يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة

7.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56118

⸱

مارس 4, 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Aquaculture, Szent István University

في هذه المقالة

ملخص

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار التكرار الأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد.

الملخص

الاتجاهات الحالية في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية يؤدي إلى خلق الآلاف من خطوط جديدة في نموذج الكائنات الحية مما يؤدي إلى ضرورة اتباع أساليب جديدة للتخزين الأمن للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي التزجيج (يقول:) كريوبريسيرفي الخصيتين الزرد كله. تجميد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة من الخصيتين كله يقول: يوفر إمكانيات لتخزين الزرد الموارد الجينية، وخصوصا بعد زرع الأعضاء أنهم يمكن أن تنضج في الأمشاج الذكور والإناث على حد سواء. وقد اقتطعت الخصيتين، معلقة على إبرة الوخز بالإبر، اكويليبراتيد في اثنين من وسائط الإعلام كريوبروتيكتيفي (الحل الموازنة التي تحتوي على الميثانول 1.5 متر و 1.5 متر البروبيلين غليكول؛ والحل التزجيج المحتوية على م 3 ثنائي ميثيل سلفوكسيد و 3 م البروبيلين غليكول) وانخفضت إلى النيتروجين السائل. وقد استعد عينات في سلسلة من ثلاثة حلول الاحترار ما يترتب عليها. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي (1) عدم وجود المني بعد الهضم من حرارة الخصيتين مما يسهل التلاعب المتلقين للمعلومات؛ (2) فائقة السرعة التبريد تمكين الأمثل تعرض الأنسجة للنتروجين السائل ولتعظيم التبريد وخفض تركيز المطلوبة المنتجة، مما يقلل من سميتها؛ (3) متزامن تعرض الخصيتين عدة للمنتجة والنتروجين السائل؛ والتكرار (4) يتبين من الحصول على صلاحية فوق 50 في المائة في خمس سلالات مختلفة الزرد.

المقدمة

الاتجاهات الجديدة في مجال العلم والتكنولوجيا الحيوية أدت إلى خلق آلاف خطوط جديدة متحولة من الفئران و المورفولوجية، الزرد وغيرها من الأنواع التي تستخدم كنموذج الكائنات الحية في الطب الحيوي و العلوم الأخرى1. وعلاوة على ذلك، كما يتم تطوير التكنولوجيات الجديدة وتصبح متاحة، أرقام الأسطر متحولة اطراد زيادة2. وهذا يؤدي إلى ضرورة لتخزين آمنة للموارد الجينية خارج الممارسات المشتركة للحفاظ على تكاثر المستعمرات. للواسمات كأسلوب التي يمكن تخزينها في مكان أمن للموارد الجينية لفترة غير محددة من الوقت، يوفر مزايا عديدة مثل تمديد الموسم الإنجابية، تلتف الحاجة إلى صيانة مستمرة للأمهات، وهو أكثر تكلفة--و 2من كفاءة العمل.

بروتوكولات لتجميد الحيوانات المنوية خلال مدى عدة سنوات2،3،4 فرصة لنجاح تخزين المواد الوراثية الذكور الزرد. ومع ذلك، نعد من البيض أو الأجنة في الأسماك لم يتم ممكناً بفضل بنيتها المعقدة وكميات كبيرة من مادة الصفار. في الآونة الأخيرة، يقدم ممارسة زرع الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) أو الخلايا الجذعية سبيرماتوجونيال (SSCs) تجاوز لهذا الحاجز بتطوير وظيفي الحيوانات المنوية والبيض بعد زرع5. ولذلك، يقدم للواسمات SSCs أفقاً جديداً في حفظ الموارد الوراثية النادرة والقيمة.

على الرغم من أن نعد يوفر العديد من المزايا، بمعدل بطيء عملية تجميد يولد العديد من الشروط التي قد تؤدي إلى تلف الخلية2. وهذه تشمل تشكيل الجليد داخل الخلية وخارج الخلية، والجفاف، وسمية كريوبروتيكتانت وغيرها. أضرار الجليد داخل الخلية الخلايا، والجليد خارج الخلية قد يؤدي إلى سحق الميكانيكية للخلايا، في حين نشر المياه من الخلايا خلال معدل بطيء التجميد قد يؤدي إلى الجفاف6. في الآونة الأخيرة، تم تطبيق التزجيج كأسلوب الذي يمنع الآثار السلبية لتشكيل الجليد في تجميد الأسماك الأمشاج7،،من89. وهو يقدم أسلوب تبريد سريع جداً من خلالها تتحول وسائل الإعلام الداخلية والخارجية لدولة غير متبلور/زجاجي دون كريستاليزينج في الجليد7،10. وقد تجلى التزجيج ناجحة من أنسجة الخصية والمبيض في أنواع الطيور والثدييات10،11،12، مما فتح إمكانيات لتطبيقه في الأسماك، وكذلك.

في هذه الدراسة، نقدم الإجراء التزجيج (يقول:) إبرة مغمورة لنعد الخصيتين الزرد كله. علينا أن نظهر طريقة موثوقة لعزل الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة الزرد دون التلوث وعملية تجميد أن ينتج كميات عالية نسبيا من الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة مع وجود انخفاض للخلايا الأخرى، لا سيما من المني. على حد علمنا، هذا هو أول دراسة لإثبات بروتوكول تصور مفصل للتبريد السريع جداً للأسماك جوندال الأنسجة والخلايا germline الزرد. بالإضافة إلى ذلك، يظهر التكرار للأسلوب في خمس سلالات مختلفة الزرد: AB البرية نوع، كاسبر (روي--/--؛ الصدف-/-،) ليوبارد (ليوt1/t1) وفأسا [تيراغرام (vas::eGFP)] و Wilms الورم [تيراغرام (wt1b::eGFP 1)] خط المحورة وراثيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جميع الأساليب الموصوفة هنا أقرها "قانون رعاية الحيوان الهنغارية".

1-كاشف إعداد

  1. حلول الأسهم
    1. إعداد تريهالوسي م 1 بإضافة 0.378 ز من ثنائي هيدرات تريهالوسي إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.
    2. إعداد السكروز 1 م بإضافة ز 0.342 السكروز إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.
    3. تحضير 1 م حبيس بإضافة 0.238 ز حبيس إلى 1 مل من مزيج O. dH2جيدا حتى أنه يذوب تماما.
    4. إعداد 20 ملغ/مل كولاجيناز (290 ش/mg) بإضافة 100 مغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.
    5. إعداد التربسين 15 ملغ/مل (~ 10000 U/mg) بإضافة 75 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.
    6. إعداد 1 ملغ/مل الدناز أنا (~ 3000 يو/mg) بإضافة 5 ملغ إلى 5 مل من برنامج تلفزيوني. المزيج جيدا حتى يذوب عليه. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. اليكووت ميليلتر 50 إلى 0.2 مل PCR أنابيب وتجميد عند-20 درجة مئوية.
    7. إعداد 0.4% تريبان الأزرق بإضافة 40 مغ تريبان الأزرق إلى 10 مل من برنامج تلفزيوني. تصفية العقيمة من خلال 0.2 ميكرون المرشحات. 1 مل الكوة في أنابيب 1.5 مل.
    8. إعداد 200 مغ/لتر MS-222 (تريكيني الميثان المشبعة بالفلور أوكتين) بإضافة 200 مغ من مرض التصلب العصبي المتعدد-222 إلى 1 لتر من dH2ميكس O. جيدا حتى أنه يذوب تماما. بالإضافة إلى ذلك، المخزن المؤقت حل مرض التصلب العصبي المتعدد-222 مع بيكربونات الصوديوم للرقم الهيدروجيني محايدة من 7.0.
  2. حلول التزجيج
    1. إعداد الموازنة الحل (ES): إعداد 2 مل وفاق بخلط 121.5 ميليلتر من الميثانول (ميوه؛ 1.5 متر)، 220 ميليلتر من البروبيلين غليكول (PG؛ 1.5 متر)، 200 ميليلتر من FBS (10%)، 200 ميليلتر حل الأسهم تريهالوسي (0.1 M)، 50 ميليلتر حبيس حل الأسهم (25 مم) و 1208.5 ميليلتر من L-15 إلى 2 أنبوب مل.
    2. إعداد الحل التزجيج (مقابل): إعداد 2 مل مقابل بخلط 439 ميليلتر من PG (3 م)، 426 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (لي2حتى؛ م 3)، 200 ميليلتر FBS (10%)، 200 ميليلتر من حل تريهالوسي الأسهم (0.1 M)، 50 ميليلتر من هيبيس الأسهم والحل (25 مم) 685 ميليلتر من L-15 إلى أنبوب 2 مل.
  3. حلول للاحترار
    1. إعداد الحل الاحترار 1 (WS1): تعد 1.5 مل WS1 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 450 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (م 3) و 900 ميليلتر من L-15.
    2. إعداد الحل الاحترار 2 (WS2): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر من FBS (10%)، 150 ميليلتر من محلول السكروز الأسهم (1 م) و 1200 ميليلتر من L-15.
    3. إعداد الحل الاحترار 3 (WS3): تعد 1.5 مل WS2 في أنبوب 2 مل بخلط 150 ميليلتر FBS (10 في المائة) و 1350 ميليلتر من L-15.
  4. إعداد الحل الهضم: لكل عينة إعداد 500 ميليلتر من الحل الهضم بخلط 50 ميليلتر من حل الأسهم كولاجيناز (2 مغ/مل)، 50 ميليلتر من حل الأسهم التربسين (1.5 ملغ/مل)، 10 ميليلتر من الدناز أنا (20 ميكروغرام/مل) و 390 ميليلتر من L-15 في 2 مل أنبوب.
  5. الحصول على أدوات تشريح: مقص، ميكروسسيسورس، ملاقط، ملاقط المنحنى، والعلاج بوخز الإبر.

2-الخصيتين جمع

  1. Euthanize السمك بوضعه في طبق يحتوي على 200 مغ/لتر MS-222 (pH = 7). قبل المتابعة مع التشريح، تأكد من أن الخياشيم توقفت عن التحرك، وأن مالا يقل عن 10 دقيقة مرت منذ تلك اللحظة لضمان الموت بنقص.
  2. الجاف للأسماك طريق الربت عليه على منشفة ورقية ووضعها على جانبها الظهرية على حصيرة تشريح.
    1. أولاً قطع زعانف الحوض وصدري لتشريح أسهل.
    2. أفقياً قص الجلد على بطن السمك بين الزعانف الصدرية وقطع الجلد والعضلات الأساسية على طول البطن حتى الزعنفة الشرجية.
    3. فتح تجويف الجسم من الأسماك ودبوس الجدار الجسم الأيمن والأيسر إلى حصيرة تشريح مع الإبر.
      ملاحظة: توجد الخصيتين أعلاه الأجهزة الجهاز الهضمي على كلا جانبي المثانة السباحة (الشكل 1).
  3. لمنع التلوث، لا تأخذ بها أجهزة الجهاز الهضمي، ولكن بلطف دفعهم إلى جانب واحد وإزالة الخصية من الجانب الآخر. الخصيتين متصلاً بجدار الجسم حتى إزالتها بعناية وقطع الصفاق يربط طريق ميكروسسيسورس.
  4. بالإضافة إلى ذلك، من أجل منع التلوث، أولاً تعقيم الخصيتين قبل وضعها في الإيثانول 70% 2 ثانية، والمكان ثم لهم في L-15 على لوحة 96-جيدا على الجليد.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، الخصيتين نظيفة من الأنسجة الدهنية وكبير الأوعية الدموية تحت ستيريوميكروسكوبي الضبط

