عد البروتينات في الخلايا المفردة مع الحبرية عنونة [ميكروارس]

والهدف من هذا الأسلوب لتحديد التباين في وفرة البروتين المستهدف في عدد سكان خلية مع القرار خلية مفردة. تحليل وحيد الخلية يوفر عددا من المزايا التي لا تتوفر بالطرق البيوكيميائية الفرقة التقليدية. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} أولاً، العمل على مستوى الخلية الواحدة التقاط الغنية عدم تجانس السكان الخلية التي سوف تضيع خلاف ذلك من متوسط الذي يحدث مع التقنيات التقليدية فرقة البيوكيميائية. غالبية الطرق البيوكيميائية الحصان العمل العمل مع الجزء الأكبر، التي تتطلب، كما يفعلون في كثير من الأحيان، ملايين خلايا للحصول على نتيجة. بطبيعة الحال، والمترتبة على تقييم السكان الخلية بأكملها يتوقف على عدد من العوامل، على سبيل المثال، عدم التجانس في التعبير البروتين حيث قد غاب عن بعض الميزات الهامة لتوزيع وفرة البروتين. من منظور عملي، جعلها الحساسية اللازمة لتقنيات خلية واحدة قادرة على العمل مع كميات من المواد البيولوجية التي لا تكفي حتى التقنيات الأكبر أكثر حساسية وظيفة. مثال أساسي لهذا هو دراسة أنواع الخلايا النادرة مثل تعميم ورم الخلايا (ريادية) فيها حتى بالنسبة للمرضى الذين يعانون من نظرة تشخيصية فقراء أقل من 10 ريادية قد تكون موجودة في دم واحد 7.5 مل رسم. ⁶ هنا نقدم المنهجية اللازمة لإجراء القياسات البروتين وحيد الخلية تخفيض حجم التحليل القائم على جسم تستخدم قطرات النفط توج المطبوعة على ميكرواري جسم استخدام.

هي منصات الحبرية موائع جزيئية عالية الإنتاجية، قادرة على توليد آلاف قطرات في الثانية، وقادرة على عزل، واستزراع حتى، الخلايا المفردة في قطرات الفردية لأداء مجموعة واسعة من الاختبارات البيوكيميائية. الأساليب المستندة إلى الحبرية أيضا مناسبة لتحليل خلية مفردة،^7،،من⁸⁹ مع الأمثلة الأخيرة الجديرة بالذكر بما في ذلك دروبسيق¹⁰ وإيندروب¹¹، التي ساعدت إلى حد كبير بقوة تقنيات التضخيم. كمية محدودة من المواد ولا أساليب التضخيم للبروتينات تجعل البروتيوميات خلية مفردة تنطوي على تحديات خاصة.

قطرات قد يتم تحليلها بعدد من الأساليب والفحص المجهري الأسفار وقد استخدمت على نطاق واسع. تقنيات جزيء واحد مثل الانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية تسمح جزيئات الفلورية تصور مع نسبة الإشارة إلى الضوضاء لا مثيل لها. ¹² سبب الانحلال الأسى من ميدان زائل، متحمسون فقط فلوروفوريس بالقرب من السطح (ترتيب 100nm) عالية مما يجعل TIRF استراتيجية جيدة في الكشف عن كميات صغيرة من جزيء الهدف في خليط معقد. قوة تقطيع البصرية المتأصلة TIRF كما يساعد على تجنب خطوات الغسيل والاعتداء حدود الوقت وتعقيد. ومع ذلك، TIRF يتطلب السطوح المستوية وأمثلة للفحص المجهري TIRF المطبقة على قطرات في تدفق تنطوي على تشكيل سطح مستو منها بصورة. ¹³ تحقيقا لهذه الغاية، تقنيات البروتين وحيد الخلية غالباً تصميم رقائق موائع جزيئية حول عوامل التقاط سطح معطلة في شكل ميكرواري. ^{4 , 14}

قد شكلت القطرات، أنفسهم، في صفائف على الأسطح المستوية الحبرية ما يسمى [ميكروارس]. ^{15 , 16 , 17} تنظيم قطرات مكانياً في صفائف يسمح لهم بتكون مريح فهرستها بسهولة رصدها مع مرور الوقت وفردية موجهة و، إذا لزم الأمر، استرداد. ويمكن تحقيق الحبرية [ميكروارس] بكثافة عالية من المفاعلات الصغيرة مع آلاف عناصر كل شريحة بذاتها أو تدعمها هياكل ميكروويل. ^{18 , 19 , 20} أنها قد تكون شكلت بترسب متسلسلة بمناولة السائل الروبوتات، مستطلعين النافثة للحبر، اتصل ميكرواراييرس^21،،من^2223،،من^{2425، 26} أو أنها يمكن تجميع ذاتي على السطوح مثل سوبيرهيدروفيليك البقع منقوشة على سطح سوبيرهيدروفوبيك. ^{27 , 28 , 29}

في ضوء هذه الاعتبارات، صممت عنونة الحبرية [ميكروارس] (ADMs) الجمع بين براعة و addressability المكانية وكميات مخفضة من [ميكروارس] الحبرية مع حساسية جزيء واحد TIRF المجهري للكمية قياس وفرة البروتين. ⁵ ADMs تمكين تحليل خلية مفردة تشكيل ميكرواري الحبرية التي تحتوي على خلايا مفردة أكثر جسم ميكرواري، الذي هو ثم توج بالنفط لمنع التبخر. وحدات تخزين القطرات منفصلة لمنع فقدان عينة، تتحقق إلا بأحكام بصمام على شريحة في تدفق مستمر ميكروفلويديكس. ³⁰ المبلغ المطلق للبروتين الهدف من خلية واحدة صغيرة للغاية؛ ومع ذلك، يسمح تدني حجم القطرات لتركيز المحلية مرتفعة نسبيا كيما يتم الكشف عنها باستخدام مقايسة أضداد ساندويتش-جسم هو المعطل تداولها في منطقة متميزة، أو بقعة على سطح الذي يلتقط البروتين الذي يربط بدوره لجسم فلوريسسينتلي المسمى الكشف عن هذا في حجم قطره. كنهج خالية من التسمية (أي البروتين أهدافا لا تحتاج إلى أن توصف بشكل مباشر)، ADMs قابلة للتطبيق عموما لتحليل الخلايا من المصادر الأولية، مثل الدم المجهزة، وغرامة بحاجة إلى تبين وينتابها ورم الخزعات، فضلا عن خلايا من الثقافة و ما ليساتيس.

قياس التباين في وفرة البروتين عبر سكان خلية مهم في تحديد تباين استجابة، على سبيل المثال، إلى مخدرات وسوف يساعد في توفير نظرة ثاقبة الوظائف الخلوية ومسارات، تقييم الفئات السكانية الفرعية وبهم السلوك، فضلا عن تحديد الأحداث النادرة التي خلاف ذلك سوف يكون مقنعا بأساليب الجزء الأكبر. توضح هذه المقالة كيفية إنتاج واستخدام عنونة الحبرية [ميكروارس] لتحديد الكمية وفرة p53 عامل النسخ في الخلايا السرطانية البشرية هذا البروتوكول ويمكن استخدامها للتحقيق في دور p53 في الاستجابة للعلاج الكيميائي المخدرات. البروتين الهدف يتحدد باختيار الالتقاط والكشف عن الأجسام المضادة ويمكن تعديله لتشمل أهدافا مختلفة أو أكثر. يتم توفير إرشادات لبناء جهاز بسيطة تتضمن فوهة متحدة مركز من لوازم مختبر العامة لصفيف 10 قطرات nL توج بالنفط يدوياً. ويرد وصف عملية تجريبية كاملة بموجبه كل قطره ثم تحميل مع خلية مفردة، ومن ثم تفكيك والتعبير عن البروتين مصممة مع القرار جزيء واحد استخدام الفحص المجهري TIRF.

1-إعداد

1. رقائق وطباعة جسم [ميكروارس]
   1. إرفاق المعزل لاصق سيليكون/اكريليك ساترة فونكتيوناليزيد لدعم ميكرواري جسم. وهذا يشار إليه كشرائح.
      ملاحظة: تم اختبار كيمياء السطح مختلف لملاءمتها مع قطرات عنونة. ⁵ قد تحتاج كيمياء السطح الأمثل لوكلاء أسر بديلة. ADM عوازل متوفرة تجارياً أو قد يتم إنتاجها بالليزر قطع اﻷكريليك (CAD الملف للمعزل المستخدمة في هذا العمل يتم توفيرها للتنزيل؛ راجع ملف التعليمات البرمجية الإضافية).
   2. التبديل في ميكروارايير وتعيين نسبة الرطوبة إلى 75%.
      ملاحظة: الرطوبة النسبية يقلل من تبخر المحلول الطباعة من طرف ميكرواري ويقلل التباين داخل وبين سبت.
   3. تنظيف دبوس ميكرواري في دبوس تنظيف الحل لمدة 5 دقائق قبل ultrasonication. شطف pin مع المياه النقية فائقة باستخدام زجاجة غسيل والجاف باستخدام النتروجين.
      ملاحظة: تعليق رقم التعريف الشخصي فيما يتعلق بألا تزج نصيحة دبوس. سوف تساعد شريحة مجهر مع مجموعة على النحو المناسب حفر ثقوب إذا لا يمكن الحصول على حامل دبوس.
   4. إجراء 5 مل من المخزن المؤقت للطباعة تتألف من 3 × سترات الصوديوم المالحة (SSC) العازلة، بروبيل بتائين 1.5 متر وتستكمل مع 0.01 ٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS). تخزين في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى.
   5. لإعداد حل طباعة، ذوبان الأجسام المضادة-p53 (p53/Mdm2 أليسا كيت؛ انظر الجدول للمواد) مختبرين المخزنة في-80 درجة مئوية. مزيج من 1:1 مع المخزن المؤقت للطباعة إلى تركيز نهائي من 0.5 ملغ/مل. تحميل 5-10 ميليلتر من حل الطباعة في صفيحة جيدا 384 استخدام ميكروبيبيتي وفي ميكروارايير.
   6. تحميل رقائق تجميعها في خطوة 1.1.1 في ميكروارايير. برنامج ميكروارايير لطباعة بقع في الإحداثيات التي حددها المركز من كل بئر المعزل.
      ملاحظة: ميكرواراييرس تستخدم طائفة من، أساسا، البرمجيات المسجلة الملكية وحتى القارئ مدعوة إلى مراجعة الأدبيات ذات الصلة. ميكرواري المطلوبة للمعزل ADM واردة في الملف CAD المصاحبة لها في خطوة 1.1.1 يتألف من العناصر مستطيلة؛ يتم توفير مسافات ذات الصلة.
   7. تخزين الرقائق في حاويات محكم والتفاف مع إحباط. تخزين في 4 درجات مئوية إلى 6 أسابيع.
      ملاحظة: إحباط لمنع أي صور--الضرر. حدود التخزين في 4 درجات مئوية معدل تدهور الجزيئات الحيوية وأي ردود الأفعال الضارة التي قد تعمل على الحد من نشاط ميكرواري. وعاء محكم يسمح رقائق لحجته إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها دون التكثيف تشكيل على سطح الرقاقة. طباعة جهات الاتصال ميكرواري يستغل التوتر السطحي والالتصاق بين حل الطباعة والركيزة الطباعة لإنتاج البقع. ما قبل الطباعة أو النشاف مطلوب عادة إزالة الحل الزائدة من طرف ميكرواري تؤتي البقع موحد الحجم. عدم تجاهل ساترة ما قبل الطباعة الذبيحة حيث يمكن استخدامه لتقييم نوعية دفعة.
2. إعداد المحاقن، فوهة الأنابيب ومتحدة للاستغناء عن قطرات عنونة
   1. تفكيك 100 ميليلتر (الحبرية مائي) ومل 1 (للنفط متوجا) الزجاج المحاقن هاملتون وشطف الأجزاء مع المقطر H₂o.
   2. تغذية بطول 100 مم من 150 ميكرومتر معرف/360 ميكرومتر OD تنصهر والسليكا الأنابيب عن طريق طوله 40 مم من 1.0 مم معرف/1/16 "أنابيب OD منهاج العمل حتى أنه يبرز من 2 مم. وستشكل هذه الفوهة متحدة المركز.
   3. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate إلى نهاية طرف ماصة 10 ميليلتر وإدراج قطعة 40 مم من 1.0 مم معرف/1/16 "أنابيب OD منهاج عمل بيجين. إذا لزم الأمر، قم بتغيير موضع الأنبوب والسليكا فوسيد للحفاظ على نتوء 2 مم في الفوهة قبل مجموعات لاصقة.
   4. إدراج الطرف الآخر من السليكا فوسيد الشعرية في نهاية طوله 200 ملم 0.014 "معرف/0.062" OD PTFE أنابيب والاتصال هذا 100 ميليلتر هاملتون حقنه مليئة 4% مصل بقرى الزلال (BSA) في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) (ببسا).
      ملاحظة: البروتينات وغيرها من الأنواع الكيميائية الحيوية قد ربط غير خصيصا للأسطح ويمكن فقدت أو التشويه والتحريف. يتم استخدام جيش صرب البوسنة 'تعطيل' السطوح إلى أدنى حد غير محددة ملزمة قرباني ملزمة لتلك السطوح.
   5. أدخل طول 400 مم من 1.0 مم معرف/2.0 مم أنابيب OD FEP في تلميح ماصة 200 ميليلتر حتى أنها تشكل ختم. تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate على آخر 200 ميليلتر ماصة نصيحة ودفع هذا في أول تلميح لإصلاح الأنبوب في مكانة. قم بتوصيل الطرف فتح أنابيب OD FEP ملم معرف/2.0 1.0 مم 1 مل هاملتون حقنه مليئة بالزيوت المعدنية.
   6. إدراج 200 ميليلتر ماصة نصيحة الجمعية في 10 ميليلتر ماصة غيض من فوهة متحدة المركز. ضع الحقن في مضخات حقنه منفصلة كما أنها سوف تحتاج إلى أن تعمل بشكل مستقل.
   7. ملء المحاقن 100 ميليلتر مع 4% ببسا عرقلة الحل. أعد وتدفق الأنابيب 'مائي' عرقلة للحل. كرر هذه العملية مرتين لمجموعة الإحمرار 3.
   8. ملء المحاقن 100 ميليلتر مع 0.125 ميكروغرام مل^-1 الكشف عن الأجسام المضادة (p53 المضادة جسم (-1) المسمى مع أليكسا 488) 4% ببسا وإعادة إرفاق الأنابيب. يستعاض عن عرقلة الحل في الأنابيب بالاستغناء عن 25 ميليلتر كشف الأجسام المضادة الحل.
   9. تدفق الأنابيب 'النفط' مع الزيوت المعدنية حتى تملأ جميع الأنابيب والفوهة بالنفط. إعادة ملء المحاقن 1 مل مع الزيوت المعدنية وإعادة إرفاق الأنابيب. تأمين الجمعية مناور XYZ على الأنابيب وفوهة.
3. إعداد ميكروينجيكتور وميكرومانيبولاتور
   ملاحظة: الخطوات أدناه إشارة محددة إلى مكونات ميكروينجيكتور وجهاز ميكرومانيبولاتور المحددة في "الجدول للمواد"، ولكن قابلة للتطبيق عموما لأي جهاز من هذا القبيل.
   1. التجمع في ميكروينجيكتور عن طريق ربط أنابيب الضغط وحامل الشعرية.
   2. تدوير ببطء الاتصال الهاتفي المكبس حتى يملأ الزيوت المعدنية تماما على الخط.
   3. جبل صاحب الشعرية في جبل الرأس الترجمة.
   4. إصلاح شعري في حامل الشعرية مع رئيس قبضة.
   5. "الماصة؛" حلاً 4% ببسا إلى واحدة من آبار المعزل.
   6. ترجمة باستخدام ميكرومانيبولاتور وتزج غيض من شعري في الحل.
   7. ملء ببطء شعري مع 4% ببسا وإجازة لحظر لمدة 10 دقائق.
   8. إخراج ميكروكابيلاري وقطب وحدة الترجمة حيث أن الجمعية الواضح للرقاقة.

2-تشكيل قطرات عنونة وتحميل مع خلايا مفردة

1. شكل قطيرات عنونة
   1. تأمين الرقاقة على المسرح المجهر.
      ملاحظة: هو المجهر الأسفار مقلوب المجهر الآلي قادر على جزيء واحد TIRF مزودة مرحلة XY مرمز والكترون ضرب جهاز الكاميرا (م-اتفاقية مكافحة التصحر).
   2. تسجيل إحداثيات المرحلة المجهر من كل بقعة في الصفيف باستخدام برامج التحكم الآلي المجهر.
   3. تعيين مناور XYZ على المسرح المجهر. ضع الفوهة في زاوية من 50-60 درجة مئوية. ضمان أن الفوهة طول كاف والتخليص للوصول إلى شرائح. تعيين 'مائي' و 'النفط' المحاقن مضخات الاستغناء عن 10 nL في 100 ميليلتر/min و 5 ميليلتر في الدقيقة 100 ميليلتر، على التوالي.
      ملاحظة: أثناء الإعداد، قد جاف محلول مائي على رأس الفوهة.
   4. الاستغناء عن محلول مائي حتى حبة سائل مرئياً على رأس الفوهة. الدأب مع مسح غبار مجاناً لإزالته.
      ملاحظة: اعتماداً على عدد الشروط قيد التحقيق، حجز عدد من الآبار لتكون بمثابة خزانات للخلايا. سوف يكفي خزان واحد لخط أو نوع خلية مفردة.
   5. باستخدام برامج التحكم الآلي المجهر، تعيين إحداثيات المرحلة المجهر إلى بقعة جسم في الصفيف والتركيز على سطح ساترة.
   6. الحرص على عدم الإخلال بالحال، استخدام مناور XYZ، محاذاة طرف فوهة متحدة المركز إلى جانب بقعة جسم الشعرية الزجاج والاستغناء عن 10 nL محلول. دون الانتقال إلى المراحل، الاستغناء عن 5 ميليلتر من النفط الحد الأقصى في المحلول. ببطء رفع الفوهة واضحة من الحبرية والانتقال إلى التالي جيدا.
   7. كرر الخطوة 2.1.6 لكل جسم بقع في الصفيف.
   8. وبعد 30 دقيقة، صورة جميع النقاط في الصفيف باستخدام برامج التحكم الآلي المجهر لتحديد خلفية الجزيئات واحدة ملزمة لكل جسم بقعة قبل تحميل خلايا.
2. تحميل قطرات عنونة مع الخلايا
   1. إزالة قوارير الثقافة الخلية من الحاضنة وفصل الخلايا باستخدام حل التربسين/يدتا.
      ملاحظة: في هذه الدراسة، خط خلية سرطان القولون البشرية تكون استخدمت ومثقف استخدام تعديل النسور المتوسطة (دميم دولبيكو) تستكمل مع 10% (v/v) المصل البقري الجنين (FBS) في حاضنة₂ CO.
   2. إذا لزم الأمر، وصمة عار فلوريسسينتلي الخلايا.
      1. ريسوسبيند الخلايا في حل من 0.125 ميكروغرام/مل الكشف عن الأجسام المضادة (p53 المضادة جسم (-1) المسمى مع أليكسا 488) في 10% FBS في L-15 وسائل الإعلام. للتأكد من تعليق خلية مفردة، تصفية الحل خلية عن طريق مصفاة خلية الملعب 40 ميكرومتر.
   3. عد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير وتمييع أو تركيز حل الخلية بتركيز 25-400³ × 10 خلايا/مل. وهذا ما يضمن أن الرواسب الخلايا مع تباعد كافية لمعالجة بشكل مريح في ميكروكابيلاري.
   4. تحميل خلايا مفردة في عنونة قطرات من الخزان الخلية باستخدام ميكرومانيبولاتور وميكروكابيلاري.
      ملاحظة: الخلايا غير ملتصقة قد تكون محملة بكميات كبيرة إلى ميكروبيبيتي والاستغناء عن واحدة تلو الأخرى إلى قطيرات عنونة. على الرغم من المعاملة حظر السطحية، سوف تميل خطوط الخلايا ملتصقة العصا غير تحديداً إلى الجدار الداخلي ميكروكابيلاري الزجاج وتضيع.
   5. استخدام هدفا × 10 للاحتفال، استخدم في ميكروينجيكتور لنضح خلية واحدة في ميكروكابيلاري من الخزان الخلية.
   6. تخزين إحداثيات المرحلة ميكرومانيبولاتور في حالة استخدام مرحلة مناور إلكترونية أو ملاحظة z-الموقف يدوياً.
   7. سحب ميكروبيبيتي بترجمة صعودا إلى مسح ارتفاع 1 مم للرقاقة. تنفيذ ذلك يدوياً مع جويستيك أو تلقائياً باستخدام ميزة 'إخراج' مرحلة مناور الإلكترونية.
   8. مجموعة تنسق المرحلة إلى أن من الحبرية عنونة استخدام الآلي مجهر مراقبة البرامج. 'حقن' ميكروبيبيتي طريق العودة إلى المخزن (أو ذكر) z-الموقف. القيام بهذا يدوياً مع جويستيك أو تلقائياً في حالة استخدام مرحلة مناور إلكترونية.
      ملاحظة: سوف بيرس النفط متوجا ميكروكابيلاري وتكون موجودة داخل جزء مائي الحبرية عنونة.
   9. الاستغناء عن الخلية في الحبرية عنونة استخدام في ميكروينجيكتور. سيتم زيادة حجم معالجة تجميعية nL سعته 10 بأقل من 1%.
   10. كرر 2.2.5-2.2.9 قطرات عنونة المتبقية تاركة بعض الخطوط لمراقبة التجريبية حيث قطرات عنونة لا يحتوي على خلية.
       ملاحظة: بديلاً أبسط لتحميل خلايا مفردة في عنونة قطرات باستخدام ميكروكابيلاري وميكرومانيبولاتور ليحل محل الحل في الخطوة 1.2.8 مع إيجاد حل للكشف عن الأجسام المضادة في 4% ببسا التي تحتوي على الخلايا بتركيز يقارب 10 ⁵ خلايا/مل، أي ما يعادل 1 خلية/10 nL. شغل خلية مفردة بويسونيان وتركيز الخلية سوف تحتاج إلى أن يكون الأمثل.
3. الخلايا ومجموعة الصور
   1. صورة الخلايا في قطرات استخدام الفحص المجهري برايتفيلد، بما في ذلك أي تصوير الأسفار.
      ملاحظة: التصوير يأخذ حوالي 3 دقائق صورة قطرات ~ 100 مجهر الآلي باستخدام. القيام بالتصوير مع غ 60 = 1.49 الغمر النفط الهدف. مطلوبة أية عوامل تصفية للتصوير برايتفيلد بينما تستخدم مجموعات التصفية القياسية لتصوير الأسفار.
   2. صورة جميع النقاط في الصفيف باستخدام جزيء واحد TIRF المجهري.
      ملاحظة: يتم استخدام إعدادات كما في الخطوة 2.3.1 مع TIRF متخصصة تصفية مجموعة. سيتم تحليل هذه الصور في وقت لاحق في القسم 3 لتحديد خلفية الجزيئات واحدة منضمة إلى كل بقعة جسم قبل تفسخ. تصوير جزيء واحد باستخدام الانعكاس الداخلية مجموع الأسفار (TIRF) مجهرية يأخذ حوالي 5 دقائق لصورة البقع ~ 100.
   3. وتركز على خلية في الحبرية سعته. تحقيق تحلل ضوئي كاملة بالتركيز 6 واحد ns ليزر النبض (طول موجي 1064 نانومتر، µJ ± 0.3 الطاقات 14.1 نبض كل نبض) القريبة من موقع الخلية.
      ملاحظة: نبض الليزر يضع فقاعة تكهف توسع أن المقصات الخلية وتحرر مكونات الخلوية في حجم قطره. ^{4 , 31} عدم الإزعاج العمليات الميكانيكية بسبب تحلل المستحثة بالليزر واجهة الزيت عن الماء في طاقات نبض منخفضة. تحلل ضوئي يستغرق عادة حوالي 20-30 دقيقة 100 خلية. كما تمت مناقشته في المقطع المناقشة، وهناك عدد من الطرق البديلة الخلايا المفردة إذا لم يكن ممكناً إعداد تحلل ضوئي.
   4. كرر كل قطرات عنونة الخلية التي تحتوي على ترك 5 مجاناً لعنصر التحكم التجريبية حيث قطرات عنونة يحتوي على خلية تابعة للأمم المتحدة.
   5. ملاحظة الوقت الذي هو تفكيك كل خلية.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه الأوقات لتصحيح منحنيات الربط الفردي لكل بقعة في خطوة 3.1.9. غالباً ما يكون كافياً لملاحظة الأوقات عندما يتم تفكيك الخلايا الأولى والأخيرة وتقدير بقية افتراض وقت كاف متسقة بين أحداث تحلل.
   6. الحصول على الصور جزيء واحد باستخدام TIRF المجهري لجميع البقع كل 10 دقيقة لأول 30 دقيقة ثم كل 20 دقيقة لزيادة 60 دقيقة. إلا إذا كان مهتم كمية البروتين ملزمة في التوازن، صورة جميع البقع بعد حضانة شرائح لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الوقت للتوصل إلى توازن سيتوقف على حجم التجميعية والانتماءات من الأجسام المضادة التي تستخدم في الفحص. TIRF مجهرية تتم باستخدام ليزر مصدر إثارة في = 488 نانومتر و 1.5 ميغاواط السلطة كما يقاس في الفتحة الخلفية باستخدام مقياس طاقة ضوئية. الصور جزيء واحد يتم الحصول عليها عن طريق تحديد الإعدادات الحصول على الكاميرا م-اتفاقية مكافحة التصحر إلى 900 مللي وقت الامتلاك، رقمنة 16 بت معدل قراءات 1 ميغاهرتز واكتساب م عامل قدرة 10. قد يعاد استخدامها في المعزل عن طريق إزالة بعناية ساترة.

3-بيانات التحليل

1. جزيء واحد العد (نظام غير مزدحمة/الرقمية)
   1. استخدام فيجي (أو Matlab)، لأي بقعة في جسم غير مزدحمة، تحميل الصورة المكتسبة قبل تحلل (الخلفية، بكد).
      ملاحظة: تجري العمليات في الخطوات التالية مستقيم باستخدام برمجيات تحليل الصورة في فيجي. يمكن الاطلاع على دليل مستخدم في https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html الرابط التالي.
   2. وفي فيجي، حدد الصورة بكد. ضمن القائمة "صورة" حدد "مكرر" إلى BKD مكررة. حدد صورة مكررة وضمن "عملية > عوامل التصفية"، حدد "التمويه الضبابي" وحدد نصف قطرها 50 بكسل.
   3. تسطيح الصورة BKD حيث أن هناك توزيعاً كثافة موحدة فعالة مصدر الضوء الإثارة بتقسيم الصورة بكد بالصورة بكد غير واضحة، وإنتاج BKD_FLAT.
      1. في إطار "عملية" حدد "صورة آلة حاسبة..."، وتحديد عملية "الفجوة"، والصور المطلوبة، وتحديد مربعات "إنشاء إطار جديد" و "نتيجة 32-بت (عدد عشري)".
   4. طرح كل بيكسل في الصورة 1 ("عملية > الرياضيات" وحدد "طرح..."، وحدد قيمة 1). كثافة بكسل المتوسط يجب أن تكون 0.
      ملاحظة: حقل التسوية وقد دققت الأرض خلفية الصور بسهولة حيث يجب أن يكون مجموع كل بكسل 0 ويمكن تعويضه أي إزاحة المتبقية أكثر مستقيم ل.
   5. حدد منطقة بكسل × 50 بكسل 50 في أي من 4 زوايا الصورة BKD_FLAT. قياس الانحراف المعياري بكثافة بكسل (σ) عن طريق تحديد "تحليل" و "التدبير".
      ملاحظة: سيقدم إحصاءات موجزة للتحديد في إطار نتائج. وهذا يحدد خلفية قبالة بقعة حيث هناك من غير المرجح أن تكون كثافة عالية من جزيئات مفردة. يجوز اختيار المنطقة لقياس يدوياً باستخدام أدوات التحديد الافتراضي القائمة أو عن طريق تشغيل الماكرو البرمجية "ماكيريكتانجلي (x، y، العرض، والارتفاع)"؛ يؤدي هذا إلى إنشاء شبكة تحديد مستطيلة، حيث x و y الحجج هي إحداثيات الزاوية العليا اليسرى (بالبكسل).
   6. تعيين العتبة الصورة إلى 3σ وخلق صورة ثنائي SM_MASK.
      1. تحت "الصورة > ضبط"، حدد "عتبة..."، وتعيين مستوى العتبة الدنيا إلى 3σ.
         ملاحظة: يتم تعيين القيمة التي أدنى من العتبة بكسل إلى الصفر وكسل تتجاوز العتبة تم تعيينها إلى 1. وستحدد العتبة الثقة التي تنتمي ثريشولديد بكسل لجزيء واحد.
   7. في صورة مجزأة SM_MASK، قيم الكثافة بكسل تعيين إلى الصفر أي الكائنات التي لم تقم حجم 4-9 بكسل² وتدوير من 0.5-1 عن طريق تحديد "تحليل" تليها "تحليل الجزيئات" وتحديد حجم والتدوير.
      ملاحظة: قد تحتاج إلى حجم بكسل الأمثل لمجموعة أخرى فلوروفوريس ومجهر ups. بسبب نوع الضوضاء الكاميرا بكسل واحد قد يكون أعلى من هذا الحد ولم يتم إهمالها على الرغم من كونه لا جزيئات مفردة. سيتم تجاهل معيار حجم بكسل بشكل صحيح تلك بكسل. جزيئات وحيدة عموما الشكل الدائري. وتشير قيمة تدوير 1 إلى دائرة كاملة بينما تشير قيمة تقترب من 0 إلى شكل متزايد ممدود. الكائنات الباقية هي جزيئات مفردة وقد عدها. قد يتم تعيين قناع لترسيم منطقة بقعة للتمييز في مكان و قبالة بقعة تحسب لكل إطار. هذا أسهل للإطارات التي اكتسبت في وقت لاحق عندما يكون هناك إشارة كافية في الموقع التي يمكن تطبيقها ثم إلى إطارات سابقة.
   8. لنفس المكان جسم غير مزدحمة، تحميل، وكرر الخطوات 3.1.1-3.1.7 لكافة إطارات الصور القبض على سلسلة حل الوقت اكتسبت تحلل الوظيفة. استخدام الأوقات تحلل بتدوينه في الخطوة 2.3.5. لتصحيح أي منحنيات ملزمة.
2. جزيء واحد العد (نظام المزدحمة/تناظري)
   1. ولحساب متوسط كثافة جزيء واحد، قبل المضي قدما، كرر الخطوات 3.1.1-3.1.8.
   2. وتتكاثر الصور BKD_FLAT و SM_MASK لإنتاج صورة موجبة قيم غير الصفر بكسل ترتبط مع جزيئات مفردة.
      1. للقيام بذلك، ضمن القائمة "عملية"، حدد "صورة الحاسبة..."، عملية "ضرب" والصور المطلوبة، ثم حدد مربعات "إنشاء إطار جديد" و "نتيجة 32-بت (عدد عشري)".
   3. مجموع كافة قيم كثافة بكسل عن طريق تحديد "تحليل" و "قياس"؛ ثم سيقدم إحصاءات موجزة للتحديد في إطار نتائج. القسمة على عدد الجزيئات واحدة الأصوات التي تم فرزها حسب الخطوة 3.1.8 لحساب متوسط كثافة كل جزيء واحد.
   4. لأي جسم ازدحام المكان، تحميل تحلل ما بعد الصورة المكتسبة وتتسطح مع صورة خلفية واضحة وفقا للخطوات 3.1.2 و 3.1.3.
   5. طرح كل بيكسل في الصورة مسطح 1 ("عملية > الرياضيات" وحدد "طرح..."، وحدد قيمة 1)
   6. حدد منطقة بكسل × 50 بكسل 50 في أي من زوايا الصورة 4 وقياس الانحراف المعياري بكثافة بكسل (σ). راجع الخطوة 3.1.5 للحصول على التفاصيل.
   7. إنشاء قناع صورة ثنائية عن طريق تعيين عتبة الصورة إلى 3σ وتعيين قيم كثافة البيكسل إلى الصفر أي كائنات ذات حجم أقل من 4 بكسل². للقيام بذلك، ضمن القائمة "تحليل"، حدد "تحليل الجزيئات" وتحديد حجم والتدوير.
   8. ضرب صورة بقعة الأرض جسم المزدحمة بقناع الصورة الثنائية.
      1. للقيام بذلك، ضمن القائمة "عملية"، حدد "صورة الحاسبة..."، عملية "ضرب" والصور المطلوبة، ثم حدد مربعات "إنشاء إطار جديد" و "نتيجة 32-بت (عدد عشري)".
   9. مجموع كثافة بكسل المتبقية عن طريق تحديد "تحليل" تليها "تدبير"؛ سيقدم إحصاءات موجزة للتحديد في إطار نتائج.
   10. تقسيم مجموع كثافة بكسل بكثافة جزيء واحد متوسط لحساب عدد جزيئات واحدة ملزمة على الفور المزدحمة.
3. منحنى المعايرة للقياس الكمي المطلق
   1. كرر القسمين 1 و 2 لتشكيل 10 قطرات عنونة nL مع جسم الكشف في حل ببسا 4% ارتفعت مع بروتين تركيز معلوم المؤتلف.
   2. تنفيذ سلسلة تركيز 10²-10⁷ البروتينات المؤتلف كل قطره باختلاف تركيز المعروف من البروتين المؤتلف، إضافة إلى الحل. من المستحسن للعمل من حيث عدد البروتينات الواحدة الحبرية لجعل البيانات خلية مفردة معايرة مباشرة.
   3. استخدام تركيز سلسلة البيانات في الخطوة 3.3.2 لمعايرة أي جزيء واحد بحساب كل بقعة لوفرة البروتين الواحد الحبرية، ووفرة البروتين تمديد كل خلية مفردة.

تم تحديد عدد نسخ البروتين القاعدي المطلقة p53 مع القرار خلية مفردة في القولون بشرية سرطان خلية خط، وتكون الخلايا. ونحن تثبت كيف يمكن أن تختلف على عدة أوامر من ضخامة التعبير p53 وتظهر علاقة إيجابية ضعيفة بين عدد نسخ البروتين وحجم الخلايا داخل السكان خلية يكون يستريح.

وتتشكل عنونة الحبرية [ميكروارس] عندما يتم الاستغناء عن مواقع بقعة جسم قطرات مائي وتوج مع النفط. هنا، دعم القطرات مقايسة بروتين p53 حساسة. هي صفت كوفيرسليبس مع بقع جسم القبض استخدام ميكروارايير اتصال ورقم pin. جسم التقاط p53 المضادة مأخوذ من مجموعة اختبار أليسا تجارية. وكانت ظروف الطباعة مثل أن كانت البقع القبض على حوالي 100 ميكرومتر في القطر بالتقاط أقصى سعة 6.2 ± 0.5 × 105 البروتينات كل بقعة. 32

يسمح استخدام المعزل الرهينة إلى ساترة كثافة أعلى من قطرات التي سيتم تشكيلها نظراً لأنه يحد من انتشار بجسم قريب التقاط بقع النفط. في كل بئر المعزل تتشكل قطرات قبل صرفها محلول مائي، الذي هو ثم توج بالنفط لمنع التبخر (الشكل 1A). يمكن الاستغناء عن كمية ضئيلة من النفط كاب الحبرية؛ ومع ذلك، أنها مفيدة الاستغناء عن مبلغ الذي يملأ كل المعزل جيدا تماما مثل من سطح النفط مسطحة للتصوير. عوازل هي أما تجارياً من مصادر أو بواسطة الليزر قطع ألواح اﻷكريليك. عوازل السيليكون هي الآبار قبل قطع متوفرة في مجموعة 4 × 6 (n = 24) ولكن يمكن تعديلها إلى مصفوفة 4 × 11 (ن = 44) استخدام لكمه جلدية خزعة أو ثقب متعددة. الليزر قطع المعزل في الشكل 1B يظهر صفيف من 100 بئر سداسية كل قطره قصوى مم 2.89 وفصل مركز إلى مركز 3.9 ملم وارتفاعه 0.5 مم. قد يتم تخزين القطرات وتبقى مستقرة لفترات طويلة من الوقت (لاحظ مدة تصل إلى 3 أشهر).

قطرات يتم إنشاؤها يدوياً باستخدام جهاز الصنع، الذي يترجم فوهة أنابيب متحدة مركز (الشكل 1)، التي يتم توصيلها إلى مضختين المحاقن (الشكل 1A). فوهة أنابيب متحدة المركز تتكون من السيليكا فوسيد الشعرية، الذي يوزع في مرحلة مائي، تتغذى من خلال مدة قصيرة من أنابيب نظرة خاطفة، الذي يوزع في مرحلة النفط. استخدام مجهر، تتم محاذاة الفوهة إلى بقعة جسم والمضخات أولاً أن تستغني عن محلول مائي متبوعاً مباشرة بالنفط (الشكل 1E، الخطوات 1-4). حالما يتم تشكيل قطرات كافة في ADM، ميكروينجيكتور وميكرومانيبولاتور (انظر الجدول للمواد) تستخدم لتحميل كل قطره مع خلية واحدة (الشكل 1). ميكروبيبيتي أن القبض على خلية من خزان للخلايا والاستغناء عن في أحد الآبار على الرقاقة وتترجم إلى معالجة تجميعية جيدا وثم اختراق النفط عملية النداء الموحد توصيل الخلية إلى الحبرية مائي (الشكل 1، الخطوات من 5-8).

يتم تصويرها قبل تحلل جميع المواقع داخل القطرات وسوف تستخدم لتحديد الدرجة غير محددة ملزمة للبقع (الشكل 2A). يتم تفكيك خلايا مفردة تماما (بما في ذلك نواة) استخدام وسائل بصرية. 31 تحلل البصرية تعتمد على قوة القص فقاعة التجويف المستحثة بنبض الليزر الآخذة في التوسع لتعطيل الخلايا. ويجب بذل العناية أن واجهة الزيت عن الماء لا يكون بانزعاج هذه العمليات التي تحد من طاقات نبض وإيداع الخلايا بعيداً عن الواجهة النفط والمياه. حالما يتم تفكيك الخلايا، الصفيف يتم تصويرها بالفحص المجهري TIRF استخدام مجهر الآلي؛ إطارات تكتسب كل 10 دقيقة و 30 دقيقة وبعد ذلك كل 20 دقيقة لزيادة 60 دقيقة. وشروط، مثل تقارب الأجسام المضادة والبروتين نشرها وحجم التجميعية، وأن الربط التوازن الذي تم التوصل إليه في الحصول على 90 دقيقة. نموذجي وحيد خلية المنسدلة يرد في الشكل 2 ألف.

عملية تحليل الصور لتحديد التهم جزيء واحد يرد تخطيطياً في الشكل 2. صور بقع أما تعتبر غير مزدحمة، حيث تركيز البروتين المستهدف أن هذه الجزيئات واحدة أيضا فصل وتمييزها بسهولة، أو مزدحمة، حيث تركيز البروتين المستهدف هو جزيء أعلى وواحدة من الصور التداخل، وهي لم تعد فردية مميزة. منذ الشخصية الإثارة TIRF غير متساوية، من الأهمية بمكان أن كل ما اكتسبت الصور تكون مسطحة-حقل تصحيح. يتم تطبيق طمس غاوسي إلى إطار غير مزدحمة، الذي يعمل بمثابة عامل تصفية تجانس لإزالة من التفصيل، والضوضاء، وإنتاج صورة مع صورة الشخصية الإثارة TIRF متوسط. يمكن استخدام هذه الصورة المجهزة 'تسوية' الصورة الأصلية. للصور غير مزدحمة، وفيها، حتى في التوازن، وهناك جزيئات مفردة قليلة، قد تتم معالجة إطار لتصحيح نفسها. هذا النهج لا ينطبق على بقعة مزدحمة، حيث تشغل جزيئات مفردة كثيفة الفور، ويتطلب صورة خلفية الحصول عليها للتسوية. إطارات مسطح ثم ثريشولديد لوحدات البكسل بكثافة على الأقل 3 مرات الانحراف المعياري الخلفية بالإضافة إلى قيمته يعني. جزيئات مفردة ثم الكشف عن تلقائياً عن طريق تحديد 4-9 بكسل متفاوت المسافات مع تدوير أكبر من 0.5 باستخدام ميزات "تحليل الجسيمات" من فيجي. من النتائج، قد يكون حساب متوسط كثافة جزيء واحد. يتم استخدامه لتحديد عدد جزيئات مفردة على بقعة مكتظة بقسمة كثافة جسم مجموع بقعة بكثافة متوسط المعروفة من جزيء واحد. هذه الخطوات قد تكون تلقائية استخدام محرر البرامج النصية في فيجي.

يتم تنفيذ سلسلة تركيز لتحديد عدد جزيء واحد في التوازن في القطرات مع تركيزات المعروف من البروتين p53 المؤتلف (الشكل 3A). الشروط أن البقع جسم التقاط التقاط جزء صغير من البروتين الهدف الإجمالي، ما يقرب من 1 في المائة في منطقة الخطي (5-10 108 البروتينات كل قطره R2 = 0.99). مستوى الربط غير محددة في القطرات من جزيئات 60 ± 187. قد يتم تحويل نتائج بولدوونس خلية واحدة ثم تحقيق توزيع عدد نسخ البروتين المطلق كل خلية. يبين الشكل 3B توزيع تعبير البروتين p53 المطلق في واحدة تكون الخلايا باستخدام ADMs. تعبير البروتين P53 في تكون الخلايا، الذي يمكن أن يفترض أن يكون وراثيا متماثلة أو متشابهة جداً، عملية عشوائية. يتم التوزيع غاما-مثل-غير متماثلة والواسطة مع ذيل طويل. ونتيجة لذلك، يعني (1.82 × 106 البروتينات) يمكن أن نبالغ في تقدير وفرة البروتين مشروط (بن 0-5.0 البروتينات5 × 10)، والانحراف المعياري (1.88 البروتينات6 × 10) لا تماما التقاط ملامح التوزيع. هذا التوزيع هو مثال على أهمية القياسات خلية واحدة لالتقاط تباين التعبير البروتين في السكان الخلية، وإلا سيتم فقدان عند حساب متوسط مع القياسات الأكبر. ويمكن قياس معلمات إضافية لكل خلية. هنا، يقدر حجم الخلية بقياس كل قطر الخلية قبل تحلل في الحبرية وافتراض الخلية كروية تقريبا. ويبين الشكل 3 مقارنة لعدد النسخ المطلق البروتين p53 في واحدة وتكون الخلايا كدالة لحجم الخلية. وهناك ميل لخلايا أكبر عدد نسخ p53 مجموع أعلى. من المثير للاهتمام، فمن الممكن من التوزيع أن هناك تنسيق بين التعبير p53 وحجم الخلية حيث يبدو أن هناك عدة نسخ p53 الحد أدنى كل خلية؛ إلا أن الآليات التي تنشأ وهذا يتطلب المزيد من التحقيق.

رقم 1: جهاز ميكرواري الحبرية عنونة ورقاقة. () قطرات يتم الاستغناء عن يدوياً باستخدام مناور 3-محور لترجمة فوهة أنابيب متحدة مركز. يتم الاستغناء عن الحبرية مائي في مواقع محددة في ميكرواري جسم متبوعاً بوضع سقف للنفط. (ب) المعزل تمكن كثافة أعلى من قطرات عنونة على الركيزة بالحد من انتشار النفط. ويمكن إنتاج عوازل بالليزر قطع ألواح اﻷكريليك 0.5 مم. للمساعدة في تصور القطرات، الأزرق وتودع الغذاء تلوين صبغ استخدام الجهاز في). تغيير حجم شريط 10 مم، مقياس اقحم شريط 1 مم-(ج) فوهة أنابيب متحدة المركز يسمح قطرات سعته التي سيتم تشكيلها، تجميعها كما في الخطوة 1، 2 من البروتوكول. (د) ميكروينجيكتور وميكرومانيبولاتور تستخدم لعزل الخلايا إلى قطرات عنونة فردية، أعد كما في الخطوة 1، 3 من البروتوكول. (ه) ويبين الخطوات الرئيسية عملية إنشاء وتحميل قطرات عنونة. بقعة جسم يقع استخدام مرحلة ترجمة مرمز (1) حيث يتم محاذاة غيض الأنابيب الشعرية (2) ويتم الاستغناء عن مائي (3) ثم النفط (4) المكونات. الخلايا المفردة قد تكون محملة باستخدام زجاج ميكروكابيلاري (5-8)، التي يمكن معالجة الحبرية مائي (7) مرارا وتكرارا وإيداع خلية (8). تغيير حجم أشرطة 100 ميكرومتر. السهم الأحمر في (5) و (8) يسلط الضوء على خلية مفردة معزولة واقحم (8) يوضح خلية مفردة معزولة في تضخم عالية (مقياس بار 10 ميكرومتر). تم تعديل أجزاء من هذا الشكل من مرجع12، أعيد نشرها بإذن من "المجتمع الملكي للكيمياء". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

رقم 2: صورة خطوات التحليل. دورياً كل بقعة في الصفيف هو تصويرها بالمجهر TIRF حتى يتم التوصل إلى توازن (طنمكافئ) (90 دقيقة للمقايسة p53). يعتمد الوقت التوازن على تي في الحل، فضلا عن الصلات لزوج الأجسام المضادة للبروتين المستهدفة. أ) مثال جزيء واحد TIRF المجهري صور الخلفية، فضلا عن مثال وحيد خلية المنسدلة (مقياس أشرطة 20 ميكرومتر). تظهر الصورة اقحم تضخيم جزء من صورة الخلفية مع بعض جزيئات واحد أبرز الأسهم الحمراء (مقياس بار 5 ميكرومترات). ب) الخطوط العريضة لتحليل الصور المفصلة في الخطوة 3 من البروتوكول. بإيجاز، هناك نظامين واسعة حيث يمكن اعتبار البقع الجزيئات غير مزدحمة، وواحدة متفرقة، والمزدحمة، حيث كثافة الجزيئات واحد أن هناك تداخل كبير، وربما لم يعد يمكن التعرف عليها منفردة. خطوة حاسمة في تحليل الصور هو ميدان التسوية لإزالة تأثير الشخصية الكثافة غير موحدة من الليزر الإثارة. في نظام العد الرقمي، يتم تحديد الجزيئات واحدة مباشرة، استناداً إلى المعلمات كثافة والشكل. في التناظرية عد النظام، يحسب عدد الجزيئات واحدة بقياس كثافة بقعة المجموع في التوازن وقسمة متوسط كثافة جزيء واحد، مما هو معروف من أن نظام عد الأصوات الرقمية. قد تكون خطوات تلقائية مستقيم في إيماجيج لتحليل البيانات. يظهر أسفل لوحة تسلسل الصور تراكم البروتين المستهدف في القبض على جسم بقعة؛ في البداية، ليست البقع المزدحمة (تي1) بينما كما يتراكم البروتين المستهدف على الفور جسم، الجزيئات واحدة يمكن أن يزداد ازدحاما (تين) حتى يتم التوصل إلى توازن (طنمكافئ). علما بأن ما إذا كنت بقعة ما زال غير مزدحمة أو يصبح مزدحمة يعتمد على عدد من العوامل، وبخاصة وفرة البروتين المستهدف في تحليل وحدة التخزين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: واحدة بيانات الخلية. ويتحقق القياس الكمي المطلق استخدام منحنى معايرة. () واحدة تهم جزيء يتم إجراؤها باستخدام تركيزات المعروف من البروتين المؤتلف. هذا هو منحنى معايرة ويستخدم لتحويل جزيء واحد تحسب في كل بقعة لعدد من البروتينات المستهدفة في وحدة التحليل وواحد وبالتالي عدد نسخ الخلايا. خط متقطع أحمر أفقي يشير إلى مستوى الربط غير محددة من الجزيئات 60 ± 187. أشرطة الخطأ تدير واحدة من الانحراف المعياري لمتوسط 3 التجريبية. خط متقطع يمثل الكشف عن 100 ٪ من البروتين. (ب) توزيع p53 القاعدية خلية مفردة التعبير البروتين في الخلايا السرطانية وتكون يرد عرض توزيع غاما تشبه الذيل طويلة حيث التعبير البروتين p53 في بعض الخلايا أعلى بكثير من القيمة الشكلية. (ج) مبعثر مؤامرة من البروتين p53 نسخ عدد كل خلية كدالة لحجم الخلية التي تظهر كيف يختلف التعبير البروتين كدالة لحجم الخلية. وقد تم تعديل من 12 أجزاء من هذا الرقم وتتكرر مع إذن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.