مقالة منهجية

استخدام دينسوفيروس المؤتلف البعوض ناقل توصيل جينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض

DOI:

10.3791/56121

⸱

أكتوبر 6, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathogen Biology, Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical Disease Research, School of Public Health, Southern Medical University, 2Reproductive Medical Centre of Guangdong Women and Children's Hospital

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تقرير استخدام اصطناعية إينترونيك صغيرة رنا تعبير استراتيجية لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراء مفصل للبناء والتعبئة والتغليف، والتحليل الكمي لناقلات رايدف، وكذلك فيما يتعلق بالإصابة باليرقات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في فيفو microinjection هو تقنية نقل الجينات الأكثر استخداماً لتحليل وظائف الجينات في البعوض الفردية. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب أكثر تقنيا مطالبين بعملية وينطوي على إجراءات معقدة، لا سيما عند استخدامها في اليرقات بسبب صغر حجمها، وبشرة رقيقة وهشة نسبيا، وارتفاع معدل الوفيات، التي تحد من تطبيقها. وفي المقابل، وضعت النواقل الفيروسية لإيصال الجينات التغلب على الحواجز خارج الخلية وداخل الخلية. هذه النظم لها المزايا من السهل التلاعب وتوصيل الجينات عالية الكفاءة والصيانة على المدى الطويل من التعبير الجيني والقدرة على إنتاج الآثار المستمرة في فيفو. دينسوفيروسيس البعوض (مدفس) هي فيروسات الحمض النووي واحد-الذين تقطعت بهم السبل الخاصة بالبعوض، والصغيرة التي يمكن أن يحقق فعالية الأحماض النووية الأجنبية إلى خلايا البعوض؛ بيد الاستبدال أو الإدراج للجينات الأجنبية لإنشاء الفيروسات المؤتلف عادة ما يسبب فقدان قدرات التعبئة والتغليف و/أو النسخ المتماثل، مما يشكل عائقا أمام تطوير هذه الفيروسات نواقل التسليم.

هنا، نحن التقرير باستخدام استراتيجية تعبير الصغيرة-الجيش الملكي النيبالي إينترونيك اصطناعي لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراءات مفصلة للبناء والتغليف والتحليل الكمي لناقلات رايدف، والإصابة بعدوى اليرقات.

وتوضح هذه الدراسة، للمرة الأولى، إمكانية وضع غير تالف المؤتلف MDV الصغرى الحمض النووي الريبي (ميرنا) تعبير نظام، وهكذا يوفر أداة قوية للتحليل الوظيفي للجينات في البعوض ووضع أساس تطبيق باراترانسجينيسيس الفيروسية للسيطرة على الأمراض التي ينقلها البعوض. أظهرنا أن Aedes albopictus 1st الطور اليرقات يمكن أن تكون مصابة بسهولة وفعالية بإدخال الفيروس في الجسم المياه من اليرقات تربية الموقع وأن رايدفس المتقدمة يمكن أن تستخدم أوفيريكسبريس أو هدم تعبير الجينات المستهدفة المحددة في يرقات، توفير أداة للتحليل الوظيفي للبعوض الجينات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأمراض التي ينقلها البعوض مثل الملاريا وحمى الضنك والحمى زيكا والحمى الصفراء، وهي المشاكل الرئيسية للصحة العامة الدولية التي ما زالت تستأثر بجزء كبير من العبء العالمي للأمراض المعدية1،2. مبيدات الحشرات التقليدية، التي جرى استخدامها في الاستجابة للنواقل، عنصرا رئيسيا لاستراتيجية مكافحة البعوض المتكاملة المستدامة للوقاية الأمراض التي ينقلها البعوض. ومع ذلك، أثبتت هذه الاستراتيجيات أن تكون نسبيا غير فعالة أو غير مرغوب فيه بسبب الآثار البيئية السلبية المرتبطة بها، فضلا عن تطور مقاومة البعوض السكان3،4. لهذه الأسباب، هناك حاجة ملحة إلى طرق بديلة من البعوض ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كافة البروتوكولات أقرتها "اللجنة الأخلاقية بجامعة جنوب الطبية"-

1. تصميم "إنترون الاصطناعية"

ملاحظة: إنترون الاصطناعية المستخدمة في هذا العمل هي 65 bp في الطول، والتسلسل هو 5 '-جتاجاجتكجاتكجاكجكجتاكتاكتجتاككتكتكتتتتتتتتتجاتاتككتجكاج-3 '.

  1. مكان Hpa أنا قيد الموقع على طرفي إنترون الاصطناعية بحيث أن Hpa أنا الهضم يمكن الإفراج عن إنترون من البلازميدات (انظر الشكل 1 ألف)-
  2. مكان الاثنين Xba أنا تقييد مواقع في إنترون حتى أن Xba أنا الهضم يمكن استخدامها لإدراج تسلسل الرنا الصغيرة التعبير.
    3. تأمر
  3. التولي....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استراتيجيات لبناء رايدف
تم إنشاء ناقل رايدف معيبة للتعبير عن الجين دسريد في يرقات البعوض. بلازميد الناتجة الواردة كاسيت بروتين NS1-دسريد انصهار مع البروتين نائب الرئيس حذف (الشكل 1أ). رايدف البلازميدات المحتوية على التعبير بنيات لميرنا, ميرنا الأسفنج وشرنا وأميرنا صممت (هو مبين في الشكل 1ب). على سبيل المثال، تم إنشاء ناقل رايدف أوفيريكسبريس 7-العال-اسمحوا في يرقات البعوض. بلاز.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من المهم أن التغلب على اثنين من الحواجز الرئيسية التي تحد من البناء رايدف. الأول هو إنتاج فيروس المؤتلف معيبة. فقد أفيد أن MDV يمكن أن تستخدم كوسيلة للتعبير عن شكل مناسب الحجم الجينات الأجنبية، مثل العقرب neurotoxins20 الخاصة بالحشرات والبروتين التجارة والنقل؛ بيد بغض النظر عن استراتيجية التشييد، بمجرد إدراج Orf MDV أو استبدالها بجينات خارجية، فيريونس لا يمكن أن تشكل بشكل مستقل إلا إذا هو كوترانسفيكتيد بلازميد مساعد لتوريد البروتينات الفيروسية لا غنى عنها مفقودة. الفيروس المعيبة غير قادر على الانخراط في انتقال الثانوية، .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تقر دعما ماليا من البحوث الرئيسية الوطنية وبرنامج التنمية في الصين (2016YFC1200500 "تشن" شياو قوانغ)، الوطني العلوم الطبيعية مؤسسة في الصين (81672054 و 81371846)، وبرنامج فريق البحوث الطبيعية المؤسسة للعلوم في قوانغدونغ (2014A030312016)، والبرامج العلمية والتكنولوجية في قوانغتشو (201508020263). ونعترف مع الامتنان البروفيسور جوناثان كارلسون (جامعة ولاية كولورادو) يرجى تقديم والبلازميدات بوكا و p7NS1-التجارة والنقل ونقديا قراءة هذه المخطوطة.

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
آلة الطرد المركزينظام
الحراري بيكمان كولتر363118
GeneJET Gel ExtractionKit Thermo ScientificK0691
E.Z.N.A. طقم البلازميد ميديأوميغا BiotechD6904
منقى أجارأوكسويدLP0028A
FastAP الفوسفاتيز القلوي الحساس للحرارة (1 U/µ L)Thermo ScientificEF0651
FastDigest HpaI< / em>Thermo ScientificFD1034
FastDigest XbaI< / em>Thermo ScientificFD0684
T4 DNA Ligase (5 U/µ L)Thermo ScientificEL0011
TransStbl3 خلية مختصة كيميائيا بكينTransgen BiotechCD521-01
Ampicillin  ؛بكين تيانجن التكنولوجيا الحيويةRT501
بروتيناز KPromegaMC5008
SuperReal PreMix Plus (SYBR الأخضر)بكين Tiangen التكنولوجيا الحيويةFP205
الطرد المركزي 75004260 العلمي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tolle, M. A. Mosquito-borne diseases. Current problems in pediatric and adolescent health care. 39, 97-140 (2009).
  2. Petersen, L. R., Jamieson, D. J., Powers, A. M., Honein, M. A. Zika Virus. The New England journal of medicine. 374, 1552-1563 (2016).
  3. Roberts, D. R., Andre, R. G. Insecticide resistance issues in ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة