1072090250 | |
| أفيدين / بيوتين الكاشف | Thermo Scientific | 32050 | مجموعة تلطيخ ABC القياسية فائقة الحساسية ، 1:100 |
| أرنب مضاد للفأر التيروزين هيدروكسيلاز الجسم المضاد | abcam | Ab112 | 1: 1000 |
| مختبرات ناقلات الماعز المضادة للأرانب IgG H + L | BA-1000 | 1:100 | |
| إصدار StereoInvestigator 11.07 | MBF | ||
| BX53 مجهر | أوليمبوس | ||
| Visiview | Visitron Systems GmbH | 3.3.0.2 | |
| برنامج Axiophot2 | Zeiss | ||
| ImageJ | المعاهد الوطنية للصحة | الإصدار 4.7 | |
| Tissue-TEK OCT | Sakura | 4583 | |
| الجليد | |||
| واين راسباند | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/graphic-overlay.html | ||
| البرنامج المساعد عداد الخلية | Kurt de Vos | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html). | |
| الماكرو البصري | كريستوفر وارد | ||
| C57Bl / 6N ذكور الفئران | تشارلز ريفر ، ألمانيا | ||
| SuperFrost Plus شرائح كائن مطلي | Langenbrinck ، ألمانيا | ||
| 25G إبرة Microlance 3 | BD | 300400 | |
| REGLO مضخة التسريب التناظرية | Ismatec | ISM 829 | |
| نظام StereoInvestigator | StereoInvestigator الإصدار 11.07 | ||
| BX53 مجهر | BX53 المجهر | ||
| علم التعقيم | المتنوع Visiview | ||
| Axiophot2 | Axiophot2 |
المراجع
- Ip, C. W., et al. AAV1/2-induced overexpression of A53T-alpha-synuclein in the substantia nigra results in degeneration of the nigrostriatal system with Lewy-like pathology and motor impairment: a new mouse model for Parkinson's disease. Acta Neuropathol Commun. 5 (1), 11(2017).
- Ip, C. W., ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
