مقالة منهجية

في الموقع تلوين تيترامير MHC والتحليل الكمي تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في الأنسجة

DOI:

10.3791/56130

⸱

سبتمبر 22, 2017

 ,  , 
1Department of Veterinary and Biomedical Sciences, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهنا يصف لنا أسلوب الذي يجمع في الموقع تيترامير MHC تلطيخ مع إيمونوهيستوتشيميستري لتحديد الترجمة، والنمط الظاهري، وكمية محددة مستضد الخلايا في الأنسجة. هذا البروتوكول يستخدم لتحديد الخصائص المكانية والمظهرية لخلايا تي CD8 مستضد على حدة بالنسبة لنوع الخلية الأخرى والهياكل في الأنسجة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير MHC-تيترامير تلطيخ الخلايا T محددة مستضد تحليلها بواسطة التدفق الخلوي ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا يمكن تحديد التعريب المكانية محددة مستضد تي الخلايا إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، وتقنيات التصنيف الحالية الأخرى لاستخراج تي الخلايا اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية. في الموقع تلطيخ تيترامير MHC (IST) هو تقنية لتصور خلايا تي التي محددة لمولدات المضادات للفائدة في الأنسجة. في تركيبة مع إيمونوهيستوتشيميستري (المدينة)، يمكن تحديد المحكمة العراقية الخاصة وفرة والموقع والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة. هنا، نحن تصف وضع بروتوكول لوصمة عار وتعداد الخلايا التائية CD8 مستضد على حدة، مع تعمل محددة تقع داخل مقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها التي استخدمت في المنشور الذي صدر مؤخرا من لي et al.، بعنوان "الخلايا المنتجة" فيروس نقص المناعة القردي "في" المسام تقمع جزئيا "من CD8 الخلايا+ " في فيفو "." الأساليب المذكورة قابلة للتطبيق على نطاق واسع لأنها يمكن استخدامها لترجمة، النمط الظاهري، وتحديد مقدار أساسا أي خلية CD8 T مستضد محددة تتوفر فيها MHC tetramers، في أي أنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا T حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات المناعية، بما في ذلك كشف والقضاء على الخلايا المصابة بالفيروس، ومنع المناعة الذاتية، ومساعدة في الإنتاج ب-الخلايا والخلايا البلازما من الأجسام المضادة، وكشف والقضاء على الخلايا السرطانية. تطوير ببتيد/MHC الفئة الأولى تيترامير تلطيخ محددة مستضد خلايا CD8 تي1 ووضع عهدا MHC الفئة الثانية تيترامير تلطيخ الخلايا CD4 تي2 بالتدفق الخلوي أحدث ثورة في قدرتنا على دراسة وفهم إيمونوبيولوجي خلايا تي. بينما مفيدة للغاية لتحديد الكمية والنمط الظاهري محددة مستضد خلايا T، التدفق الخلوي لا تسمح للكشف عن توطين المكانية محددة مستضد خلايا تي إلى الخلايا والهياكل في الأنسجة، والحالية الأخرى تقنيات تفصيل لاستخراج الخلايا T اللازمة للتدفق الخلوي محدودة الفعالية في الأنسجة غير اللمفاوية3.

نحن وآخرون تطورت أساليب استخدام الطبقة MHC الببتيد-تحميل الأول والصف الثاني تيترامير أو الكواشف مولتيمير بوصمة عار محددة مستضد خلايا CD8 و CD4 T في الأنسجة4،5،،من67، 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13-أساليب "هذه المحكمة الخاصة العراقية" السماح لتحديد موقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا محددة مستضد CD8 و CD4 T في الأنسجة وتوفير وسيلة للكشف عن هذه الخلايا بالنسبة لخلايا وهياكل في الأنسجة أخرى. مجموعتنا وقد تستخدم على نطاق واسع MHC--أنا تيترامير تلطيخ لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز)-وفيروس نقص المناعة القردي (سيف)-الخلايا التائية CD8 محددة في الأنسجة اللمفاوية والأعضاء التناسلية والمستقيم اكتساب فهم لفيروس نقص المناعة البشرية وسيف إيمونوباثوجينيسيس وأن تحديد يرتبط التطعيم الناجحة استراتيجيات14،15،،من1617. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعنا أيضا أسلوب الذي يجمع بين المحكمة الخاصة العراقية في الموقع التهجين (العش) لتوطين والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 الخاصة بالفيروس والخلايا المصابة بالفيروس في الأنسجة وتحديد مستويات المستجيب للهدف في فيفو 18 , 19.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول باستخدام MHC الببتيد-تحميل-أنا تيتراميرس وصمة عار محددة مستضد خلايا تي CD8 في أقسام الأنسجة الطازجة، إلى أنسجة كونتيرستاين استخدام المدينة، والتحديد الكمي للخلايا مع محددة تعمل في المقصورات الأنسجة محددة. هذه الإجراءات هي نفسها كما كانت تستخدمها لي et al., الذي حددنا الموقع والوفرة، والنمط الظاهري لخلايا تي سيف على حدة في الأنسجة اللمفاوية أثناء الإصابة المزمنة بسيف في ماكاكويس20في المنشور الذي صدر مؤخرا.

لتنفيذ هذا الإجراء، مقطوع الأنسجة الطازجة والمحتضنة بين عشية وضحاها مع MHC الببتيد-تحميل-أنا tetramers مترافق لجزيئات ثيوسيانات fluorescein (فيتك). ثم أنها ثابتة في بارافورمالدهيد. بعد تحديد الأنسجة، يتم تضخيمه الإشارة من MHC tetramers باستخدام الأجسام المضادة-فيتك أرنب والمحتضنة مع المعلمة فلوريسسينتلي أرنب المضادة الأجسام المضادة مفتش، وكذلك تضخيم الإشارة من تيتراميرس منضم. المدينة يستخدم بالاقتران مع المحكمة الخاصة العراقية لصفات محددة مستضد الخلايا T والخلايا المحيطة بها. الأجسام المضادة التي تعترف [ابيتوبس] على سطح الخلايا أو مدرجة في الفضاء خارج الخلية في الحضانة الأولية مع تيتراميرس. الأجسام المضادة التي تعترف بداخل الخلايا [ابيتوبس] تتطلب تخلل لجدار الخلية قبل التلوين. يتم تصويرها باستخدام مجهر [كنفوكل] أقسام النسيج الملون وتحليلها باستخدام البرمجيات [كنفوكل]. الخلايا المسماة كمياً باستخدام برامج الفحص المجهري [كنفوكل] أو إيماجيج. يمكن استخدام بروتوكول وصف وصمة عار أساسا أي خلية محددة مستضد تي CD8 في أي أنسجة للذي MHC--أنا تيتراميرس متوفرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-1 اليوم: تقطيع الأنسجة الطازجة والحضانة الأولية

  1. استخدام مشرط قطع الأنسجة الطازجة إلى قطع صغيرة (حوالي 0.5 سم من 0.5 سم). بشكل منفصل الصق كل الأنسجة للمكبس وتضمينها مع 3-5 مل من 4% ذوبان منخفضة [اغروس] في برنامج تلفزيوني. قم بتسمية المكبس مع المعلومات الأنسجة باستخدام ملصق. وضعها في حامل مبردة في دلو الجليد يصلب.
  2. بدوره على مبضع ومجموعة شنت سمك الفروع إلى 200 ميكرومتر. تثبيت شفرة حلاقة على مبضع وإدراج المكبس مع الأنسجة في حمام مبضع.
    3. إعداد
  3. مخزنة الفوسفات المالحة مع الهيبارين (برنامج تلفزيوني-ح) بإضافة 100 ميكروغرام/مل أو 18.7 يو/مليلتر الهيبارين إلى برنامج تلفزيوني للحفاظ على الجيش الملكي النيبالي والسماح التطبيقات المحتملة ايش المصب. ملء حمام مبضع، تغطي الأنسجة المضمنة، مع 100-120 مل من برود، عقيمة برنامج تلفزيوني ه. إضافة مكعبات الثلج ح برنامج تلفزيوني للحمام للحفاظ على درجة حرارة 0-2 ° جيم ابدأ مبضع وقطع الأنسجة إلى 200 ميكرومتر المقاطع.
    ملاحظة: من المهم أن تبقى الأنسجة المبردة بالثلج لتقليل النشاط الخلوي داخل الأنسجة وسبب أنسجة جديدة أسهل للقسم عند هي مبردة. يمكن استخدام برنامج تلفزيوني وحدها إذا لم يكن هناك أي خطط للعش المصب.
  4. بدلاً من ذلك، لاستخدام الأنسجة التي لا تقطع مع مبضع (مثل الأمعاء والرئة)، مشرط أو شفرة حلاقة لقطع الأنسجة إلى شرائح رقيقة كأقرب ما يمكن من 200 مليميكرون.
  5. تسمية غطاء لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا مع معلومات العينة التجريبية والدوائر الأنسجة في الآبار المقابلة. استخدام مجموعة الرسام لنقل المقاطع إلى دائرة أنسجة في بئر صفيحة 24-جيدا زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1 مل من برود PBS-حاء
    ملاحظة: ينبغي قبل الشروع في تلطيخ الدوائر الأنسجة القابلة لإعادة الاستخدام. يمكن إجراء استخدام أنبوب الحد الأقصى للأداة أسفل جولة البوليبروبيلين 14 مل الدوائر الأنسجة وأسلاك الشبكة. استخدام شفرة حلاقة حادة لقطع الجزء السفلي من أنبوب الحد الأقصى للأداة أسفل الجولة البوليبروبيلين 14 مل. قطع أسلاك شبكة في حلقة مفرغة لتناسب الثقب في الجزء السفلي من الأنبوب. الحرارة دائرة شبكة الأسلاك باستخدام موقد بنسن حتى وملتهب. تعيين دائرة شبكة الأسلاك إلى أسفل بسرعة كبيرة، ودفع الأنبوب على الشبكة. تحقق من أن أسلاك شبكة أمان تعلق على الجزء السفلي من الأنبوب وثم قطع بعناية الجزء العلوي من الأنبوب عند علامة 3 مل باستخدام شفرة حلاقة حادة. وضع يصل إلى 3 أقسام الأنسجة في كل دائرة الأنسجة، أو ما يصل إلى 1 سم 2 من أنسجة كل بئر. تبقى بئر فارغة واحدة على الأقل بين الآبار مع تركيبات مختلفة من الأجسام المضادة لتجنب التلوث عبر.
    6. تيترامير
  6. المضي قدما إلى المرحلة الابتدائية وجسم تلطيخ فورا بعد الانتهاء من نقل جميع قطع المقاطع إلى الدوائر الأنسجة. الحفاظ على الأقسام المغمورة وبرود في 1 مل ح برنامج تلفزيوني في جميع الأوقات.
  7. احتضان الفروع الأنسجة بين عشية وضحاها مع 0.5 ميكروغرام/مل مترافق FITC، محملة الببتيد MHC--أنا تيتراميرس المخفف في برنامج تلفزيوني-ح بمصل الماعز العادية 2% (خ ع). وتشمل الماوس أو الأجسام المضادة غير الأرانب الأخرى الموجهة إلى خارج الخلية [ابيتوبس] للفائدة في هذه الحضانة (مثل الفئران مكافحة CD8 أضداد المخفف 1: 500 في برنامج تلفزيوني-H مع 2% خ ع). ضع 1 مل من الأجسام المضادة المخفف في كل بئر-
    ملاحظة: يجب توخي الحذر عند تحديد الأجسام المضادة CD8، كما يمكن أن يعزز بعض وبعضها يمكن أن تمنع tetramers MHC ملزمة لمستقبلات خلية تي 4 ، 21. جسم CD8 الإنسان مكافحة الفئران الموصوفة هنا غير مستقر، ويؤدي أحياناً إلى تلطيخ ضعيفة إلى حد ما. وهو يستخدم هنا لوسم الثلاثي لأنها الوحيدة غير الأرنب والماوس غير CD8 جسم اختبار تلك الخلايا التائية CD8 المكاك الريسوسي الملون.
  8. استخدام 1 مل من محلول لكل بئر لجسم الأولية واللاحقة كل إينكوبيشنز، والقيام بهذا وجميع إينكوبيشنز اللاحقة في 4 درجات مئوية، مع لوحات على منصة هزاز.
    ملاحظة: الأنسجة أن التعويم الحر في الدائرة-

2. يوم 2: التثبيت وحضانة الثانوي

  1. بعد الاحتضان الابتدائي، يغسل كل غسل أبواب مرتين مع 1 مل ح برنامج تلفزيوني يبرد لمدة 20 دقيقة. القيام بذلك عن طريق نقل الدوائر الأنسجة إلى لوحة زراعة الأنسجة 24-آبار مختلفة التي تحتوي على 1 مل ح برنامج تلفزيوني مبردة في الآبار المقابلة.
    ملاحظة: كن حذراً لا بالتنقيط محتويات من عينة تجريبية واحدة إلى أخرى عند الانتقال بين الدوائر الأنسجة. لجميع إينكوبيشنز اللاحقة ويغسل، وبالمثل نقل الدائرة الأنسجة لصفيحة نظيفة تحتوي على الحل المناسب. تأكد من رصد المقاطع في الدوائر الأنسجة أثناء إجراء للتأكد من أن الفروع لا تتعثر على الجانبين من الدوائر الأنسجة. إذا أنها، تدفع لهم العودة إلى الحل.
  2. إصلاح الأجزاء مع 1 مل بارافورمالدهيد 4% مخزنة في برنامج تلفزيوني جديد ح 2 في درجة حرارة الغرفة (عدم الإفراط وإصلاح). أغسل مع ح برنامج تلفزيوني الباردة مرتين للحد الأدنى 5
    تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    ملاحظة: إذا كان من الضروري استرجاع مستضد و permeabilization للكشف عن [ابيتوبس] داخل الخلايا، المستضدات يمكن استردادها بواسطة غلى المقاطع في 0.01 mol اليوريا بعد التثبيت بارافورمالدهيد.
    3. تحويل الأقسام إلى لوحات الثقافة 24-البئر الذي يحتوي على 0.01 mol اليوريا
  3. ووضع هذه اللوحات في فرن ميكروويف. غلى المقاطع ثلاث مرات لحوالي 10 s كل منهما، ليصبح مجموع 30 س.
    ملاحظة: كن حذراً جداً، الغليان يمكن فرض الحل أبواب الخروج من الآبار. إذا حدث هذا، استخدم الرسام دفع الفروع من الجانبين من قاعة الأنسجة أو من غطاء اللوحة مرة أخرى إلى الجزء السفلي من الدائرة الأنسجة مناسبة.
  4. مسبق للاحتضان جسم الثانوية، بيرميبيليزي وكتلة أقسام الأنسجة التي تفرخ لهم في عرقلة الحل الذي يحتوي على برنامج تلفزيوني-ح والمنظفات 0.3% (برنامج تلفزيوني-ح تي) 2% خ ع على الروك ح 1 في 4 ° C. إجراء إينكوبيشنز جسم اللاحقة مع خ ع PBS-H-T/2%-
  5. للاحتضان الثانوية، نقل المقاطع في الدوائر الأنسجة إلى الآبار تحتوي على الأرنب فيتك مكافحة جسم المخفف المضيفين في خ ع PBS-H-T/2%. تبني بين عشية وضحاها.
  6. استخدام كونتيرستينينج إجراء الماوس المضادة-CD20 جسم المخفف 1: 200 في خ ع PBS-H-T/2%. لاستخدام هذا الخيار، استرداد [ابيتوبس] إذا لزم الأمر، تتخلل الخلايا، وكتلة قبل هذه الحضانة، كما هو موضح أعلاه.

3. يوم 3: التعليم العالي حضانة

  1. بعد الحضانة الثانية، يغسل المقاطع ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-ح في 4 درجات مئوية على الأقل 20 دقيقة
  2. القيام حضانة نهائي مع المناسبة المسمى فلوريسسينتلي الأجسام المضادة (مثل الماعز الأرنب المضادة مترافق أصفر مخضر والماعز لمكافحة الفئران مترافق صبغ أحمر الآن والماعز الصبغة الخضراء مترافق الماوس المضادة الأجسام المضادة المخفف 1:5، 000، 1:5، 000 000، و 1:2، على التوالي، في PBS-H-T/2% خ ع). تبني بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، الحضانة يمكن تمديد لمدة تصل إلى ثلاثة أيام إذا لزم الأمر. إبقاء أبواب تحميها من الضوء التفاف اللوحات في إحباط القصدير أثناء هذا إينكوالخطوة بيشن وبعد ذلك، وكما يروي الضوء فلوروفوريس.

4. يوم 4: تركيب الأبواب

  1. أغسل أقسام ثلاثة مرات في برنامج تلفزيوني-ح لمالا يقل عن 20 دقيقة
    ملاحظة: إذا كان التخطيط المصب ايش 19، إصلاح المقاطع في بارافورمالدهيد 4% ح 1 تأمين تيتراميرس والأجسام المضادة في المكان، ويغسل المقاطع مرتين مع برنامج تلفزيوني-H لمدة 5 دقائق في كل.
    تنبيه: بارافورمالدهيد السامة؛ ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    2. استخدام
  2. الرسام لنقل المقاطع إلى شريحة مجهر. احرص على عدم كزة الأنسجة كثيرا. معطف كل قسم مع الجلسرين/الجيلاتين يحتوي على آخر متوسط المتصاعدة التي تحتوي على فلوروفوري حافظة أو يبيغاللوكاتيشين البروبيل-ن 4 مغ/مل. تغطية مع ساترة.
  3. تخزين الشرائح في حاوية شريحة محمية بالضوء في-20 درجة مئوية. شطف لوحات زراعة الأنسجة وإزالة التسميات على الأغطية استخدام الكحول.
    ملاحظة: يمكن إعادة استخدام اللوحات.

5. الحصول على صور المجهر [كنفوكل]

  1. التقاط صور عالية الدقة مع مجهر [كنفوكل]، باستخدام أشعة الليزر المناسبة ومرشحات لكل فلوروفوري ( الشكل 1 أ وب)-
    ملاحظة: في هذا المثال، (انظر الجدول للمواد) استخدم مجهر [كنفوكل]. وجمعت الصور استخدام الليزر نانومتر 561 في السلطة 20% لخلايا تي محددة مستضد المسمى أصفر مخضر و 488 نانومتر الليزر بقوة 10% للأخضر المسمى ب CD20-الإعراب عن الخلايا 640 نانومتر الليزر بقوة 15% للخلايا التائية CD8 الأحمر المسمى الآن. واستخدمت 20 × الهدف وفتحه عددية من 0.8-
  2. تسلسلياً جمع فترات سلسلة z في 3 ميكرومتر (أو غيرها) في القنوات الثلاث في حقول متعددة 800 × 800 بكسل. بناء مونتاج من الحقول التي تم جمعها ( الشكل 1 -E). تسمية كل صورة المونتاج استناداً إلى المعلومات الشريحة المقابلة وحفظه للتحليل-
  3. القيام بتحليل الصورة الكمية باستخدام مجهر [كنفوكل] كل تحليل وتقدير حجم البرنامج أو استخدام إيماجيج-

6. التحليل الكمي للصورة

ملاحظة: يمكن إنجاز التحليل الكمي الصورة باستخدام برامج التحليل والقياس الكمي مجهر [كنفوكل] أو باستخدام برنامج إيماجيج. واستخدمت هنا، إيماجيج على سبيل مثال-

المونتاج
  1. مفتوحة [كنفوكل] بواسطة سحبه إلى إطار إيماجيج ( الشكل 2A).
    ملاحظة: يمكن مباشرة فتح ImageJ المونتاج جمعتها مجاهر [كنفوكل] مختلفة كثيرة. إذا كان لا يمكن فتح المونتاج مباشرة قبل إيماجيج، تصدير z-الفحص المحدد كملف TIFF لفتح ذلك
  2. مكررة z-الفحص المحدد للتحليل (" صورة "-> " المكررة ") ( الشكل 2B).
  3. تقسيم قنوات مختلفة (" صورة "-> " اللون "-> " تقسيم القنوات ") ( الشكل 2).
    4. رسم
  4. دوروا للتحليل الكمي في القناة المقابلة يكون موضوعيا وإضافته إلى إدارة العائد على الاستثمار عن طريق الضغط على " تي " على لوحة المفاتيح. قياس المنطقة.
    ملاحظة: يظهر مدير ImageJ دوروا المنطقة في 2 ميكرومتر ( الشكل 2D).
  5. ضبط fluorescence السطوع والتباين للقناة ليتم تحليلها (" صورة "-> " ضبط "-> " السطوع/") ( الشكل 2E).
  6. تسطيح دوروا على الصورة (" دوروا مدير "-> " سطح ") ( الشكل 2 واو)-
  7. تحديد الخلايا إيجابية في الصورة باستخدام " متعددة النقاط " أداة ( الشكل 2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشكل 1 يبين كيفية جمع الصور [كنفوكل] باستخدام مجهر [كنفوكل]. الشكل 2 يوضح تحليل الصورة الكمية باستخدام إيماجيج. الشكلان 3 و 4 إظهار الممثل الصور من العقدة الليمفاوية الأنسجة من سيف إصابة المكاك الريسوسي ملطخة MHC tetramers، CD8 الأجسام المضادة، والأجسام المضادة CD20، وتثبت خصوصية تلطيخ تيترامير MHC. الشكل 3 يقارن MHC الفئة الأولى tetramers محملة ببتيد من سيف مقارنة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة يوفر أداة أساسية لكشف وتميز، والتحديد الكمي للخلايا التائية CD8 محددة مستضد في البيئات الأصلية مع السياق هياكل الأنسجة والخلايا الأخرى. هنا، يمكننا وصف إجراءات مفصلة للمحكمة العراقية الخاصة جنبا إلى جنب مع المدينة، متبوعاً بتحليل الصورة الكمية، تحديد الموقع، ووفرة، والنمط الظاهري محددة مستضد تي CD8 الخلايا في الغدد الليمفاوية من macaques الريسوسي. تلطيخ مشابهة يمكن تطبيقها على الإنسان، الماوس، أو الأنسجة الأنواع الأخرى لأي MHC--أنا تيتراميرس متوفرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الببتي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أيد هذا العمل "خدمة الصحة العامة" منح من "معاهد الصحة الوطنية" (T32 DA007097، R01AI096966، andUM1AI26617).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
منشأةلرباعي رباعي المعاهد الوطنيةمونومر MHC-مواد لإعداد معقد التوافق النسيجي
ExtrAvidin-FITCسيجما-ألدريتشE2716مواد لإعداد معقد التوافق النسيجي
مصل الماعز العاديجاكسون للبحوث المناعية005-000-121
منخفض الذوبان الاغاروزPromegaV3121
الهيبارينسيجما ألدريتشSLBL6391V
تريتون X-100سيجما ألدريتشT-6878
اليورياجي تي بيكر4204-05
جيلاتين الجلسرينسيجما ألدريتشSLBH2672V
إن بروبيل غالاتسيجما ألدريتشP3130
جرذ و حبة CD8 (1: 500)Acris0714الجسم المضاد غير مستقر ، استخدم استخدام واحد المجمدة
m-a-h-CD20 (1:500)NOVOCASTRA6026819
m-a-h-Ki67 (1:500)ناقلات6022201
الماعز a-m-A488 (1: 2,000)Jackson Immunoresearch124083
goat-a-rb-Cy3 (1: 5,000)Jackson Immunoresearch106232
goat-a-rat-Cy5 (1: 5,000)Jackson Immunoresearch118088
Goaz-a-h-IgM-Dylight649 (1: 5،000)Jackson Immunoresearch86579
Compresstome: VF-300 MicrotomePrecisionary Instruments، LLC1079
مجموعة سريعة لاصقة فوريةLoctite46551
24 بئر ألواح زراعة الأنسجة ذات القاع المسطحFalcon353226
MicroscopeGlobe scienfitic Inc.#1321
Razor  شفرةTed Pella, Inc121-6
مشرط ريش يمكن التخلص منهFEATHER SAFETY RAZOR CO. LTD.رقم 21
فرشاة الرسم المستديرة # 2PRINCETON ART & amp شركة الفرشاة4350Rيمكن تقليم حسب الحاجة باستخدام
مجهر حلاقة متحد البؤرأوليمبوسFV1000
FV10-ASW_Viewer4.0أوليمبوس
أساسية للصحة الكبير الكبير

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  2. Novak, E. J., Liu, A. W., Nepom, G. T., Kwok, W. W. MHC Class II tetramers identify peptide-specific human CD4(+) T cells proliferating in response to influenza A antigen. J Clin Invest. 104, R63-R67 (1999).
  3. Steinert, E. M., et al. Quantifying memory CD8 T cells reveals regionalization of immunosurveillance. Cell. 161 (4), 737-749 (2015).
  4. Skinner, P. J., Daniels, M. A., Schmidt, C. S., Jameson, S. C., Haase, A. T. Cutting edge: In situ tetramer staining of antigen-specific T cells in tissues. J Immunol. 165 (2), 613-617 (2000).
  5. Haanen, J. B., et al. In situ detection of virus- and tumor-specific T-cell immunity. Nat Med. 6 (9), 1056-1060 (2000).
  6. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ tetramer staining using MHC class I tetramers. J Immunol Methods. 268 (1), 29-34 (2002).
  7. Skinner, P. J., Haase, A. T. In situ staining using MHC class I tetramers. Curr Protoc Immunol. 17, 4.1-4.9 (2004).
  8. Li, Y., et al. Use of HLA-DR*08032/E7 and HLA-DR*0818/E7 tetramers in tracking of epitope-specific CD4+ T cells in active and convalescent tuberculosis patients compared with control donors. Immunobiology. 216, 947-960 (2011).
  9. Bischof, F., et al. Analysis of autoreactive CD4 T cells in experimental autoimmune encephalomyelitis after primary and secondary challenge using MHC class II tetramers. J Immunol. 172, 2878-2884 (2004).
  10. Massilamany, C., et al. Direct staining with major histocompatibility complex class II dextramers permits detection of antigen-specific, autoreactive CD4 T cells in situ. PLoS ONE. 9, e87519(2014).
  11. Massilamany, C., et al. In situ detection of autoreactive CD4 T cells in brain and heart using major histocompatibility complex class II dextramers. J Vis Exp. (90), e51679(2014).
  12. Dileepan, T., Kim, H. O., Cleary, P. P., Skinner, P. J. In Situ Peptide-MHC-II Tetramer Staining of Antigen-Specific CD4+ T Cells in Tissues. PLoS ONE. 10 (6), e0128862(2015).
  13. Tjernlund, A., et al. In situ detection of Gag-specific CD8+ cells in the GI tract of SIV infected Rhesus macaques. Retrovirology. 7, 7-12 (2010).
  14. Connick, E., et al. CTL fail to accumulate at sites of HIV-1 replication in lymphoid tissue. J Immunol. 178, 6975-6983 (2007).
  15. Hong, J. J., et al. Localized Populations of CD8low/− MHC Class I Tetramer+ SIV-Specific T Cells in Lymphoid Follicles and Genital Epithelium. PLoS ONE. 4 (1), e4131(2009).
  16. Sasikala-Appukuttan, A. K., et al. Location and dynamics of the immunodominant CD8 T cell response to SIVΔnef immunization and SIVmac251 vaginal challenge. PLoS ONE. 8 (12), e81623(2013).
  17. Connick, E., et al. Compartmentalization of simian immunodeficiency virus replication within secondary lymphoid tissues of rhesus macaques is linked to disease stage and inversely related to localization of virus-specific CTL. J Immunol. 193, 5613-5625 (2014).
  18. Li, Q., et al. Visualizing antigen-specific and infected cells in situ predicts outcomes in early viral infection. Science. 323, 1726-1729 (2009).
  19. Li, Q., Skinner, P. J., Duan, L., Haase, A. T. A technique to simultaneously visualize virus-specific CD8+ T cells and virus-infected cells in situ. J Vis Exp. (30), e1561(2009).
  20. Li, S., et al. Simian immunodeficiency virus-producing cells in follicles are partially suppressed by CD8+ cells in vivo. J Virol. 90, 11168-11180 (2016).
  21. Daniels, M. A., Jameson, S. C. Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers. J Exp Med. 191, 335-346 (2000).
  22. Lee, Y. J., Wang, H., Starrett, G. J., Phuong, V., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Tissue specific distribution of iNKT cells impacts their cytokine response. Immunity. 43 (3), 566-578 (2015).
  23. Abdelaal, H. M., Kim, H. O., Wagstaff, R., Sawahata, R., Southern, P. J., Skinner, P. J. Comparison of Vibratome and Compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biol Proced Online. 17, (2015).
  24. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة