Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Jos&#233; M. Mateos; Gery Barmettler; Jana Doehner; Irene Ojeda Naharros; Bruno Guhl; Stephan C.F. Neuhauss; Andres Kaech; Ruxandra Bachmann-Gagescu; Urs Ziegler

doi:10.3791/56113

Research Article

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد

November 10, 2017

José M. Mateos¹, Gery Barmettler¹, Jana Doehner¹, Irene Ojeda Naharros², Bruno Guhl¹, Stephan C.F. Neuhauss², Andres Kaech¹, Ruxandra Bachmann-Gagescu^2,3, Urs Ziegler¹

¹Center for Microscopy and Image Analysis,University of Zurich, ²Institute for Molecular Life Sciences,University of Zurich, ³Institute for Medical Genetics,University of Zurich

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

ويصف هذا البروتوكول الخطوات اللازمة للحصول على نتائج التعريب سوبسيلولار البروتين في الشبكية الزرد بربط القرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب ومسح صور المجهر الإلكتروني.

Abstract

نحن نقدم طريقة للتحقيق التعريب سوبسيلولار البروتين في الشبكية الزرد اليرقات بالجمع بين القرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب وفحص المجهر الإلكتروني. قدرات القرار الحد حيود الفرعية مجاهر الخفيفة فائقة القرار السماح بتحسين دقة البيانات المرتبطة. بإيجاز، 110 نانومتر سميكة البرد، أقسام يتم نقلها إلى رقاقة سيليكون، وبعد الفلورة تلطيخ، يتم تصويرها بالقرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب. وفي وقت لاحق، يتم الحفاظ على المقاطع في ميثيلسيلولوسي والبلاتين مظلل قبل التصوير في المسح الإلكتروني المجهري (SEM). يتم دمج الصور من هذه الطرائق مجهرية اثنين بسهولة باستخدام معالم النسيج مع برمجيات المصدر المفتوح. هنا يصف لنا طريقة تكيف الشبكية الزرد اليرقات. ومع ذلك، هذا الأسلوب ينطبق أيضا على أنواع أخرى من الأنسجة والكائنات الحية. ونحن تبين أن المعلومات التكميلية التي حصلت عليها هذه العلاقة قادراً على حل تعبير البروتينات المتقدرية في علاقة مع الأغشية وكريستاي الميتوكوندريا، وكذلك فيما يتعلق بالأقسام الأخرى من الخلية.

Introduction

أساليب لتحديد الترجمة سوبسيلولار للبروتينات وعلاقتها بالأقسام المختلفة للخلية أدوات أساسية لفهم الوظائف والتفاعلات المحتملة. مجهرية فائقة القرار في تركيبة مع الميكروسكوب الإلكتروني يوفر هذه المعلومات¹. أرض الدولة نضوب مجهرية تليها عودة جزيء فردية (جسديم) هو تقنية مجهرية فائقة قرار متوافقة مع مجموعة واسعة من فلوروفوريس العضوية ومُرمّز وراثيا² ويحقق قرارا أفقي بما يصل إلى 20 nm ³-إدماج أساليب مع دقة أعلى من معيار حيود محدودة مجهرية يحسن دقة⁵^،^،من⁴الارتباط⁶. ينصح من أجل تحقيق ترابط أفضل من تعبير البروتين مع حجرة سوبسيلولار محددة وتقليص حجم عدم اليقين⁷ استخدام نفس المقطع سامسونج للضوء والمجهر الإلكتروني. بين أساليب تقطيع مختلفة، توكوياسو البرد-قسم البروتوكول لا يتطلب الجفاف أو الراتنج التضمين، بالإضافة إلى ذلك، يحافظ على أنتيجينيسيتي من كثير من [ابيتوبس] ويوفر الأنسجة جيدة أولتراستروكتوري⁸. وقد أثبتت عدة طرق انطباق هذه الأقسام في ضوء الارتباطية والمجهر الإلكتروني (كليم)⁴^،⁵^،^،من⁹¹⁰.

الشبكية الزرد نموذجا قيماً لدراسة التنمية البصرية وآليات المرض البشري نظراً لهيكلها عاليا المصانة ووظيفة عبر الفقاريات. في عرض فوتوريسيبتورس الشبكية وخاصة نفس بنية ك photoreceptors الثدييات، مع المشبك القاعدية، نواة أبيكو بأسالي ممدود، تجميع الميتوكوندريا في الجزء الداخلي قمي أكثر وجزء خارجي يتكون من الغشاء الأقراص في موقف آخر قمي¹¹. الترجمة البروتين إلى المقصورات الخلوية المتنوعة المصانة بين الزرد والبشرية، مما يتيح تحقيق الوظيفة البيولوجية للبروتينات ذات الصلة بالمرض البشري¹²^،¹³.