3. فائقة السرعة تبريد أنسجة الخصية

  1. اكتب الإبر مارك مع التسميات المناسبة تبعاً للنموذج وإعداد الموازنة (ES) وحلول التزجيج (مقابل).
  2. نقل الخصيتين صفيحة جيدا أكبر أو طبق ودبوس ثلاثة الخصيتين (أو أكثر تبعاً لحجم الإبرة) بإبرة الوخز بالإبر معقمة.
    1. أولاً ضع في الخصية على رأس الملاقط منحنية. ضع نقطة الإبرة في وسط الخصية وسحب بعناية في الخصية نحو الأعلى مع الملاقط.
    2. بعد ثقب في الخصية، اسحبه برفق صعودا نحو الأعلى من الإبرة. تأكد من الخصيتين مفصولة عن بعضها البعض، وأنها لم تسقط أو الانزلاق إلى أسفل.
    3. مكان شغل الإبر مع الخصيتين المثبتة في أنبوب 2 مل مع L-15 حتى التزجيج (في ˚C 25؛ التخزين ينبغي أن لا يتجاوز الوقت ح 1).
      ملاحظة: تعلق الخصيتين في الإبرة ينبغي أن يتم سريعاً إلى منع الخصيتين من الجفاف.
  3. نقل الإبرة مع الخصيتين إلى الحل الموازنة واحتضان لمدة 5 دقائق في 25˚C.
  4. تحويل الإبرة إلى الحل التزجيج واحتضان لمدة 30 ثانية في 25˚C.
  5. إزالة الإبرة من حل التزجيج، وتستوعب بسرعة ولطف الحل المتبقي من الأنسجة بمنشفة ورقية معقمة. توخي الحذر لتجنب الخصيتين التمسك بمنشفة ورقية أو السقوط.
  6. بسرعة ضع الإبرة في نيتروجين سائل يوضع في مربع الستايروفوم.
    ملاحظة: قم بهذه الخطوة بسرعة لتفادي التعرض للأنسجة لبخار النتروجين السائل. استخدام وحدات التخزين المنخفضة من النيتروجين السائل لمنع التلوث عبر العينات.
  7. الاحتفاظ الإبرة في النتروجين السائل في مربع الستايروفوم مغلقة لمدة 5-10 دقائق.
  8. بريكول كريوتوبي مل 4.5 فتح وبرنامجه في نفس مربع.
  9. بعد 5-10 دقيقة، نقل كل إبرة في كريوتوبي منفصلة تحت سطح النتروجين السائل وأغلق كريوتوبي.
    تنبيه: دائماً استخدام الملابس الواقية (مثل القفازات المعزولة) عند العمل مع النيتروجين السائل كما يمكن أن يؤدي التعرض لقضمة الصقيع الشديد.
  10. ضع كريوتوبي على عصا معدنية ثم ضعه في علبة cryobank في أسرع وقت ممكن. تخزين العينات في تخزين اسطوانة ديوار حتى استخدامها مرة أخرى.

4-الاحترار الداخلي

  1. الحارة إبرة كل على حدة. ينبغي أن تكون جميع الحلول الاحترار عند 25 درجة مئوية.
  2. فصل كريوتوبي من قصب معدنية ويغرق هو في النتروجين السائل المخزنة في مربع الستايروفوم.
  3. فتح في كريوتوبي في بخار النتروجين السائل (باستخدام الملقط) والإفراج عن الإبرة في النيتروجين السائل.
  4. نقل الإبرة سريعاً جداً في أول حل الاحترار واحتضان لمدة 1 دقيقة (عند 25 درجة مئوية). تأكد من نقل الإبرة بسرعة لمنع الاحترار في الهواء أثناء النقل.
  5. تحويل الإبرة إلى الحل الثاني الاحترار واحتضان لمدة 3 دقائق (عند 25 درجة مئوية).
  6. تحويل الإبرة إلى الحل الثالث الاحترار واحتضان لمدة 5 دقائق (عند 25 درجة مئوية).
  7. الإفراج عن الخصيتين من الإبرة بانزلاق لهم تخفيضها مع ملاقط منحنية. مكان كل الخصية حرارة منفردة في بئر منفصلة (96-جيدا لوحة) مليئة 250 ميليلتر من L-15 وتستكمل مع 10% FBS. تأكد من أن تتم تسمية الآبار وفقا للعينة. تبقى لوحة جيدا على الجليد حتى تكون درجة حرارة جميع العينات وحتى المزيد من العمل.

5-الأنسجة الهضم

  1. إعداد 500 ميليلتر من الحل الانفصال لكل عينة في أنابيب منفصلة 2 مل. قم بتسمية هذه الأنابيب وفقا للتعليمات البرمجية العينة. احتضان الحل الانفصال من استعداد لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. إضافة حرارة الأنسجة إلى الحل الهضم ومقطعة إلى قطع صغيرة بحركات مالا يقل عن 30 من مقص صغير.
  3. احتضان قطع الأنسجة على لوحة تهتز لمدة 90 دقيقة في 25 ˚C.
  4. إيقاف عملية الهضم عن طريق إضافة 400 ميليلتر من L-15 و 100 ميليلتر من FBS (10% FBS v/v). باختصار يهز الحل واحتضان لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. تصفية الحل التي تم الحصول عليها من خلال 50 ميكرون المرشحات في أنبوب 1.5 مل. قم بتسمية الأنابيب تبعاً لذلك.
  6. الطرد المركزي الحل التي تمت تصفيتها في ز × 200 لمدة 10 دقائق في 25 ˚C.
  7. بعناية إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 20 ميليلتر من L15 تكملة مع 10% FBS. يدوياً يهز الأنبوب حتى يذوب بيليه تماما. ستبقى على تعليق خلية على الجليد أو في 4 ˚C حتى استخدامها مرة أخرى.

6-استمرارية التقييم وخلية العد

  1. مزيج 5 ميليلتر من تعليق خلية وميليلتر 5 0.4% تريبان الأزرق الحل في أنبوب PCR مسماة مناسب 0.2 مل. في حالة استخدام أحجام مختلفة، تأكد من أن نسبة التخفيف من بقايا 1:1.
  2. احتضان هذا الوقف لمدة 1 إلى 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
  3. التحقق من صلاحية كل عينة في هيموسيتوميتير تحت المجهر.
  4. حساب عدد الخلايا الحية (أونستينيد قبل blue تريبان) في حقول 15. حساب إجمالي عدد الخلايا في 20 ميكرون من تعليق خلية. التعليق جاهز الآن لأي تطبيق من المتلقين للمعلومات.
    ملاحظة: عند تحسين الإجراءات المتعلقة بالأنواع الأخرى مع حجم الجسم أكبر، استخدام أجزاء الخصية من نفس الوزن. استخدام الخصيتين من فرد واحد لجميع المجموعات التجريبية بغية تجنب تقلب الفردية في النتائج. في حالة الزرد، ونحن قد استفادت الحقيقة أن اليسار والخصية اليمنى ينبغي أن تحتوي على عدد متساو (أو مشابهة جداً) من الخلايا الجرثومية13 (انظر نتائج الممثل). أبقى في الخصية اليسرى كعنصر تحكم بينما الشركة إنتاج/ارتفعت درجة حرارة الخصية اليمنى. تم حساب النسبة المئوية لبقاء عدد الخلايا المعزولة من الخصية الشركة إنتاج/تحسنت مقارنة بعدد الخلايا المعزولة من الخصية الطازجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في المتوسط، وعدد الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة معزولة عن الخصية الزرد طازجة واحدة تراوحت بين الخلايا 40,000 و 200 ألف حسب حجم الأسماك. عند هضم الخصيتين الزرد الطازجة في جميع سلالات 5، الخلايا الجرثومية المبكر لم تكن الخلايا فقط موجودة في تعليق خلية (الشكل 2). بجوار الخلايا الجرثومية في مرحلة مبكرة، والمنى عديدة عثر كذلك. من ناحية أخرى، كان هناك أقل بكثير المني بعد هضم cryopreserved الخصيتين. وأشار هذا إلى أن المني لا ينجون من هذا البروتوكول تبريد فائقة الس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وكان الغرض الرئيسي من هذه الدراسة التكيف مع الإبرة مغمورة الداخلي تبريد فائقة السرعة لأنواع الطيور والثدييات10،11،12 إلى تجميد الأسماك الخصية (الزرد كنموذج الكائن الحي). معظم الدراسات السابقة فيما يتعلق بتجميد الموارد الوراثية الزرد كانت تركز أساسا على تجميد الزرد الحيوانات المنوية2،،من34. ومع ذلك، لم توضع البروتوكولات لتجميد بويضات ناض...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

وأيده هذه الدراسة الوطنية للبحوث والتنمية والابتكار مكتب لهنغاريا (منحة 116912 ÁH)، مكتب التكلفة (الأغذية والزراعة تكلفة العمل FA1205: أكواجاميتي)، هونجاريكوم ستيبينديوم وبرنامج المنح الدراسية (المنح إلى ZM) والجديد المجرية الوطنية التميز بريدوكتورال زمالة (منحة كرونة إستونية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسائط Leibovitz (L-15)Sigma-AldrichL1518مكمل بمصل بقري الجنين L-glutamine
(FBS)Sigma-AldrichF9665
Tricaine methanesulfonate (MS-222)Sigma-AldrichE10521
HEPESSigma-AldrichH3375
SucroseAcros Organics57-50-1
تريهالوزأكروس أورجانيكس99-20-7ثنائي هيدرات
ميثانولرينال20740-0-08-65
بروبيلين جلايكولرينال08860-1-08-65
ثنائي ميثيل سلفوكسيدالأرانال00190-1-01-65
كولاجينازجيبكو9001-12-1
تربسينسيجما ألدريتشT8003
DNase IPanreac AppliChemA3778
Trypan blueSigma-AldrichT6146
محلول ملحي مخزن للفوسبات (PBS)Sigma-AldrichP4417لتحضير محلول 200 مل PBS
أقراص

المراجع

  1. Mazur, P., Leibo, S. P., Seidel, G. R. J. Cryopreservation of the germplasm of animals used in biological and medical research: Importance, impact, status, and future directions. Biol. Reprod. 78 (1), 2-12 (2008).
  2. Carmichael, C., Westerfield, M., Varga, Z. M. Cryopreservation and In Vitro Fertilization at the Zebrafish International Resource Center. Methods Mol. Biol. 546, 45-65 (2009).
  3. Yang, H., Carmichael, C., Varga, Z. M., Tiersch, T. R. Development of a simplified and standardized protocol with potential for high-throughput for sperm cryopreservation in zebrafish Danio rerio. Theriogenology. 68 (2), 128-136 (2007).
  4. Morris, J. P. IV, Berghmans, S., Zahrieh, D., Neuberg, D. S., Kanki, J. P., Look, A. T. Zebrafish sperm cryopreservation with N,N-dimethylacetamide. Biotechniques. 35 (5), 956-968 (2003).
  5. Yoshizaki, G., et al. Spermatogonial transplantation in fish: A novel method for the preservation of genetic resources. Comp. Biochem. Physiol. Part D: Genomics Proteomics. 6 (1), 55-61 (2011).
  6. Gao, D., Critser, J. K. Mechanisms of cryoinjury in living cells. ILAR J. 41 (4), 187-196 (2000).
  7. Asturiano, J. F., Cabrita, E., Horváth, Á Progress, challenges and perspectives on fish gamete cryopreservation: A mini-review. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 69-76 (2017).
  8. Kása, E., et al. Development of sperm vitrification protocols for freshwater fish (Eurasian perch, Perca fluviatilis) and marine fish (European eel, Anguilla anguilla). Gen. Comp. Endocrinol. 245, 102-107 (2017).
  9. Cuevas-Uribe, R., Leibo, S. P., Daly, J., Tiersch, T. R. Production of channel catfish with sperm cryopreserved by rapid non-equilibrium cooling. Cryobiology. 63 (3), 186-197 (2011).
  10. Wang, Y., Xiao, Z., Li, L., Fan, W., Li, S. W. Novel needle immersed vitrification: A practical and convenient method with potential advantages in mouse and human ovarian tissue cryopreservation. Hum. Reprod. 23 (10), 2256-2265 (2008).
  11. Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Production of Live Offspring from Testicular Tissue Cryopreserved by Vitrification Procedures in Japanese Quail (Coturnix japonica). Biol. Reprod. 88 (5), 124(2013).
  12. Liu, J., Cheng, K. M., Silversides, F. G. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica). Anim. Reprod. Sci. 134 (3-4), 197-202 (2012).
  13. Lee, S., Yoshizaki, G. Successful cryopreservation of spermatogonia in critically endangered Manchurian trout (Brachymystax lenok). Cryobiology. 72 (2), 165-168 (2016).
  14. Marques, L. S., et al. Viability of zebrafish (Danio rerio) ovarian follicles after vitrification in a metal container. Cryobiology. 71 (3), 367-373 (2015).
  15. Lujić, J., et al. First successful vitrification of salmonid ovarian tissue. Cryobiology. 76, 154-157 (2017).
  16. Bono-Mestre, C., Cardona-Costa, J., García-Ximénez, F. Effects on cell viability of three zebrafish testicular cell or tissue cryopreservation methods. CryoLetters. 30 (2), 148-152 (2009).
  17. Marinović, Z., et al. Cryosurvival of isolated testicular cells and testicular tissue of tench Tinca tinca and goldfish Carassius auratus following slow-rate freezing. Gen. Comp. Endocrinol. 245, 77-83 (2017).
  18. Pšenička, M., Saito, T., Rodina, M., Dzyuba, B. Cryopreservation of early stage Siberian sturgeon Acipenser baerii germ cells, comparison of whole tissue and dissociated cells. Cryobiology. 72, 119-122 (2016).
  19. Lee, S., Iwasaki, Y., Shikina, S., Yoshizaki, G. Generation of functional eggs and sperm from cryopreserved whole testes. Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 110 (5), 1640-1645 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

للواسمات Spermatogonia الزرد بأكملها الخصيتين إبرة مغمورة تبريد فائقة السرعة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.