نحن هنا وصف طريقة بسيطة ويمكن الوصول إليها على نطاق واسع لإصابة الأعصاب القطعي في يرقات ذبابة الفاكهة لتصور وكمية التنكس العصبي من الخلايا العصبية الحركية في تقاطع عصبي عضلي (نمج) من اليرقات الطور الثالث.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
A بسيطة العصبية الميكانيكية إصابة منهجية للدراسة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يحدث انحطاط الخلايا العصبية أثناء التطور الطبيعي واستجابة للإصابة، والإجهاد، والمرض. السمات الخلوية من انحطاط الخلايا العصبية هي مشابهة بشكل ملحوظ في البشر واللافقاريات كما هي الآليات الجزيئية التي تدفع هذه العمليات. ذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، يوفر قوية ولكنها بسيطة نموذج الكائنات الوراثية لدراسة التعقيدات الخلوية للأمراض الاعصاب. في الواقع، ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية المرتبطة بالمرض لديها هالوجول ذبابة الفاكهة ووصف عدد كبير من الأدوات والمقايسات باستخدام الذباب لدراسة الأمراض العصبية البشرية. على وجه التحديد وقد ثبت تقاطع العصبية والعضلية (نمج) في ذبابة الفاكهة ليكون نظام فعال لدراسة الأمراض العصبية والعضلية بسبب القدرة على تحليل الاتصالات الهيكلية بين الخلايا العصبية والعضلات. هنا، ونحن تقرير عن في الجسم الحي محرك عصبي إصابة الفحص في ذبابة الفاكهة ، والتييستحث بالتكاثر التنكس العصبي في نمج 24 ساعة. باستخدام هذه المنهجية، وصفنا تسلسل الزمني من الأحداث الخلوية مما أدى إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. طريقة الإصابة لديها تطبيقات متنوعة، كما تم استخدامها لتحديد الجينات المحددة المطلوبة للتنكس العصبي وتشريح الردود النسخي لإصابة الخلايا العصبية.
المقدمة
يحدث انحطاط الخلايا العصبية أثناء التطور الطبيعي ويمكن أن يكون سببه عملية الشيخوخة الطبيعية، والإصابة، والإجهاد، أو حالات المرض. ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ، ذبابة الفاكهة المشتركة، يوفر كائن نموذج بسيط وقوي لدراسة التنكس العصبي بسبب تشابه ملحوظ في الآليات الجزيئية التي تدفع انحطاط الخلايا العصبية. يتم تسليط الضوء على أوجه التشابه هذه من خلال حقيقة أن ما يقرب من 70٪ من الجينات البشرية المرتبطة بالمرض لديها هالوجول ذبابة الفاكهة . 1 بالإضافة إلى ذلك، تم تطوير العديد من المقايسات والأدوات التكنولوجية لدراسة الأمراض العصبية البشرية واستخدامها في ذبابة الفاكهة . 2 ، 3 داخل ذبابة الفاكهة ، وتقاطع عصبي عضلي (نمج) يسمح لتحليل كل من الخصائص الخلوية والكهربية وقد ثبت أن يكون نظاما هاما لدراسة المرض العصبي العضلي بسبب مرئية نوصلات يورون العضلات. 2 في هذه الدراسة، ونحن تصف في الجسم الحي اختبار إصابة الخلايا العصبية في يرقات ذبابة الفاكهة الذي يسمح للإصابة استنساخ من الأعصاب القطاعية. هذه الإصابة موتونورون النتائج في تسلسل زمني من الأحداث الخلوية مما أدى إلى التنكس العصبي في نمج 24 ساعة إصابة آخر. القدرة على إصابة موتورنورونس إصابة استنساخا مما أدى إلى التنكس العصبي لديها تطبيقات متنوعة مثل تحديد الجينات المحددة المطلوبة لعملية التنكسية، وتشريح الردود النسخي لإصابة الخلايا العصبية، وتحليل شلالات الإشارات الوقائية. 4 ، 5 ، 6 وقد استخدمت هذه الطريقة أيضا في تركيبة مع ميكروفليديكش لدراسة انحطاط الخلايا العصبية وتجديد في الحيوانات الحية. 7
نحن نستخدم مقايسة الكمية المحددة لدراسة ديجينيرات الخلايا العصبية الحركيةأيون في نمج بعد ذبابة الفاكهة بعد إصابة ميكانيكية. ويستند هذا الفحص على حقيقة أن فقدان الغشاء قبل المشبكي والبروتينات يسبق تفكيك الشبكية المشبكية (سر) تتميز الطيات غشاء العضلات بعد المشبكي. 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 هذا الفحص يسمح لكمية "أقدام متشابك" حيث فقدت الخلايا العصبية قبل المشبكي اتصال إلى العضلات بعد المشبكي المجاورة. وقد تبين أن العملية التنكسية أن تكون تدريجية في جميع أنحاء تطور اليرقات 12 ولا يمكن أن يحسب عن طريق تغيير المشبك التنمية أو تنتشر. 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 الإعلانالفضل في استخدام إصابات الميكانيكية على الطفرات الموجودة مسبقا هو أنه يسمح لتشريح التسلسل الزمني للأحداث الخلوية المؤدية إلى التنكس العصبي في نمج. 13
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الكواشف والمعدات
- إعداد 1X تشريح العازلة (70 ملي كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 0.02 ملي كاكل 2 ، 20 ملي مغكل 2 ، 10 ملي ناهكو 3 ، 115 ملي السكروز، 5 ملي تريهالوز، 5 هيبيس مم؛ ودرجة الحموضة 7.2).
- إعداد 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس).
- إعداد 1X بت باستخدام برنامج تلفزيوني 1X مع 0.01٪ تريتون X-100.
- إعداد عصير الفاكهة لوحات أجار. 14 باختصار، مزيج 30 غ أجار في 700 مل من H 2 O والأوتوكلاف. حل 0.5 غرام من البارابين الميثيل في 10 مل من الإيثانول وإضافة حل إلى 300 مل من عصير الفاكهة التركيز (العنب أو التفاح). مزيج التركيز في محلول أجار تعقيمها وتصب في الأغطية من 10 ملم × 35 ملم أطباق بتري.
ملاحظة: العنب أجار الطاقة بريمكس ويمكن أيضا أن يتم شراؤها من مختلف الشركات (انظر تابلس من المواد ). - الحصول على حجم 5 ملقط التي تسمح للمرء إصابة ميكانيكيا اليرقات.
- استخدام معيار ذبابة الفاكهة كو 2 جهاز التخدير القائم.
2. اختيار ذبابة الفاكهة اليرقات
- اتخاذ قارورة أو زجاجة من ذبابة الفاكهة التي تحتوي على تجول يرقات الطور الثالث التي تم استزراعها في 25 درجة مئوية.
- حدد عشرة الفردية 2 ند أو 3 اليرقات إنستار أردي على أساس المظهر. يمكن التعرف على اليرقات الطور الثالث من خلال ظهور سبيراكلس الأمامية متفرعة، في حين أن اليرقات الطور الثاني هي أصغر ولها المزيد من سبيركليس الأمامي مثل النادي.
ملاحظة: يمكن أيضا تحديد مراحل اليرقات حسب التوقيت. عند 25 درجة مئوية، تظهر يرقات الطور الثاني بعد حوالي 48 ساعة بعد الفقس، و يرقات اليرقات الثالثة بعد حوالي 24 ساعة. إذا كانت مهتمة في دراسة التنكس العصبي في نمج، تحتاج اليرقات الطور الثاني إلى أن يصاب.
3. إعداد ذبابة الفاكهة اليرقات للإصابات الميكانيكية
- اختيار بعناية اليرقات الفردية عن طريق ملقط أو فرشاة الطلاء، ويجري الحذروليس لضغط عليه في أي حال.
- وضع مباشرة عشرة اليرقات في طبق زجاجي تحتوي على البرد 1X بس أو العازلة تشريح لإزالة أي الحطام الغذاء وإلى تباطؤ حركية اليرقات.
4. الإصابات الميكانيكية ومعالجة اليرقات ذبابة الفاكهة
- وضع كل اليرقة الفردية على جهاز تخدير كو 2 .
- تحت المجهر تشريح، لفة بعناية كل اليرقة على الجانب الظهري من أجل تصور الأعصاب القطاعية من خلال بشرة.
- حجم الموقف 5 ملقط حوالي 1/2 إلى 2/3 الطريق أسفل طول اليرقة بدءا من السنانير الفم. مرة واحدة وضعه، قرصة حوالي 1/3 من بشرة بطنية تحتوي على الأعصاب القطاعية مع حجم 5 ملقط.
- لضمان إصابة الأعصاب القطعية اليرقات، وتطبيق قوة كافية لسحق الأعصاب القطعي ولكن ترك بشرة سليمة. لتحديد كمية الصحيح من القوة، وسحق 10 اليرقات وضمانمعدل الوفيات بعد 5 ساعات تحت 50٪.
- بعد الإصابة، نقل بعناية اليرقات إلى لوحة أجار عصير الفاكهة التي تحتوي على حوالي 0.5 غرام من معجون الخميرة. وضع كل اليرقة حتى نهاية الأمامية على عجينة الخميرة، لاستمرار التغذية على الرغم من تعطيل الحركة.
ملاحظة: لضمان أن الأعصاب القطعية اليرقات قد أصيبت، وتعطلت حركة اليرقات يمكن ملاحظتها بعد نقلها إلى لوحة أجار. اليرقة المصابة مشلولة بشكل فعال الخلفي إلى موقع الإصابة، ولكن لا يزال يمكن نقل السنانير الفم وتغذية. ارتفاع معدل الوفيات من الحيوانات بعد الإصابة أمر شائع لذلك فمن الأفضل لإصابة الحيوانات 20-50٪ أكثر مما هو ضروري لتجربة. - وضع لوحات أجار تحتوي على عجينة الخميرة و 10 اليرقات المصابة في الجزء السفلي من طبق بتري 100 × 15 ملم فارغة. تغطية هذه لوحة بتري، التي تحتوي الآن على اليرقات المصابة على لوحة أجار مع منشفة ورقية رطبة، وضمان أن منشفة ورقية لا تلمس اليرقات أو لوحات أجار. ضع هذاطبق بتري إلى أكبر حاوية الهواء ضيق، في رت.
- استرداد اليرقات لتشريح بعد فترات محددة (6، 12، أو 24 ساعة) بعد الإصابة.
ملاحظة: لفحص الآثار المباشرة للإصابة على الهيكل الخلوي المحوري، يمكن تشريح اليرقات مباشرة بعد الإصابة. لفحص عيوب النقل محور عصبي، يمكن تشريح اليرقات حوالي 6 ساعات بعد الإصابة. حوالي 12 ساعة بعد إصابة تراكم البروتينات أوبيكيتيناتد يمكن ملاحظتها، و 24 ساعة بعد الإصابة، ويمكن ملاحظة انحطاط الخلايا العصبية الحركية في نمج.
5. تحليل تنكس الأعصاب في نمج
- تشريح ذبابة الفاكهة اليرقات نمج كما هو موضح سابقا. 15 ، 16 لفترة وجيزة، دبوس اليرقات على لوحة سيلغارد، وقطع على طول السطح الظهري، وشرائح مع دبابيس في قطرة من العازلة تشريح لفضح الجسم العضلي جدار. إصلاح اليرقات في إما بارافورمالدهيد 4٪ (بفا) أو حل بوين اعتمادا على مكافحةالأجسام المستخدمة لتصور الخلايا العصبية والعضلات.
ملاحظة: يجب استخدام تثبيت بفا إذا كانت علامات البروتين الفلورسنت، مثل البروتين الأخضر الفلورسنت (غفب) هو أن تصور كما تثبيتي بوين يمكن أن تكون قاسية جدا. - أداء المناعي، الذي تم وصفه سابقا 11 ، 13 ، 16 ، لتزامن في وقت واحد الخلايا العصبية الحركية قبل المشبكي والمطابقة بوستسينابتيك (سر) طيات العضلات. تصور الأغشية قبل المشبكي ومحاور عصبية مع بيروكسيداز الفجل مترافق فلورزنتلي (هرب) (1: 300) 17 والمناطق النشطة يمكن ملطخة باستخدام المضادة لل بروكبيلوت (برب) الأجسام المضادة (nc82؛ 1: 100؛ الدراسات التنموية بنك هجين). في وقت واحد تسمية العضلات بعد المشبكي مع المضادة لل ديكس كبير (دلغ) الأجسام المضادة (1: 10،000). 18
- إجراء مقايسة أنشئت لقياس التنكس العصبي في نمج كما هو موضح سابقا. 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 باختصار، تصور في وقت واحد نمجس الفردية لكل من المقصورات قبل وبعد التشابك. أي بوتونس المسمى مع علامات بوستسينابتيك ولكن ليس علامات بريسينابتيك تشير إلى مواقع التنكس العصبي ( الشكل 1 ). ويمكن قياس متوسط عدد البوتونات لكل نمج وكذلك متوسط عدد نمجس لكل حيوان.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
باستخدام الإجراء المعروض هنا، أثبتنا أن إصابة الخلايا العصبية الميكانيكية يسمح للتشريح الزمني للأحداث الاعصاب. 14 ، 18 تسلسل الأحداث وقد تم وصفها سابقا ويبدأ مع انقطاع فوري في الهيكل الخلوي، تليها عيوب الاتجار محور عصبي، وتراكم البروتينات أوبيكيتيناتد، والتنكس العصبي اللاحقة 24 ساعة بعد الإصابة. قبل الإصابة، وت نمجس تظهر بريسينابتيك علامة المنطقة النشطة برب في أبوسيتيون إلى علامة دسبغ بعد ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الإصابات الميكانيكية العصبية وصفها في وقت سابق وأظهرت هنا يمكن استخدامها للحث على الإصابة / الإجهاد في الأعصاب القطعي لليرقات ذبابة الفاكهة . 4 ، 5 ، 6 ، 14 وقد استخدمت هذه التقنية التجريبية سابقا لتشريح التسلسل الزمني للأحداث التي تؤدي إلى التنكس العصبي، وكذلك لدراسة التغيرات النسخي في الخلايا العصبية الحركية الأجسام آخر إصابة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نود أن نشكر جميع أعضاء كيلر ومختبرات ماجي في جامعة كوينبياك للحصول على اقتراحات مفيدة. على وجه الخصوص، نود أن نشكر بارون L. لينكولن الثاني لتطوير هذا الفحص الإصابة داخل مختبر كيلر. كما نود أن نشكر كلية كينيبياك كلية الآداب والعلوم منحة في المعونة الممنوحة لك لك كيلر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مقص التشريح الدقيق | أدوات العلوم | الدقيقة 15000-08 | |
| Dumont # 3 Fallps | Fine Science | Tools 11231-30 | يفضل بعض الناس الحجم 3 ، بينما يفضل البعض الآخر الحجم 5 |
| Dumont # 5 Fulps | Fine Science Tools | 11251-30 | يفضل بعض الناس الحجم 3 ، بينما يفضل البعض الآخر الحجم 5 |
| CO2< / sub> | Tank Tech Air | UN 1013 | يمكن شراء أحجام مختلفة من |
| الخزانات CO2< / sub> جهاز التخدير | Genesee Scientific | 59-114 | |
| دبابيس من الفولاذ المقاوم للصدأ ، مقاس 0.1 | أدوات العلوم الدقيقة | 26002-10 | |
| SylGard 184 سيليكون مطاط أسماكاني ، قاعدة وعامل معالجة | Dow Corning | 3097358-1004 | لصب ألواح التشريح |
| محلول Bouin's | Sigma | HT 10132-1L | يجب اختبار الأجسام المضادة للتأكد من كفاءتها في Bouin's و PFA |
| 4٪ بارافورمالدهايد (PFA) في المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) يجب | Affymetrix | FLY-8030-20 | للتأكد من كفاءتها في Bouin's و PFA |
| تشريح ستيريو MIcroscope | AmScope | SM-1BZ | |
| مصدر الضوء | AmScope | HL150-AY-220V | |
| المضاد للجسم المضاد NC82 | الدراسات التنموية بنك الورم الهجين | nc82-s | |
| الأجسام المضادة للأقراص الكبيرة | الدراسات التنموية Hybridoma Bank | AF3 | |
| Alexa Fluor المضادة للفجل الحار بيروكسيداز | Jackson Immunoresearch | 123-545-021 ؛ 123-585-021 ؛ 123-605-021 | يمكن للمرء أن يكون Alexa Fluor & reg ؛ 488 أو 594 أو 647 |
| Flystuff عصير العنب أجار بريمكس | جينيسي العلمي | 47-102 | |
| شرائح المجهر | جينيسي العلمية | 29-101 | |
| أغطية زجاجية | فيشر ساينتفيك | 12-545-87 | |
| صندوق المرافق الحراري العلمي نالجيني | فيشر ساينتفيك | 03-484C | يستخدم لإنشاء غرفة رطبة لاستعادة اليرقات |
المراجع
- Bier, E. Drosophilia, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nat. Rev. Genet. 6 (1), 9-23 (2005).
- Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).
- McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
- Shin, J. E., Cho, Y., Beirowski, B., Milbrandt, J., Cavalli, V., DiAntonio, A. Dual leucine zipper kinase is required for retrograde injury signaling and axonal regeneration. Neuron. 74 (6), 1015-1022 (2012).
- Xiong, X., Wang, X., Ewanek, R., Bhat, P., Diantonio, A., Collins, C. A. Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury. J Cell Biol. 191 (1), 211-223 (2010).
- Xiong, X., Collins, C. A. A conditioning lesion protects axons from degeneration via the Wallenda/DLK MAP kinase signaling cascade. J Neurosci. 32 (2), 610-615 (2012).
- Mishra, B., Ghannad-Rezaie, M., Li, J., Wang, X., Hao, Y., Ye, B., Chronis, N., Collins, C. A. Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae. J Vis Exp. (84), e50998(2014).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactic is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Eaton, B. A., Davis, G. W. LIM Kinase1 controls synaptic stability downstream of the type II BMP receptor. Neuron. 47 (5), 695-708 (2005).
- Pielage, J., Fetter, R. D., Davis, G. W. Presynaptic spectrin is essential for synapse stabilization. Curr Biol. 15 (10), 918-928 (2005).
- Pielage, J., Cheng, L., Fetter, R. D., Carlton, P. M., Sedat, J. W., Davis, G. W. A presynaptic giant Ankyrin stabilizes the NMJ through regulation or presynaptic microtubules and transsynaptic cell adhesion. Neuron. 58 (2), 195-209 (2008).
- Massaro, C. M., Pielage, J., Davis, G. W. Molecular mechanisms that enhance synapse stability despite persistent disruption of the spectrin/ankryin/microtubule cytoskeleton. J Cell Biol. 187 (1), 101-117 (2009).
- Lincoln, B. L. 2nd, Alabsi, S. H., Frendo, N., Freund, R., Keller, L. C. Drosophila neuronal injury follows a temporal sequence of cellular events leading to degeneration at the neuromuscular junction. J Exp Neurosci. 9, Suppl 2. 1-9 (2015).
- Drosophila apple juice-agar plates. Cold Spring Harb Protoc. , (2011).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ immunohistochemistry. J Vis Exp. (25), (2009).
- Smith, R., Taylor, J. P. Dissection and imaging of active zones in the Drosophila neuromuscular junction. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jan, L., Jan, Y. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc. Natl. Acad. Sci. 79 (8), 2700-2704 (1982).
- Lahey, T., Gorczyca, M., Jia, X., Budnik, V. The Drosophila tumor suppressor gene dlg is required for normal synaptic bouton structure. Neuron. 13 (4), 823-835 (1994).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