نقدم هنا بروتوكولا لإعداد اليرقات الزرد عينات الشبكية لحل تعريب البروتين المتقدرية الغشاء الخارجي Tom20 بالقرار فائقة الارتباطية الضوء والمجهر الإلكتروني. الأسلوب الذي يستند إلى جمع المقاطع البرد على رقائق السيليكون والحصول على تباين المعلومات الطوبوغرافية التي أنتجت بعد تطبيق طبقة رقيقة من البلاتين. هذه الخطوات تحسينات فنية واضحة من حيث سهولة الاستخدام وإمكانية تكرار نتائج، والوقت لإكمال التجارب. قد أظهرنا مؤخرا إمكانية تطبيق أسلوب للكشف عن المسام النووية والبروتينات المتقدرية في الماوس الأنسجة¹⁴.

Protocol

جميع التجارب التي أجريت وفقا "بيان آرفو" "استخدام الحيوانات" في أوفثالميك وأبحاث الرؤية ووافقت عليها السلطات المحلية-

1. "إعداد المقاطع سامسونج" على "رقائق السليكون"

تثبيت عينة

1. إعداد الحل مثبت يحتوي على 0.1% جلوتارالديهيدي، 4% فورمالدهايد في المخزن المؤقت كاكوديلاتي 0.1 م.
  ملاحظة: تنبيه! توخي الحذر عند العمل مع المخزن المؤقت glutaraldehyde، والفورمالديهايد، وكاكوديلاتي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والعمل في غطاء دخان.
2. Euthanize 5 أيام بعد الإخصاب اليرقات الزرد (5 إدارة الشرطة الاتحادية) مع تريكيني (إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي، 0.4% w/v في برنامج تلفزيوني (الفوسفات المخزن المؤقت المالحة، pH 7)) كما هو موضح سابقا ¹⁵-
3. اليرقات بالانغماس في الحل مثبت مسبقاً مبردة على الثلج. قم بإزالة الرأس واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف.
4. العينين بقطع الأنسجة حول العين باستخدام الملقط غرامة ومشرط ميكروديسيكشن (تحت مجهر) في برود الحل مثبت على لوحة أسرة [اغروس] 1%. نقل العينين إلى أنبوب مع مثبت مسبقاً المبردة الطازجة.
5. تغسل مرتين في برنامج تلفزيوني (الفوسفات المخزن المؤقت المالحة، درجة الحموضة 7.4) لمدة 5 دقائق كل يغسل في درجة حرارة الغرفة (RT).
تسلل الجيلاتين وتصاعد
1. الاحماء 15 مل الأغذية المحلية ماركة الجيلاتين 12% w/v في الجريدة الرسمية (العازلة الفوسفات، 0.1 M درجة الحموضة 7.4) في 40 ° C. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة حل الجيلاتين بالأنابيب التي تحتوي على العيون. اضغط على أنبوب بلطف لضمان تتسرب الجيلاتين العينة واحتضان لمدة 10-30 دقيقة عند 40 درجة مئوية في ثيرموبلوك مع الهز لطيف أو في حمام مائي.
2. ملء 12 مم × 5 مم × 3 مم أو البولي إثيلين شقة تضمين قوالب مع الجيلاتين الدافئ في حمام مائي 40 درجة مئوية. إضافة عيون اثنين كل قالب باستخدام ماصة محاذاتها بشكل صحيح تحت مجهر استخدام إبرة تشريح واسمحوا الجيلاتين يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة وتتصلب عند 4 درجة مئوية عن 20 دقيقة
3. إعادة تقليم كتلة الجيلاتين تحت مجهر لتناسب عين واحدة كل كتلة باستخدام شفرة حلاقة.
4. عيون الجيلاتين مضمن إلى 2.3 متر السكروز في الجريدة الرسمية على الجليد. احتضان عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
5. تبادل جديد محلول السكروز 2.3 متر ومخزن في 4 درجات مئوية أو-20 درجة مئوية؛ وبعد هذه الخطوة، مستعدون لتقطيع عينات أو يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع إلى أشهر.
6. كتلة الجيلاتين تقريبا حجم العين قبل نقل للبرد-pin. التجميد في النيتروجين السائل ونقل إلى cryo-أولتراميكروتومي-
كريوسيكتيونينج
1. 110 قطع نانومتر سميكة-المقاطع في-120 درجة مئوية بسكين الماس في cryo-أولتراميكروتومي-
2. اختيار الأقسام مع حلقة سلكية التي تتضمن معالجة تجميعية methylcellulose 2% (في المياه) ومحلول السكروز 2.3 متر (1:1). نقل المقاطع إلى رقاقة سيليكون 7 ملم × 7 ملم. تخزين المقاطع في 4 درجات مئوية حتى مزيد من المعالجة.

2. إيمونولابيلينج

المياه والصرف الصحي ويفر مع برنامج تلفزيوني في 0 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة في أربع قطرات بوضع الرقائق رأسا على القطرات. أغسل في برنامج تلفزيوني 2 × 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
احتضان 3 مرات في جليكاين 0.15% في برنامج تلفزيوني، لكل 1 دقيقة. أغسل x 3 ل 1 دقيقة/يغسل مع برنامج تلفزيوني. قبل إينكوباتي مع PBG (برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة ألبومين المصل البقري 0.5% و 0.2 ٪ الجيلاتين نوع ب) للحد الأدنى 5
إينكوباتي مع أرنب المضادة-Tom20 (انظر الجدول للمواد) في PBG (4 ميكروغرام/مل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
x 6 ل 1 دقيقة/يغسل في PBG. قبل إينكوباتي مع PBG لمدة 5 دقائق في الرايت إينكوباتي مع أرنب المضادة F(ab') 647 أليكسا ₂ (انظر الجدول للمواد) في PBG (7.5 ميكروغرام/مل) للحد الأدنى 30
x 6 ل 1 دقيقة/يغسل في PBG. أغسل 3 × 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني. احتضان مع DAPI (4 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني لمدة 10 س. يغسل 2 × 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني.

3. مجهرية فائقة القرار

إينكوباتي ويفر بإيجاز (10 ق) قبل وضعه على معالجة تجميعية لحل 1:1 من الجلسرين (80%)، والتصوير مخزن يحتوي على أكسجين مسح النظام (200 ملم الفوسفات مخزن يحتوي على الجلوكوز 10 ٪، 0.5 ملغ/مل جلوكوسيوكسيداسي، 40 ميكروغرام/مل الكاتالاز، 15 ملم بيتا-ميركابتوثيلاميني هيدروكلوريد (شركة طيران الشرق الأوسط HCL)، الرقم الهيدروجيني 8.0).
نقل الرقائق (الباب إلى الأسفل) إلى طبق بتري (سمك 170 ± 5 ميكرومتر) أسفل زجاج على قطره جديدة من 1:1 خليط من الجلسرين (80 في المائة) والتصوير المخزن المؤقت (كما هو الحال في الخطوة 3، 1)-
من جميع الأطراف، مع ماصة، معظم السائل تحت يفر. استخدم شرائط السيليكون لإصلاح يفر إلى الجزء السفلي من صحن بيتري.
ملاحظة: شرائط السيليكون مصنوعة من السيليكون المكون الثاني-الغراء (3 ملم × 12 ملم)-
الصورة في مجهر مقلوب استخدام فتحه عددية عالية (مثلاً 160 X/1.43 غ؛ انظر الجدول للمواد) زيت الغمر القرار سوبر الهدف مكرسة. قبل التصوير، واسمحوا العينة حجته إلى درجة حرارة المجهر بغية التقليل إلى الحد الأدنى/الحد من الانجراف الأفقي والمحوري.
مركز مجال الاهتمام والحصول على الصور مرجع ابيفلوريسسينسي ويديفيلد الأولى. تغيير وضع عملية القرار سوبر. ضبط وقت التعرض للكاميرا إلى 15 مللي ثانية وتعيين الإلكترون ضرب مكسب (م) إلى الحد أقصى 300-
تضيء العينة مع 642 نانومتر الليزر موجات مستمرة في طاقة الليزر الحد الأقصى (يقابل ~2.8 كيلو واط/سم ²) في وضع ابيفلوريسسينسي. يتم فصل أقرب جزيء واحد يومض في كل إطار، جيدا حيث أن الاحتمال ضعيف أن الإشارات الفردية التداخل، تعيين قوة الليزر إلى ~0.7 كيلو واط/سم ². سجل في الصورة الخام في وضع ابيفلوريسسينسي بالحصول على الحد ني إطارات 30,000.
ملاحظة: جميع هذه المعلمة يمكن أن تختلف تبعاً للعينات المختلفة وتصنيف الكثافات.
من البيانات الخام، وإنشاء قائمة أحداث تعمير (تعريب كل غمضة جزيء واحد في الصورة الخام) باستخدام عتبة كشف من 30 الفوتونات (يحتاج تعديلها وفقا للعينة) بواسطة النقر فوق " تقييم " في ' تي سلسلة تحليل ' تحت ' أدوات '-
تصور صورة ذات دقة فائقة بتركيب غاوسي ¹⁶ تطبيق حجم بكسل تقديم من 4 شمال البحر الأبيض المتوسط عن طريق النقر فوق " "إنشاء صورة" " في ' الحدث قائمة تجهيز الفريق ' تحت ' أدوات. '
ملاحظة: لتوليد صورة فائقة حل استخدمت أدوات البرمجيات المتكاملة للنظام المستخدم في هذه الدراسة. ومع ذلك، تصوير وصف القرار سوبر يمكن أداؤها في أي نظام آخر في الترجمة على أساس جزيء واحد، ويمكن معالجة البيانات باستخدام أدوات البرمجيات المفتوحة المصدر كعاصفة رعدية ¹⁷-

4. Shadowing البلاتين

إزالة السليكون المشارب وإضافة قطره من برنامج تلفزيوني قريبة من حواف يفر أرفع من طبق بيتري. أغسل يفر 2 × 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني، ثم بعد إصلاحه مع جلوتارالديهيدي 0.1% في برنامج تلفزيوني للحد الأدنى 5 يغسل x 2 ل 2 دقيقة/يغسل في برنامج تلفزيوني.
احتضان يفر مرتين ل 5 دقيقة/حضانة في قطره 1 ميثيلسيلولوسي 2% في المياه على الجليد. إدراج يفر في أنبوب الطرد والطرد المركزي في 14,100 س ز 90 جبل س. في كعب روتين ألومنيوم SEM مع إجراء الأسمنت الكربون.
إضافة طبقة من 2 إلى 10 نانومتر من البلاتين/الكربون في العينة بالتظليل الروتاري في 8° استخدام إلكترون شعاع إعدادات الجهاز التبخر: 1.55 كيلوفولت، 55 mA، 0.3 نانومتر/s، وزاوية مقدارها 8 درجة، تناوب المستوى 4.

5. المسح الضوئي المجهر الإلكتروني

أقسام الصورة مع المسح الإلكترون mإيكروسكوبي 1.5 كيلو فولت، 2 مم تعمل عن بعد ومع In عدسة كاشف الإلكترونات الثانوية-

6. المحاذاة من الضوء وصور المجهر الإلكتروني

فتح كل أنواع الصور مع فيجي ¹⁸ بواسطة النقر فوق " الملف | فتح ". ضبط حجم قماش بواسطة النقر فوق " صورة | ضبط | قماش حجم " وجلب كل الصور إلى كدسة بالنقر فوق " صورة | مكدسات | الصور إلى كومة ". حفظ المكدس كنوع ملف tiff.
"في فيجي"، واجهة ¹⁹ TrackEM2 جديدة بواسطة النقر فوق " الملف | جديد | TrackEM2 (جديد) ". استيراد المكدس مع كل الصور بالنقر على الحق في النافذة السوداء وتحديد " المكدس استيراد "-
الضوء محاذاة صورة الميكروسكوب الإلكتروني يدوياً مع المعالم باستخدام نقر بماوس الأيمن على الصورة واختيار " محاذاة | قم بمحاذاة طبقة يدوياً مع المعالم ". أداة
1. بيك حدد (السهم الأسود) لإضافة المعالم. استخدم شكل نويات كمرجع لتحديد حواف نفسها في كلا الصورتين (تكميلية الشكل 1). إضافة عدة نقاط (الحد الأدنى ثلاث نقاط بحاجة إلى تحديد). تطبيق المحاذاة مع طراز أفيني بالماوس الأيمن النقر، وتحديد " تطبيق تحويل | نموذج أفيني ".
تغيير طبقة الشفافية (انظر التكميلية الرقم 1) لتقييم نوعية المحاذاة.

Representative Results

التعبير عن البروتين Tom20، وحدة فرعية من ترانسلوكاسي الغشاء الخارجي المتقدرية معقدة من20، مصممة، في أقسام رقيقة من الزرد اليرقات الشبكية، بقرار سوبر الخفيفة الميكروسكوب (الشكل 1)، وهذه المعلومات كان ويكمل مع الإشارات الطوبوغرافية التي تم الحصول عليها عن طريق مسح المجهر الإلكتروني بعد التظليل البلاتين من نفس المقاطع. هذه البيانات الارتباطية تأكيد التعريب من البروتين في الرابطة مع حجرة خاصة، الغشاء الخارجي المتقدرية، وعلاوة على ذلك توفر معلومات حول العلاقة بين البروتين مع العضيات الأخرى للخلية.

رقم 1: كليم في الشبكية الزرد. ألف صورة ويديفيلد التكبير المنخفض قسم الشبكية الزرد 5 إدارة الشرطة الاتحادية، نوى ملطخة DAPI (السماوي). ب فحص المجهر الإلكتروني من نفس المنطقة. جيم أعلى الصورة ويديفيلد التكبير للإطار في "نويات باء" ملطخة DAPI (سماوي) وتلطيخ المتقدرية Tom20 يظهر باللون الأحمر. دال صورة ويديفيلد من نفس الفرع في أعلى التكبير. النمط التعبير Tom20 في مجموعات الميتوكوندريا. هاء التعبير من Tom20 (نقاط حمراء) الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري جسديم. الملون الأنوية مع DAPI (السماوي). واو نفس القسم هاء الجمع بين قرار فائقة الارتباطية والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني. تلوين Tom20 (نقاط حمراء) يظهر في الكتلة المتقدرية (M) في أغشية الميتوكوندريا الخارجي. إشارة DAPI الأسفار في النوى (ن) يتوافق مع طبوغرافية الصورة SEM. ز-صورة عالية التكبير من الإطار في واو. مسح الصورة الميكروسكوب الإلكتروني يوفر سياقا للصورة جسديم (نقاط حمراء). Mitochondrial cristae واضحة للعيان وتلطيخ Tom20 مترجمة إلى أغشية الميتوكوندريا الخارجي. الأغشية للجزء الخارجي فوتوريسيبتورس (OS) مصممون الواضح. الصورة بكسل حجم 5 نانومتر. تغيير حجم أشرطة: ألف وباء، وجيم: 10 ميكرومتر؛ D: 2 ميكرومتر؛ هاء وواو: 1 ميكرومتر وزاي: 0.2 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

التكميلية الرقم 1: محاذاة الصور الضوء والمجهر الإلكتروني. أ. لقطة من واجهة TrackEM2 مع الصورة ووزارة شؤون المرأة ومعالم مرقمة (أصفر) على طول نوى مختلفة. ب-الصورة من واجهة TrackEM2 مع الصورة الفلورية ومعالم مرقمة (أصفر) على طول DAPI مختلفة الملون الأنوية. لتغيير شفافية طبقة يمكن استخدام مربعات التمرير في الجزء العلوي الأيسر من القائمة. شريط مقياس: 1 ميكرومتر. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Disclosures

Acknowledgements

التمويل أيون و RGB: منح العلوم الوطنية السويسرية مؤسسة أمبيزيوني نقاط PZ00P3 142404/1 و PZ00P3 163979.

Materials

بارافورمالدهايد	سيجما ألدريتش	# 158127
جلوتارالديهايد EM الصف	EMS ، الولايات المتحدة الأمريكية	# 16220
Cacodylate	Merck	# 8.20670
Tricaine	Sigma-Aldrich	# 886-86-2
Agarose ، peqGOLD Universal	VWR International GmbH	35-1020
قوالب تضمين	مسطحةBEEM Flat ماركة
محلية للأغذية الجيلاتين	Dr.Oetker	Extra Gold
Sucrose	Merck	# 1.07687
ميثيل السليلوز	سيجما	#M-6385
جلايسين	سيجما	#G-7126
جيلاتين من النوع B	سيجما	#G-6650
BSA	Applichem	#A6588.0050
رقاقة السيليكون	Si-Mat نوع مواد		السيليكون: ف / بورون. التوجيه < 111> على; طريقة النمو: تشيكوسلوفاكيا ؛ المقاومة: 1-30 أوم / سم ؛ سطح - المظهر الخارجي: مصقول. قطع بالليزر بحجم 7 × 7 مم
تحضير البلطيق بالتبريد		# 16701950
حلقة سلكية "حلقة مثالية"
خطوط سيليكون	Picodent	Twinsil 22
Glucose	Sigma-Aldrich	#G8270
جلوكوز أوكسيديز	سيجما ألدريتش	#G7141
كاتالاز	سيجما ألدريتش	#C40
بيتا ميركابتو إيثيل أمين هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش	#M6500
مضاد ل Tom20	سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية	#sc - 11415
AlexaFluor 647 AffiniPure F (ab') 2 جزء حمار مضاد للأرانب IgG	Jackson Immuno-Research	# 711-606-152
DAPI	ROCHE ، سويسرا	# 10236276001
الجلسرين الحل	Sigma-Aldrich	# 49782
طبق بتري ذاعان زجاجي	Ibidi ، ألمانيا	U-Dish 35mm ، قاع زجاجي عالي ، # 81158
SEM كعب الألومنيوم	Agar العلمي	#G301F
إجراء الأسمنت الكربوني Leit-C	Plano ، ألمانيا	AG3300
Name< / strong>	Company< / strong>	<قوي>رقم الكتالوج	<قوي>تعليقات
<قوي>الأدوات
سكين الماس (Cryo Immuno)	Diatome	DCIMM3520
Cryo-ultramicrotome	Leica Microsystems	Leica EM FCS
Widefield-TIRF المجهر GSD Leica SR GSD 3D	Leica Microsystems
160x 1.43 موضوعي TIRF	Leica Microsystems	11523048
SEM - Zeiss Supra 50 VP	Zeiss	Supra 50 VP
FIB-SEM - Zeiss Auriga 40	Zeiss	Auriga 40

References

Hauser, M., Wojcik, M., Kim, D., Mahmoudi, M., Li, W., Xu, K. Correlative Super-Resolution Microscopy: New Dimensions and New Opportunities. Chem Rev. , (2017).
Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
Fölling, J., Bossi, M., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
Betzig, E., Patterson, G. H., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science (New York, N.Y.). 313 (5793), 1642-1645 (2006).
Kopek, B. G., Shtengel, G., Grimm, J. B., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative photoactivated localization and scanning electron microscopy. PLOS one. 8 (10), e77209 (2013).
Paez-Segala, M. G., Sun, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
Narayan, K., Subramaniam, S. Focused ion beams in biology. Nat Methods. 12 (11), 1021-1031 (2015).
Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
Suleiman, H., Zhang, L., et al. Nanoscale protein architecture of the kidney glomerular basement membrane. eLife. 2, e01149 (2013).
Kopek, B. G., Shtengel, G., Xu, C. S., Clayton, D. A., Hess, H. F. Correlative 3D superresolution fluorescence and electron microscopy reveal the relationship of mitochondrial nucleoids to membranes. Proc Nat Acad Sci U S A. 109 (16), 6136-6141 (2012).
Avanesov, A., Malicki, J. Analysis of the retina in the zebrafish model. Methods Cell Biol. 100, 153-204 (2010).
Bachmann-Gagescu, R., Phelps, I. G., et al. The ciliopathy gene cc2d2a controls zebrafish photoreceptor outer segment development through a role in Rab8-dependent vesicle trafficking. Hum Mol Gen. 20 (20), 4041-4055 (2011).
Bachmann-Gagescu, R., Dona, M., et al. The Ciliopathy Protein CC2D2A Associates with NINL and Functions in RAB8-MICAL3-Regulated Vesicle Trafficking. PLOS Gen. 11 (10), e1005575 (2015).
Mateos, J. M., Guhl, B., et al. Topographic contrast of ultrathin cryo-sections for correlative super-resolution light and electron microscopy. Sci Rep. 6, 34062 (2016).
Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
Cardona, A., Saalfeld, S., et al. TrakEM2 software for neural circuit reconstruction. PLOS one. 7 (6), e38011 (2012).
Wurm, C. A., Neumann, D., et al. Nanoscale distribution of mitochondrial import receptor Tom20 is adjusted to cellular conditions and exhibits an inner-cellular gradient. Proc Nat Acad Sci U S A. 108 (33), 13546-13551 (2011).
Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Prot. 2 (10), 2480-2491 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

القرار فائقة الارتباطية والميكروسكوب الإلكتروني لحل التعريب البروتين في الشبكية الزرد