مقالة منهجية

بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

DOI:

10.3791/56132

⸱

أكتوبر 5, 2017

 , 
1Institute for Environmental Sciences, University of Koblenz-Landau, 2Institute of Integrated Natural Sciences, University of Koblenz-Landau, 3IV 2.5 (Trace Analysis, Artificial Pond and stream system), Federal Environment Agency

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تحليل محتوى الأمعاء الأكثر شيوعاً ماكروينفيرتيبراتيس البصرية. تتطلب معرفة مكثفة عن تنوع الكائنات الحية فريسة المورفولوجية، أنها ملكة جمال الفريسة جسديا لينة، وسبب قوي كومينوشن الجارحة، يكاد يكون من المستحيل لبعض الكائنات الحية، بما في ذلك أمفيبودس. ونحن نقدم النهج الوراثية رواية مفصلة ماكروينفيرتيبراتي فريسة الهوية في النظام الغذائي من أمفيبودس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل الشبكات الغذائية ضروري لفهم أفضل للنظم الإيكولوجية. على سبيل المثال، يمكن الخضوع للتفاعلات الشبكة الغذائية التغيرات الشديدة الناجمة عن غزو الأنواع غير الأصلية. تحديد الحقل الفرائس التفاعلات دقيقة غير صعبة في كثير من الحالات. غالباً ما تستند إلى هذه التحليلات تقييم البصري لمحتوى الأمعاء أو تحليل نسب النظائر المستقرة (δ15N و δ13ج). هذه الأساليب تتطلب معرفة شاملة تقريبا، على التوالي، تنوع السمات أو التوقيع النظائر المشعة من الكائنات الحية فريسة الفردية، مما يؤدي إلى عقبات في تحديد الفريسة الكائنات الحية الدقيقة. يحلل محتوى القناة الهضمية البصرية خاصة نقلل من الكائنات الناعمة الفريسة جسديا، وسبب تعطن والابتلاع والهضم من الكائنات الحية فريسة صعوبة تحديد الأنواع المحددة. ومن ثم بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) على أساس الاستراتيجيات، على سبيل المثال استخدام التمهيدي المعينة لمجموعة مجموعات، توفر أداة قوية لتحقيق التفاعلات الشبكة الغذائية. هنا، يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة للتحقيق في محتويات القناة الهضمية للمستهلكين ماكروينفيرتيبراتي من الحقل باستخدام مجموعات الخاصة بالفريق التمهيدي للحمض النووي ريبوسومال (المتاشب). يمكن أن يكون الحمض النووي المستخرج أما من عينات كاملة (في حالة الأصناف الصغيرة) أو الخروج من محتويات القناة الهضمية من العينات التي تم جمعها في الميدان. الوجود والكفاءة الوظيفية لقوالب الحمض النووي بحاجة إلى تأكيد مباشرة من الأفراد المختبرة التمهيدي عالمي باستخدام مجموعات تستهدف وحدة فرعية كل منها من الحمض النووي. كما نثبت أنه يمكن تحديد فريسة تستهلك المزيد وصولاً إلى مستوى الأنواع عن طريق PCR مع غير معدلة خاصة بمجموعة الإشعال جنبا إلى جنب مع تكيف اللاحقة جديلة واحدة تعدد الأشكال (SSCP) تحليلات استخدام المواد الهلامية polyacrylamide. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن استخدام الأصباغ الفلورية مختلفة كتسميات لتمكين الفرز موازية لشظايا من الحمض النووي للمجموعات فريسة مختلفة من عدة عينات محتوى القناة الهضمية عن طريق التحليل الآلي جزء.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات الفرائس، التي تشكل الغالبية من التفاعلات التغذوية وديناميات الشبكة الغذائية، هي الجوانب الرئيسية لتحديد خصائص تدفق المادة والطاقة في جميع أنحاء الشبكات الغذائية داخل وفيما بين النظم الإيكولوجية، وواحد من الأهداف الرئيسية للإيكولوجيا 1. تحديد المصدر وتدفق الكربون والمغذيات هو الفهم للاتصال البيئي بين النظم الإيكولوجية2. ومع ذلك، لا ترتبط النظم الإيكولوجية، مثل الأنهار ومستجمعات المياه بها، فقط بتدفقات المواد العضوية والعناصر الغذائية ولكن أيضا بتحركات الكائنات الحية3. وهكذا، التعديلات الموئل انقطاع تدفق الموارد التي تربط بين تلك النظم بشدة تغيير الشبكات الغذائية للنظم الإيكولوجية، وكلاهما ليس فقط مباشرة بل أيضا غير مباشر بتغيير تكوين كل منهما جماعات الفرائس. على سبيل المثال، أظهرت التغييرات في الشبكات الغذائية مرتبطة بتحركات المفترس واحد الأنواع (مثل، تراوت قوس قزح)4. هذه التغييرات يمكن أن تهدد التنوع البيولوجي وأداء النظم الإيكولوجية المائية. ولذلك، تحليل التفاعلات الفرائس في الميدان ضروري لتحديد أثر التغيرات البيئية التي يتسبب فيها الإنسان، مثل ممارسات إدارة المياه، على التنوع البيولوجي للنظم الإيكولوجية المائية الأصلية.

إذ من الصعب تتبع الروابط التغذوية في النظم المعقدة، تم إنشاء عدة نهج التي تمكن من تقييم التغذية التفاعلات في الحقل5. تقليديا، التحقيقات لتغذية التفاعلات في الميدان تستند إلى التعرف البصري من بقايا الفريسة في تشريح الشجاعة وتتطلب معرفة شاملة حول التنوع فريسة مورفولوجك. وقدمت تحليلات محتوى الأمعاء البصرية رؤى في استخدام الموارد من عدة مجموعات من المستهلكين (مثل التباين الموسمي في النظام الغذائي من جراد البحر6 والأسماك7،8 أو تغذية تفضيلات من الكانفاس). بيد أن عملية الهضم المادية يجعل من الصعب تحليل محتوى القناة الهضمية البصرية وعادة ما يخطئ الفريسة جسديا لينة-الكائنات الحية9. لتغذية الأنواع بابتلاع السائل أو لبعض المستهلكين اللافقاريات بشكل مكثف كومينوتي الطعام قبل البلع، مثل أمفيبودس، هو التعرف البصري من الأنواع الفريسة في محتويات القناة الهضمية المستحيل10. بسبب هذه القيود، يوفر التحليل الجزيئي بديلاً واعداً.

التحليلات الجزيئية أصبحت الآن أداة مشتركة للسماح بالكشف عن فريسة السريع والدقيق في محتويات القناة الهضمية. المجموعة من هذه التقنيات المتنوعة: غالباً ما تستخدم استراتيجيات تستند إلى الأجسام المضادة أو بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)، بسبب ما عالية الدقة والحساسية11. تطوير الأجسام المضادة الجديدة هو كثافة الوقت والتكلفة، ولذلك، تطبيق تقنيات جزيئية أخرى مفيد أكثر عندما لا توجد أجسام مضادة بالفعل11. نهج مشترك آخر تضخيم مناطق حمض الخلوي الصبغي (DNA)، مثل الجينات ريبوسومال الحمض النووي الريبي (الرنا) موجودة في معظم الأنواع، استخدام التمهيدي عالمي يحدد12،13. عند استخدام هذا الأسلوب، أنها غالباً ما تكون غير ممكنة لتحديد النطاق الكامل للكائنات الحية فريسة داخل مصادر مختلطة من الحمض الخلوي الصبغي14. نهج فعال لتجنب مثل هذا عيب استخدام التمهيدي المعينة لمجموعة مجموعات لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية. تهدف إلى تضخيم الحمض النووي في مناطق فقط لمجموعات مستهدفة معينة واستبعاد جميع سائر الأنواع15،16، كبسولة تفجير مجموعة محددة يمكن تحديد الكائنات فريسة على المستوى التصنيفي لفئات معينة دون التحليلات الثانوية كثافة الوقت والتكلفة. ومع ذلك، مثل كل القناة الهضمية تحليل المحتوى، توفر هذه التحليلات فقط لقطة من تغذية السلوك. ولذلك، يعتبر الجمع بين تحليل محتوى الأمعاء الجزيئية مع تحليلات لدمج الوقت تتبع الطبيعية (مثل النظائر) مفيد1،2.

وهنا يصف لنا طريقة مفصلة للتحقيقات على أساس PCR التفاعلات الفرائس استخدام مجموعات التمهيدي الخاصة بالمجموعة لمناطق الحمض النووي (المتاشب) ريبوسومال النووية لتكون جنبا إلى جنب مع تحليل النظائر المستقرة للعينة نفسها. يصف لنا الكشف عن الحمض النووي لمجموعات فريسة واحدة عن طريق [اغروس] هلام التفريد. بالإضافة إلى ذلك، نقدم فرصة لمزيد من التحليلات المصب منتجات PCR هذه المجموعة على حدة كبسولة تفجير ينطبق عندما يكون مطلوباً دقة تصنيفية أعلى من خصوصية الإشعال. لأن الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد (ssDNA) شظايا والتشكلات نموذج التعليم العالي التي تتحدد بها تسلسل الأولية17، الاختلافات الصغيرة في شظايا تضخيمه بتلك الخاصة بمجموعة الإشعال تؤدي إلى تغييرات كونفورماشونال. ويمكن الكشف عن هذه التغييرات بجديلة واحدة تحليلات تعدد الأشكال (SSCP) المطابقة مع الجل بولياكريلاميدي17،18، تمكن من تحديد أكثر دقة للكائنات الحية فريسة (وصولاً إلى مستوى الأنواع).

بينما [اغروس] هلام التفريد هو أداة شائعة وغير مكلفة لتصور شظايا من الحمض النووي وتحديد الطول التقريبي19، أن القرار يعتمد على الكمية من الحمض النووي وصبغ المصبوغة تستخدم20. عادة، التصور مستقيمة عند العمل مع عينات الحمض النووي نقية، ولكن يحتمل أن انخفاض كميات من فريسة الحمض النووي في محتويات القناة الهضمية من المستهلكين يمكن أن يعقد التسجيل من [اغروس] هلام التفريد النتائج. لا يزال، هذا الأسلوب الكشف عن عمليا الشاشة عدد قليل من العينات المستهلك من الحقل واحد أو فريسة بعض المجموعات، ولكن تعقيد في التهديف يجعل فحص عدد كبير من العينات للغاية مرة متعددة فريسة الأصناف مكثفة، وبالتالي غير عملي. هو أسلوب كشف أكثر حساسية التحليل الآلي للأجزاء عن طريق التفريد الشعرية، مما يسمح تحديد طول الدقيق من شظايا21بالإضافة إلى ذلك. أظهرت العديد من الدراسات الصغرى على أساس أنه من الممكن باستخدام الأصباغ الفلورية مختلفة كتسميات، لكشف وتحديد أجزاء مختلفة من طول قابلة للمقارنة بشظية الآلي تحليل22،23، 24. ولذلك، أيضا نقدم بروتوكول مفصل لكشف موازية للحمض النووي من فريسة متعددة المجموعات باستخدام PCR مع مجموعات المسماة الخاصة بالفريق التمهيدي والكشف عن طريق تحليل جزء الآلي مع المنظم الآلي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نعرض النتائج دراسة حالة مما يدل على أن الكشف عن فريسة الحمض النووي عن طريق تحليل جزء الآلي هو نهج الذي يتيح أيضا إجراء تقييم كمي نسبي لفريسة بلعها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-جمع ماكروينفيرتيبراتيس من الميدان وإعداد العينات لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية.

ماكروينفيرتيبراتيس
  1. جمع في كل موقع، فرز الأفراد من الأنواع المستهلك من الفائدة في أنابيب مفرد، وتجميدها مباشرة في النتروجين السائل أو الثلج الجاف لمنع إزالة القناة الهضمية وتحلل الحمض النووي-
    ملاحظة: تجنب تخزين العينات في الكحول، لأن بعض ماكروينفيرتيبراتيس تميل إلى اجتر قبل الكحول يقتل منهم-
  2. فقط استخدام القناة الهضمية المتوسطة والكبيرة (حوالي > 3 مم) الأنواع ماكروينفيرتيبراتي بتحليل محتوى الأمعاء الوراثية حيث يمكن استخدام هذه المسألة المتبقية من العينة لإجراءات أخرى (مثل النظائر المستقرة تحليل). لاحظ أن هذا لا ينطبق عند التحقيق في الأصناف الصغيرة جداً مثل عث المياه. ولذلك، يمكن تخطي الخطوات 1.2.1 و 1.2.2.
    1. قليلاً تذويب فرد وتشريح بعناية في المسالك المعدية المعوية تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام الملقط غرامة الفولاذ المقاوم للصدأ. تأكد من عدم ثقب القناة الهضمية لتجنب فقدان هذه المسألة-
      2. ملقط
    2. نظيفة باستخدام حل التطهير لإزالة التلوث الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي بعد إعداد كل المسالك المعدية المعوية. ولذلك، احتضان الملقط لمدة 10 دقائق في حل إزالة التلوث. وبعد ذلك شطف لهم مع الماء المعقم إزالة آثار متبقية والقضاء عليها مع منشفة ورقية خالية من الوبر.
      3. أنبوب
    3. نقل تشريح الجهاز الهضمي بفعل قفل صندوق الأمانات مل 2.0 تحتوي على 440 ميليلتر (450 ممكن ميليلتر لاستخدام ماصة المتكررة) استخراج الملح المخزن المؤقت [سيب؛ م 0.4 كلوريد الصوديوم (NaCl)، 10 مم تريس (هيدروكسيميثيل)-أمينوميثاني هيدروكلوريد (تريس-HCl) pH 8.0، وملح حمض ثنائي الإيثيلين 2 مم يذوي (يدتا) pH 8.0]. إعداد عينات في مخزن − 20 درجة مئوية فورا حتى استخراج الحمض النووي. التأكد من أنه سيتم استخراج الحمض النووي في غضون أيام-
  3. بروتوكول تعديل استخراج الملح عالية 25 استخدام لاستخراج الحمض النووي-
    1. تأخذ عينات من الثلاجة. استخدام الملقط لإضافة حبة واحدة من الفولاذ المقاوم للصدأ 5 مم لكل أنبوبة العينة، وترك العينات المجمدة على مقاعد البدلاء في درجة حرارة الغرفة (RT) لإذابة الجليد. استخدام طاحونة حبة لمجانسة عينات لمدة 1 دقيقة في 15 هرتز-
    2. تدور أسفل عينات مع المدى قصير لأجهزة الطرد المركزي. استخدام الماصات ميكروليتير لإضافة ميليلتر 90 (ممكن لاستخدام ماصة المتكررة 100 ميليلتر) 10% الصوديوم دوديسيل كبريتات الحل (SDS) و 5 ميليلتر من 10 ملغ/مل بروتيناز ك.
    3. دوامة عينات دقيق واحتضان الخلائط ح 1 عند 60 درجة مئوية مع الهز المستمر في 400 دورة في الدقيقة في ثيرموميكسير. بالإضافة إلى ذلك، دقة عينات دوامة كل 10 دقيقة لمواصلة تعزيز تحلل.
    4. تدور أسفل عينات المدى قصير لأجهزة الطرد المركزي، مع إضافة 350 ميليلتر من كلوريد الصوديوم م 5 مع ماصة ميكروليتير ودوامه جيدا لحوالي 0.5-1 دقيقة الطرد المركزي لعينات 40 دقيقة في 16,200 س ز في 5 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا مجموعات متعددة في صف واحد يجب أن يتم، تحديد درجة الحرارة أجهزة الطرد المركزي يجب أن تكون مرتفعة (لا يزيد عن 10 درجة مئوية) قليلاً لأن الحزب الديمقراطي الصربي يميل إلى فلوككولاتي إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جداً-
    5. استخدام ميكروليتير الماصات لنقل حوالي 600 ميليلتر طافية في أنبوب 1.5 مل رد فعل جديد. يجب الحرص على عدم إزالة أي شيء من بيليه.
      6. حبات
    6. الفولاذ المقاوم للصدأ الحافة خارج الأنابيب رد فعل في مصفاة شاي فولاذ المقاوم للصدأ، تنظيفها بالماء الجاري واحتضانها لهم في طبق بتري مع الحل إزالة التلوث عن 10 دقيقة دقة شطف الحل إزالة التلوث معقم المياه وتخزين الخرز تنظيفها في الإيثانول (> 99%، الصف سنوياً) أو الجافة حتى إعادة استخدام.
      ملاحظة: تنظيف الخرز لا تحتاج إلى القيام به في هذه الخطوة مباشرة، ولكن بدلاً من ذلك يمكن أن يتم عندما يكون هناك وقت الانتظار في الخطوات التالية-
    7. إضافة 600 ميليلتر من الايزوبروبانول المثلج (الصف سنوياً) للمادة طافية مع ميكروليتير "الماصة؛" وعناية عكس الأنبوب بضع مرات. تخزين العينات بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
    8. أخذ عينات من الثلاجة والطرد المركزي لهم لمدة 20 دقيقة في 16,200 ز × ودرجة حرارة الغرفة. تجاهل المادة طافية والجاف للأنبوب بعناية مع خالية من الوبر المناديل الورقية بعناية. لاحظ أنه إذا كانت درجة الحرارة المحيطة مرتفعة (أكثر من 25 درجة مئوية) والطرد المركزي في 5 درجة مئوية لتجنب الانزلاق بينما تجاهل المادة طافية الكريات.
      9. أغسل
    9. الكريات المحتوية على الحمض النووي مع الإيثانول 70%. للقيام بهذا، أضف 200 ميليلتر من الإيثانول المثلج (70%، الصف سنوياً) باستخدام ماصة ميكروليتير وأجهزة الطرد المركزي عينات لمدة 10 دقائق في 16,200 س ز ودرجة حرارة الغرفة (أو 5 درجة مئوية، وإذا لزم الأمر). تجاهل المادة طافية والجاف للأنبوب بعناية مع خالية من الوبر المناديل الورقية بعناية. ضبط استخدام ماصة 10 ميليلتر ميليلتر حوالي 8 "الماصة؛" بعناية قبالة المادة طافية المتبقية. تأكد من عدم الإزعاج بيليه.
    10. الجاف بيليه لحوالي 5-20 دقيقة عند 60 درجة مئوية أو في درجة حرارة الغرفة على مقاعد البدلاء حتى يتبخر جميع الإيثانول.
    11. بيليه تذوب في 50-100 ميليلتر نوكلاس خالية (بخار تعقيم ويعامل ديبك) الماء (ddH 2 س)، وانتظر على الأقل 1 ح (على الرغم من أنه سيتم الحصول على نتائج أفضل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية).
    12. قياس كمية الحمض النووي الواردة في كل عينة مع جهاز المطياف الضوئي الصغير الحجم، ووفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. جعل عامل إضعاف كل عينة تحتوي على حوالي 2-10 نانوغرام الحمض النووي/ميليلتر. يبقى الحل المخزون في الثلاجة. يبقى الحل العامل في الثلاجة والتأكد من أن عينة أخرى تتم معالجة قريبا.

2. التحقق من الكفاءة الوظيفية للحمض النووي-مقتطفات للكشف عن اللاحقة فريسة مؤخرا بلعها.

  1. لضمان وجود والكفاءة الوظيفية للقوالب، اختبار كل استخراج الحمض النووي (خطوات 1.1 إلى 1.3.11) التمهيدي عالمي باستخدام مجموعات مناسبة لمصدر المواد الغذائية الخاصة بكل منها (مثلاً اللافقاريات 16 ، 26) التي يتم استهداف فرعية النووي نفسه التمهيدي مجموعة محددة، يستخدم للكشف عن اللاحقة فريسة 25 ، 27. الخطوات التالية تشير إلى استخدام مجموعات عالمية التمهيدي NSF1419/20 و NSR1642/16 16 و LSU D1، D2 fw1 و LSU D1، D2 rev2 أو LSU D1، D2 rev4 26. ليثبت أن رد فعل PCR كانت ناجحة وأنه لم يحدث أي تلوث، استخدم عنصر تحكم الإيجابية التي تحتوي على الحمض النووي بالفعل تم تضخيمها بنجاح ونموذج عنصر تحكم واحد يتضمن ddH 2 س بدلاً من الحمض النووي داخل كل بكر تشغيل-
    1. للتحضير التمهيدي العامل الحلول التي تحتوي تركيز نهائي 10 ميكرومتر من التمهيدي، "الماصة؛" المقدار المناسب من التمهيدي كل الأسهم ddH والحل 2 س (اعتماداً على تركيز حل الأسهم) إلى أنبوب رد فعل جديد 1.5 مل باستخدام ميكروبيبيتيس-
    2. إضافة كبسولة تفجير، مزيج ديوكسينوكليوتيدي (دنتبس)، رد فعل المخزن المؤقت، "بوليميراز الدنا" بوليميراز و ddH 2 س في مل 1.5 أو 2.0 (اعتماداً على عدد العينات بحيث تتم معالجتها) رد فعل الأنبوبة، ثم دوامة هذا الخليط. مجلدات مفصلة الخليط القياسية رد فعل لفعل بكر 10 ميليلتر وترد في الجدول 1 (للاطلاع على مزيد من التفاصيل من المواد الكيميائية المستخدمة، انظر الجدول للمواد)-
      3. استخراج
    3. ميكروليتير استخدام الماصات لنقل كل ميليلتر 1 من الحمض النووي إلى ميليلتر 9 اله رد فعل قياسي المخلوط داخل أنبوب بكر (أو بئر صفيحة PCR). إغلاق الأنبوب رد فعل أو الآبار رد فعل من اللوحة (مع المشارب كاب).
      4. برنامج
    4. ثيرموسيكلير: بروتوكول قياسي لمجموعة التمهيدي 16 NSF1419/20 و NSR1642/16: 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق (تمسخ)، تليها دورات 30 من 94 درجة مئوية لمدة 30 ق، 50 درجة مئوية (درجة حرارة الصلب) لمدة 30 ق، 72 ° ج 90 ثانية، والتمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لتعيين التمهيدي LSU 26، استخدم الأمر التالي: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، تليها دورات 45 94 درجة مئوية 20 s، 52.5 درجة مئوية 20 s، 72 درجة مئوية ل 90 s، وملحق نهائي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 8
    5. أنابيب PCR المكان أو لوحات في ثيرموسيكلير، أغلق غطاء cycler، وبدء برنامج كل منهما.
    6. إعداد 1.5% [اغروس] هلام استخدام الحل المخزن المؤقت الذي يحتوي على قاعدة تريس، الماء المقطر ويدتا (TBE العازلة) و [اغروس]. لإعداد 1.5% [اغروس] هلام، استخدام علبة صب جل مع الأبعاد الكلية من 10 سم × 7.5 سم × 3 سم، تزن ز 0.45 [اغروس] إلى قارورة مخروطية الشكل، استخدم اسطوانة قياس لقياس 30 مل من المخزن المؤقت x TBE 1 (89 مم تريس ، درجة الحموضة 7.6، المقطر 89 مم و 2 مم يدتا، pH 8.0) وصب ذلك في قارورة مخروطية الشكل. بتسخين المخلوط باستخدام ميكروويف. وقف الميكروويف كلما كانت هناك فقاعات الهواء الكبيرة ودوامه في قارورة بعناية حتى الحل إلى مرحلة واحدة فقط-
    7. إلى تهدئة الحل إلى حوالي 60 درجة مئوية، دوامة قارورة في حمام مائي. سرعة صب الحل في درج صب جل وإزالة فقاعات الهواء، وإدراج كومز. انتظر حوالي 20 دقيقة حتى يتم تصلب جل.
    8. تعبئة الوحدة التفريد مع 0.5 x TBE وإدراج جل صب علبة تحتوي على [اغروس] هلام. تأكد من أن فتحات جل أحرار من فقاعات الهواء-
    9. تدور أسفل منتجات PCR باستخدام خيار تشغيل قصيرة الطرد المركزي ميني (لوحة). استخدام ماصة ميكروليتير لخلط كل ميليلتر 3 منتج PCR مع 1 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ (40% السكروز و 0.25% bromophenol الأزرق) وتحميله في فتحات جل من [اغروس] هلام. "الماصة؛" ميليلتر 1.5 سلم الحمض النووي bp 100 في فتحه واحدة لكل سطر مع ماصة ميكروليتير كحجم قياسي. استبدال الغطاء لوحدة التفريد بشكل صحيح والاتصال يؤدي إلى إمدادات طاقة. تشغيل الهلام في 100 V/سم بالنسبة للحد الأدنى 35
    10. لإعداد حمام المصبوغة، صب مل 1,000 1 x TBE في علبة بلاستيكية على شكل مربع غير منفذة للضوء. إضافة 50 ميليلتر اثيديوم بروميد مع ماصة ميكروليتير وإغلاق غطاء علبة بلاستيكية واهتز لضمان التوزيع المتساوي من بروميد اثيديوم.
      11. إزالة الجل من وحدة التفريد
    11. ووضعه في الحمام المصبوغة لمدة حوالي 10 دقائق. ثم تأخذ الجل خارج الحمام المصبوغة ووضعه على نظام توثيق جل وتصور أنه وفقا للدليل.
    12. تحليل العينات الوحيدة التي أظهرت نتائج إيجابية (الأجزاء ذات حجم كاف مرئية في [اغروس] هلام) من حيث الوجود والكفاءة الوظيفية القوالب اللاحقة الكشف عن فريسة مؤخرا بلعها.
< t د > ميكروليتر 0.25
مزيج PCRتركيز العامل الحلميكس ل 10 تفاعل PCR ميليلترالتركيز النهائي في بكر
مهاجم التمهيديميكرومتر 10ميكروليتر 0.50.5 ميكرومتر
رو التمهيدي10 ميكرون0.5 & #956 ؛ ل0.5 ميكرومتر
رد فعل المخزن المؤقت (20 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.55، 16 مم (NH4) 2SO4، وتركيزات النهائي MgCl2 مم 2)ميكرومتر 1ميكروليتر 1ميكرومتر 1
دنتب10 ملم0.25 مم
[تق] [بولمرس]5 يوميكروليتر 0.10.05 يو
ddH 2 0ميكروليتر 6.65
< بهونغ نغ > مجموع المبلغ رد فعل خليطميكروليتر 9
الحمض النوويميكروليتر 1

الجدول 1: تفاصيل بروتوكول لإعداد الخليط القياسية رد فعل لفعل بكر 10 ميليلتر.

3-الكشف عن بنود الأغذية فريسة بلعها مؤخرا مع مجموعات التمهيدي مجموعة محددة باستخدام هلام التفريد.

وصف
  1. إجراء PCR استخدام مقتطفات الحل العامل من الحمض النووي (أعدت وفقا للخطوات 1.1 إلى 1.3.11) ومجموعة التمهيدي الخاصة بالمجموعة في (غير مسمى، أي دون تعديل) المناسبة للفريسة والمجموعة المستهدفة مثل خطوات 2.1.1 إلى 2.1.3 (للاختلافات في خليط رد فعل لمجموعة التمهيدي كل منها، انظر الجدول 2). تشغيل PCR باستخدام البروتوكول القياسي في خطوة 2.1.4 (للصلب درجات الحرارة لمجموعة التمهيدي كل منها، انظر الجدول 2).
    1. استخدام عنصر تحكم واحد مع الحمض النووي نقية من عينة المنتمين إلى المجموعة المستهدفة ذات الصلة (مراقبة إيجابية) ومراقبة سلبية واحدة مع الحمض النووي نقية من أنواع المستهلكين في كل بكر تشغيل-
  2. تحقق نجاح رد فعل PCR باستخدام [اغروس] هلام التفريد هو موضح في الخطوات 2.1.6 إلى 2.1.11. كان رد الفعل PCR ناجح إذا كان جزء من الطول المناسب (انظر الجدول 2) مرئياً لمراقبة إيجابية ولكن ليس لمراقبة سلبية. وإذا لم يتحقق أحد أو كل من هذه المعايير فكرر PCR.
  3. استخدام [اغروس] هلام التفريد، كما هو موضح في الخطوات 2.1.6 إلى 2.1.11، للكشف عن ما إذا كانت قد استهلكت فريسة والمجموعة المستهدفة بالعينات المستهلك المختلفة اختبار (عن طريق الحكم ما إذا كان مرئياً الجزء الطول المناسب أم لا). تأكد من لا يغيب عن شظايا مع منخفضة الدقة البصرية-
  4. منتجات PCR مخزن في 4 درجة مئوية، وإذا كان كذلك التحليلات وسوف يتم خلال 24 ساعة القادمة، أو في-20 درجة مئوية إذا كانت التحليلات التي يتعين القيام بها في وقت لاحق.

4. بعد ذلك تحديد الفريسة المستهلكة كذلك المصب باستخدام تحليل SSCP عبر جل Polyacrylamide.

  1. تحضير هلام اكريلاميد 9% للتفريد SSCP. إعداد الحلول العامل في غطاء مختبر.
    1. لإعداد حل عامل اكريلاميد 200 مل، وملء اسطوانة قياس مع 20 مل 10 x TBE (109 ز قاعدة تريس، 55 غ من الماء المقطر ومل 40 م 0.50 يدتا، pH 8.0 المذابة في 1000 مل ddH 2 س) وآخر واحد مع 45 مل من 40% (فيها) مزيج الاكريلاميد. صب المزيج TBE والاكريلاميد تخرج قارورة (زجاجة زجاج تخرج مع علامة 200 مل أيضا مناسبة هنا) وإضافة ddH 2 س حتى علامة 200 مل. إبقاء العمل الحل في الثلاجة (4 درجات مئوية) حتى المطلوبة. لا تستخدم العامل الحل الأقدم من أسبوع واحد-
    2. تزن 0.1 غرام من فوق كبريتات الأمونيوم (وكالة الأنباء الجزائرية؛ استخدام توازن بدقة ز 0.01 على الأقل) إلى دورق حجمي 1 مل وحل أنه بإضافة ddH 2 س حتى التخرج مناسبة لإعداد حل أسهم APS 10%. نقل مختبرين (حوالي 350 ميليلتر) في أنابيب رد فعل جديد.
      ملاحظة: مطلوب قاسمة واحد لكل جيل بولياكريلاميدي. تخزين اليكو المتبقيةمحطة تكرير النفط في-20 درجة مئوية وتذويب مختبرين إلا قبل وقت قصير من أنها ضرورية.
      3. تشغيل
    3. تجميع كاسيت جل الشبهة من ألواح الزجاج اثنين وواحد فارغ ولوحة زجاج مسنن واحد (كل 20 سم × 20 سم)، مع الفواصل (1.5 مم) بينهما حتى الجانبين من الزجاج. استخدم كل مقاطع ثلاثة إضعاف إلى الوراء (32 مم) على الجانب الأيمن والأيسر يحملق هلام كاسيت ( الشكل 1).
    4. ز 5 مزيج من [اغروس] و 250 مل من المخزن المؤقت x TBE 1 في قارورة مخروطية الشكل لإعداد حل 2% [اغروس] هلام. الحرارة وبعد ذلك يبرد الخليط كما هو موضح في الخطوات 2.1.6 و 2.1.7. سرعة صب الحل في علبة بلاستيكية على شكل مربع (21 سم × 6.5 سم × 5 سم) ثم ضع الطرف الأدنى من كاسيت هلام (الخطوة 4.1.3) إلى الحل [اغروس]. ضبط مقاطع إضعاف إلى الوراء في نهاية الكاسيت جل إلى ارتفاع أقل بحيث كانوا يجلسون على حافة المربع البلاستيك مربع الشكل ( الشكل 1). انتظر حوالي 20-30 دقيقة حتى تماما وقد تصلب التوصيل [اغروس]-
      5. تعبئة من 100 مل قياس الاسطوانة مع الحل العامل اكريلاميد (الخطوة 4.1.1) حتى علامة 60 مل
    5. وصب الحل في كوب. استخدام ميكروبيبيتي إضافة 300 ميليلتر من قاسمة واحد الحل APS الأسهم (الخطوة 4.1.2) وبعد ذلك إضافة ميليلتر 37.5 من تيتراميثيليثيلينيدياميني (تيميد). سرعة، من أجل الحل بين ألواح الزجاج للكاسيت هلام. وبدلاً من ذلك، ضخ الحل بين ألواح الزجاج بحقنه المتاح 100 مل مع تلميح ماصة ميليلتر 1,000 المعدلة لرئيس حقن حقنه.
    6. بعناية إدراج مشط قياسية سميكة 1.5 مم في نهاية العليا بين ألواح الزجاج. يجب أن تكون محاطة المشط بحل بولياكريلاميدي. انتظر حوالي 1 ح حتى يتم بلمرة هلام بولياكريلاميدي. تجنب التهوية خلال البلمرة قدر الإمكان لأنه يزيد من الوقت اللازم للهلام بلمرة.
      ملاحظة: من الممكن لتخزين المواد الهلامية مسبوك داخل أكياس بلاستيكية محكمة الإغلاق مع أنسجة رطب في الثلاجة ما يصل إلى 3 أيام-

figure-protocol-1
رقم 1: صورة توضح البناء صب المواد الهلامية بولياكريلاميدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. وضع كاسيت هلام، التي تحتوي على هلام polyacrylamide على استعداد، في وحدة التفريد رأسي. تعبئة الوحدة التفريد مع المبلغ المناسب (اعتماداً على نوع وحدة التفريد) 0.5 x TBE وباردة الوحدة وصولاً إلى 10 درجات مئوية باستخدام مدوار مبردة.
  2. تمسخ الحمض النووي، يسخن الكتلة الحرارية/-cycler إلى 96 ° تحضير جيم تمسخ المخزن المؤقت مع 95% ميثلامين (99.5 في المائة سنوياً الصف) و 5% محلول مائي يحتوي على 0.25% بروموفينول الأزرق والسكروز 40% (w/v)-
  3. منتجات PCR خارج البراد أو الثلاجة وإذابة الثلج منها. تدور أسفل منتجات PCR باستخدام خيار تشغيل قصيرة الطرد المركزي ميني (لوحة). ثم يخلط كل ميليلتر 4 منتج PCR 4 ميليلتر من تمسخ المخزن المؤقت. حرارة خليط لمدة 5 دقائق في 96 درجة مئوية متبوعاً مباشرة بخطوة تبريد في الماء المثلج للحد الأدنى 10
    ملاحظة: يجب تحميل عينات على جل polyacrylamide (الخطوة 4، 5) فورا بعد هذا-
  4. إزالة مشط من جل polyacrylamide (الخطوة 4.1.6) واستخدام ميكروبيبيتي لتحميل كل عينة تماما في فتحه جل. تشغيل التفريد في 8 ث كل جل بينما التبريد باستمرار وحدة التفريد إلى 10 ° "جيم تشغيل" الوقت اللازم يعتمد على حجم الأجزاء في فصله. لأحجام جزء من ما يقرب من 210 شركة بريتيش بتروليوم، وقت تشغيل حوالي 3.5 ساعة تعتبر ملائمة.
  5. لإعداد حمام المصبوغة، صب مل 1,000 س 1 TBE إلى بلاستيك على شكل مربع مربع غير منفذة للضوء وإضافة 30 ميليلتر لتلطيخ صبغ (مناسبة وصمة عار واحد الذين تقطعت بهم السبل من الحمض النووي) مع ماصة ميكروليتير. أغلق غطاء علبة بلاستيكية واهتز لضمان التوزيع المتساوي لصبغ المصبوغة.
  6. إزالة كاسيت جل من الدائرة الكهربي وفصل لوحة زجاج مسنن بعناية عن الهلام. الشريحة جل polyacrylamide من لوحة زجاج فارغة في الحمام المصبوغة. ضع حمام المصبوغة على جل يهز منصة ووصمة عار لمدة 20 إلى 30 دقيقة مع الرج المستمر-
  7. أخذ الجل بعناية خارج الحمام المصبوغة ووضعه على طاولة الأشعة فوق البنفسجية نظام الوثائق.
    ملاحظة: بسبب عدم استقرار الجل من المستصوب للتعامل مع الخطوة السابقة مع اثنين من الناس. شخص واحد ينبغي أن تعقد حمام المصبوغة بجوار الجدول الأشعة فوق البنفسجية وواحد آخر ينبغي التوصل إلى إطار هلام بكلتا يديه، واعتبر خارجاً، والانزلاق إلى الطاولة الأشعة فوق البنفسجية-
  8. بإغلاق الغطاء أو الباب نظام الوثائق والتقاط صورة وفقا للشركة المصنعة ' دليل التعليمات s-

5. كشف متعددة تناولها مؤخرا مجموعات فريسة في نفس الوقت باستخدام تحليلات يفتت الآلي.

  1. تحليل محتوى الأمعاء الحمض النووي تستخرج التمهيدي 16 مجموعة محددة باستخدام مجموعات معينة في الجدول 2، مع أول كتاب واحد من مجموعة وصفت بسبب التعديل مع صبغة المصبوغة (انظر الجدول 2 العمود عنوان التعديل)، واستخدام أساليب الكشف عن متوازي من المنظم الآلي.
    1. استخدام حل العامل مقتطفات الحمض النووي (أعدت وفقا للخطوات 1.1 إلى 1.3.11)، وإجراء فصل تقارير إتمام المشروعات للتمهيدي كل مجموعة مثل هو موضح في الخطوات 2.1.1 ل 2.1.5 (الاختلافات في الخليط ترد في الجدول 2). استخدم عنصر تحكم واحد على الأقل مع الحمض النووي نقية من عينة المنتمين إلى المجموعة المستهدفة ذات الصلة (مراقبة إيجابية) ومراقبة سلبية واحدة مع الحمض النووي نقية من أنواع المستهلكين في كل بكر تشغيل-
    2. "تشغيل تقارير إتمام المشروعات" في ثيرموسيكلير استخدام بروتوكول PCR القياسية في خطوة 2.1.4، ضبط درجة الحرارة انلينغ كل منهما (وعدد الدورات) للتمهيدي كل مجموعة معينة في الجدول 2-
      ملاحظة: استخدام نفس الحمض النووي تخصيص الآبار رد فعل للألى PCR مع كل مجموعة من مجموعات مختلفة من التمهيدي 16 تبسيط اللاحقة تجميع منتجات PCR لمجموعات التحاليل يفتت.
    3. "بكر تخزين" المنتجات في-20 درجة مئوية حتى جميع تقارير إتمام المشروعات المنتمين إلى دفعة واحدة للانتهاء من التحليلات يفتت الآلي (انظر الجدول 2). تبقى منتجات PCR في الظلام وعدم تخزينها أطول من أسبوع واحد قبل تحليلات يفتت.

figure-protocol-2
الجدول 2: تفاصيل دفعات 2 من 15 الخاصة بالفريق التمهيدي أزواج أنشأت كوستر et al. (2013) وزوج التمهيدي Jae28S المصممة حديثا تضخيم مناطق المتاشب 18S أو 28S 16 للمجموعات المستهدفة من ماكروينفيرتيبراتيس المائية. و من الإشعال إلى الأمام؛ r، عكس الإشعال؛ 18S، التمهيدي أهداف فرعية المتاشب 18S؛ 28S، يستهدف التمهيدي في 28S المتاشب وحدة فرعية. " هيدروبيولوجيا، هو فيلوسوس ديكيروجاماروس (قشريات، جاماريداي) ' الجمبري القاتل ' في منظومة "نهر الراين"؟، 768، 2016، الجدول S1، مواد تكميلية الصفحة 2، ميكي كوستر، باستيان باير، رينيه جرجس، (© سبرينغر الدولي نشر سويسرا عام 2015) " بإذن سبرينغر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

  1. للكشف عن أجزاء مكبرة من كافة التمهيدي 16 مجموعات إجراء تحليلات يفتت الآلي في دفعات 2 الواردة في الجدول 2. استخدام معيار حجم داخلي (الحمض النووي الحجم القياسي كيت--400 [دفعة ب] و-600 [مجموعة A]، على التوالي) لتحديد طول جزء. إعداد لوحة التتابع والتسلسل التلقائي كما هو موضح في الخطوات التالية. علما بأن هذا الإجراء قد يمكن تعديلها إذا كان استخدام منصة أخرى من تلك الواردة في "الجدول المواد"-
    1. لتشغيل كل دفعة عينة، إعداد خليط يحتوي على الحل تحميل عينة (سلس) وحجم كل منهما القياسية. "الماصة؛" 21.6 ميليلتر من سلس وميليلتر 0.4 من "الحمض النووي الحجم القياسي كيت"-600 كل عينة من المجموعة (أ) وعلى التوالي، 21.7 ميليلتر من سلس وميليلتر 0.3 من "الحمض النووي حجم المجموعة القياسية"- 400 كل عينة من "المجموعة باء"
    2. منتجات PCR تقارير إتمام المشروعات 8 المنتمين إلى كل دفعة من الثلاجة وإذابة الثلج منها. ضمان أن تكون مسجونة لا يزال في الظلام-
    3. استخدام ماصة ميكروليتير لتحميل العدد الآبار للوحة تسلسل المطلوبة (عدد عينات تحليلها) مع كل ميليلتر 22 من الخليط كل منهما هو موضح في الخطوة 5.2.1. تدور أسفل المنتجات بكر كل من 8 تقارير إتمام المشروعات باستخدام خيار تشغيل قصيرة الطرد المركزي ميني (لوحة). نقل كل ميليلتر 1 كل منتج PCR كل من تقارير إتمام المشروعات 8 في آبار كل منهما لصفيحة التسلسل مع ماصة ميكروليتير.
      4. وتدور أسفل هذا الخليط داخل لوحة التسلسل مع المدى قصير من لوحة مصغرة للطرد المركزي
    4. بعناية تراكب كل من الآبار التي تستخدم مع قطره واحدة من الزيوت المعدنية. سد الآبار رد فعل كل منهما لصفيحة المخزن المؤقت مع 250-300 ميليلتر من المخزن المؤقت لفصل الحمض النووي-
    5. استخدام البرمجيات لجهاز التسلسل الشعرية لإنشاء "إعداد عينة" وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. تعيين أساليب التحكم في مجموعات عينة وتحديد تسلسل أساليب لاستخدامها في معالجة البيانات (انظر الجدول 3 لتشغيل ظروف ملائمة للاستخدام مع الحجم القياسي في الجدول المواد). علما بأن من الأهمية بمكان أن توزيع العينات داخل "إعداد نموذج" يطابق تخصيص عينة في لوحة التسلسل (بما في ذلك عناصر إيجابية وسلبية، راجع الخطوة 5.1.1) وأن يحلل الأسلوب الملائم لجزء مع كل منهما يتم اختيار حجم قياسي.
    6. ملء علبة ترطيب مع المياه وإدراج تسلسل لوحة، لوحة المخزن المؤقت وعلبة التبول في التسلسل الشعرية. إدراج خرطوشة جل يحتوي على كمية كافية من الطازجة هلام فصل الحمض النووي الذي يعتبر ضروريا لتشغيل العينة. تشغيل تسلسل لوحة باستخدام "الإعداد عينة" استعداد.
التي
تؤذي منفصلة الشعرية حقن
درجة الحرارةوقتالجهدالوقتالجهدالوقت
حجم 600 القياسي90 درجة مئوية120 s4.8 كيلو فولت60 دقيقة50 درجة مئوية انتظر Temp: نعم2.0 كيلو فولت30 s
حجم قياسي 40090 درجة مئوية120 s6 كيلو فولت45 دقيقة50 درجة مئوية انتظر Temp: نعم2.0 كيلو فولت30 s

الجدول 3: شروط محددة لتحليلات يفتت عليها المنظم الآلي باستخدام معايير الحجم الواردة في "الجدول المواد".

  1. لتحليل النتائج تصدير البيانات الخام، وإيداع تلك البيانات إلى برنامج تحليل الشظايا. اختر القياسية صبغ لون أوامر من الشركة المصنعة لكل منها مجموعة قنوات لون الصبغة.
    1. إنشاء مجموعات لوحة تحدد النطاق المتوقع لطول الجزء تضخيم بالتمهيدي الخاصة بمجموعة واحدة ضمن دفعة وفقا لدليل المستخدم للبرنامج-
      2. حدد الفريق كل منهما ومعيار الحجم المناسب، والألوان القياسية، ونوع من التحليل
    2. لمعالجة البيانات، وتشغيل الإجراء. اختر خيار اليكتروفيروجرام عرض كثافة إشارة الفلورسنت من الصكوك التفريد الشعرية كعملية تتبع خط واحد لكل لون صبغة. سيتم عرض مجموعات علامات/التمهيدي التي تشير إلى نطاق جزء منها وسيتم تمييز الضبط طول الجزء المكتشف المرتبطة بمركز كل ذروة يسمى (في معظم البرامج التي تلون أو الاسم المعين) تلقائياً.
    3. لكل عينة، حساب مدى قرب العينة ' s الداخلية حجم قياسي يتطابق مع معيار الحجم المحدد طمأنة نجاح الدعوة إلى الحجم. معظم البرامج تحليلات يفتت لديها خيار تلقائياً حساب ووضع تصور لهذه المباراة. إذا فشل استدعاء الحجم، كرر يفتت تحليلات لتلك العينات.
    4. بصريا إعادة فحص اليكتروفيروجرام لكل عينة وتأكيد أونكونفيرم ذروة كل طالب للعلامة/التمهيدي كل مجموعة على حدة. إدراج قمم لا مبرر لها التي تتناسب مع معايير مجموعة علامة/التمهيدي أو حذف منها خاطئة وفقا لدليل المستخدم للبرنامج المستخدم يدوياً. تطبيق اسم زوج قاعدي في الحجم أو بن ' "تسمية اليل" '. حساب وعرض مواصفات الذروة في ' "الجدول ذروة" '.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أننا استخدمت بنجاح الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول لتحليل النظام الغذائي ضمن دراسات مختلفة. في هذا القسم، نقدم أمثلة تصف مدى انطباق مقاطع مختلفة من البروتوكول.

وكمثال على ذلك، أجريت تجربة تغذية لإثبات فعالية مجموعات التمهيدي المعينة لمجموعة أنشأها المؤلف28 وإمكانات المزيد من التحليلات المصب من منتجات PCR بتحليلات SSCP،. تم القبض على أفراد من فيلوسوس ديكيروجاماروس كالحيوانات المفترسة واليرقات s...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهنا نقدم طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة للتصميم القائم على بكر من التفاعلات الفرائس من العينات الميدانية عن طريق الإشعال الخاصة بالمجموعة لمناطق المتاشب، التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع غيرها من التحليلات غير الجزيئية للعينة نفسها. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول. أولاً، من الضروري ضمان خصوصية الإشعال المستخدمة. ثانيا، من المهم تجنب التلوث وفقدان المواد محتوى الأمعاء أثناء إعداد القناة الهضمية واستخراج الحمض النووي اللاحقة. بينما يمكن أن يؤدي التلوث عبر عينة للكشف إيجابية كاذبة من الحمض النووي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر كلاسين سيلك من معهد البحوث لتحليل النظام الإيكولوجي وتقييم (جايك)، "الجامعة التقنية الراينية آخن" لمساعدتها في إنشاء مجموعات التمهيدي المجموعة الخاصة المستخدمة في هذا البروتوكول. ونشكر أيضا بيتر مارتن ولورا شيناوا من جامعة كيل للتعاون في تجارب المياه العث. ونشكر أيضا مساعدين مختبر تقني لحفظ المختبر بسلاسة، وإعداد سجل الشركات وأرقام فهرس. وأيد هذا العمل "مؤسسة البحوث الألمانية" (DFG؛ المشروع "شركة جنرال الكتريك" 2219/3-1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
النيتروجين السائلأيNAلنقل العينات الميدانية من اللافقاريات الكبيرة إلى المختبر.
أنابيب تفاعل 1.5 مل - SafelockAnyNAلجمع عينات المستهلك في الحقل والحفظ اللاحق في أنابيب تفاعل النيتروجين السائل لا تحتاج بالضرورة إلى أن تكون PCR نظيفة. لتجنب انفجار الأنابيب ، يجب ثقب غطاء الأنابيب بإبرة.
المجهر المجهريأيNAتأكد من أن التكبير مناسب لإعداد الجهاز الهضمي بحجم المستهلك الذي يثير اهتمامه.
أطباق بتريأيNAلتشريح الجهاز الهضمي للعينات الاستهلاكية تحت منظار الميكروسيوم.
بؤر من الفولاذ المقاوم للصدأ: ملقط دومون رقم 7BioformB40dيمكن أن تكون ملقط الفولاذ المقاوم للصدأ المنحني هذا في بعض الأحيان حلزة جدا لتثبيت العينة بين الجزء المنحني دون ثقب الجهاز الهضمي.
بؤر الفولاذ المقاوم للصدأ: ملقط دومون الإلكتروني رقم 5BioformB40bملقط الفولاذ المقاوم للصدأ الناعم هذا مناسب بشكل مثالي لتحضير الجهاز الهضمي للعينات الاستهلاكية.
DNA-ExitusPlusAppliChemA7409،1000RFمحلول إزالة التلوث لإزالة تلوث الحمض النووي والحمض النووي الريبي
منشفة ورقية خالية من الزغبأي
LabدقةNA0.01 جم على الأقل.
ماصات ميكرولتر (0.5-10 / 10-100 / 50-200 / 100-1000 مو ؛ ل)أي
أنابيب NA Safe-Lock 2.0 ملVWR211-2165من الأهمية بمكان أن تكون أنابيب السير هذه خالية من مثبطات الحمض النووي و DNase و RNase و PCR (تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيف)!
أنابيب القفل الآمن 1.5 ملVWR211-2164من الأهمية بمكان أن تكون أنابيب السير هذه خالية من مثبطات الحمض النووي وDNase و RNase و PCR (PCR نظيف)!
كلوريد الصوديوم &GE ؛ 99.5٪ ، سنويا ، ACS ، ISOcarlroth3957.3للمخزن المؤقت لاستخراج الملح (SEB) ومحلول 5M كلوريد الصوديوم المطلوب لاستخراج الحمض النووي.
تريس (هيدروكسي ميثيل) -أمينوميثان تريسكارلروث4855.2لماصات استخراج الملح (SEB) وماصات ميكرولتر عازلة TBE
(0.5-10 / 10-100 / 50-200 / 100-1000 & mu; L)carlroth8043.1لمخزن استخلاص الملح (SEB) و TBE عازلة
حمض البوريك & ge ؛ 99.8٪ ، سنويا ، ACS ، ISOcarlroth6943.2للمخزن المؤقت TBE. غير مطلوب إذا تم الحصول على مخزن مؤقت TBE متاح تجاريا.
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)كارلروث4360.1لاستخراج
البروتيناز DNA K lyophil.كارلروث7528.1تحضير محلول عمل يحتوي على 10 مجم / مل.
الخرز TissueLyser IIQuiagen85300لتجانس العينات.
حبات الفولاذ المقاوم للصدأ ، 5 ممQuiagen69989لتجانس العينات.
تسخين thermoshakerأي
NA خلاط دوامةأي
مبرد هيماك CT 15 REهيتاشيNAيستخدم للطرد المركزي أثناء استخراج الحمض النووي (البروتوكول 1).
الأيزوبروبانولكارلروث6752.5
الإيثانول 99.8٪ ، سنويا.أي
(ddH2< / sub>O)AppliChemA7398،1000النوكلياز (معقمة تيار ومعالجة DEPC) تستخدم لإعادة تعليق الحمض النووي وكلما تمت الإشارة إليها إلى ddH2< / sub>O داخل المخطوطة
OlegonucleotidesEurofins MWG OperonNAPrimers غير المسمى
olegonucleotides المعدلةبادئات Metabion International AGNAالمسماة
peqGOLD Taq شاملةVWR Peqlab01-1000Taq شاملة كليا لمخاليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (عازلة التفاعل Y و S و dNTPs و MgCl2) Primus
96 Thermocycler المتدرج المتقدم أو peqStar96x التدرج العالميPeqlabNAتم إنشاء مجموعات التمهيدي في الأصل على جهاز التدوير الحراري المتدرج المتقدم Primus 96. نظرا لأن هذا الدراجة كان قديما جدا ، فقد تحققنا مما إذا كانت مجموعات التمهيدي الخاصة بنا فعالة ومحددة في ظل نفس الظروف باستخدام peqSta96x (والذي يمكنه أيضا محاكاة النموذج القديم). ومع ذلك ، أظهرت الاختبارات أن بادئاتنا تعمل بشكل جيد ولا تزال محددة (انظر Koester et al. 2013) دون استخدام محاكاة الجهاز القديم.
ألواح PCR القياسية 96 جيداVWR Peqlab732-2879تستخدم لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
خطوط أنبوبية منخفضة المستوى 0.15 مل مع خطوط غطاء مسطحVWR Peqlab732-3223خطوط غطاء تستخدم لإغلاق لوحات PCR.
AgarosePeqlab35-1020يستخدم للرحلان الكهربائي للهلام.
الميكروويفأي
أي
أي
والأمشاط ذات الصلة بالأسنانأيNAللرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
مزود طاقة الرحلان الكهربائي PS3002Life TechnologiesNA
محلول بروميد الإيثيديوم 1٪carlroth2218.1يستخدم لتحضير حمام تلطيخ لمواد هلامية الاغاروز.
فورماميدكارلروث6749.1مطلوب للمخزن المؤقت للتمسخ لتحليلات SSCP.
برومفينول الأزرقAppliChemA3640.0010مطلوب لصبغة التحميل للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
السكروزكارلروث4621.1مطلوب لصبغة التحميل للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
100 نقطة أساس - الحمض النووي - سلم ممتدكارلروثT835.1كمعيار حجم للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
نظام التوثيق للأشعة فوق البنفسجيةأيNAلتصور نتائج الرحلان الكهربائي للهلام.
Rotiphorese NF-Acrylamide / Bis-solution 40٪ (29: 1)carlrothA121.1لتحضير المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
بيروكسي دي كبريتات الأمونيومكارلوث9592.2لإعداد المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
مقاطع قابلة للطي (32 مم)أيNAلإعداد المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
صندوق بلاستيكي مربع الشكل (21 مرة ؛ 6.5 مرة ؛ 5 سم)أيNAلتحضير جل بولي أكريلاميد.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)carlroth23.67.1لتحضير المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
دورقأيNA
RC 10 مبرد رقميVWR462-0138لتحليلات SSCP باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد.
وحدة الرحلان الكهربائي العمودي P10DS (أنظمة فصل البوم) VWR700-2361لتحليلات SSCP باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.
صفيحة زجاجية مسننةVWR730-0261لتحليلات SSCP باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.
صفيحة زجاجية فارغةVWR730-0260لتحليلات SSCP باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.
الفواصلVWR 730-0262لتحليلات SSCP باستخدام الرحلان الكهربائي لجل بولي أكريلاميد.
مشط مع 25 سناVWR730-0294لتحليلات SSCP باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.
منصة اهتزازأيNAللاهتزاز المستمر لحمام تلطيخ.
الحمض النووي GelStar (Lonza Rockland، Inc.)Biozym850535 (50535)لتلوين المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
مجموعة أدوات قياس الحمض النووي القياسية GenomeLab 400bpAB Sciex608098لتحليلات الشظايا الآلية. حجم ستانارد للدفعة ب.
مجموعة أدوات قياس الحمض النووي القياسية GenomeLab 600bpAB Sciex608095لتحليلات الشظايا الآلية. حجم ستانارد للدفعة أ.
حل تحميل العينة (SLS)AB Sciex608082لتحليلات الأجزاء الآلية.
لوحة التسلسل - 96 Well Polypropylene PCR MicroplateCostar6551لتحليلات الشظايا الآلية.
جهاز طرد مركزي للوحة ،VWR PeqlabNAيستخدم لتدوير منتجات PCR.
لوحة عازلة - 96 بئر EIA / RIA البوليسترين ذو القاع المسطح الشفاف غير المعالجCorning9017لتحليلات الشظايا الآلية.
GenomeLab Seperation bufferAB Sciex608012لتحليلات الشظايا الآلية.
جل الفصل - LPAIAB Sciex608010لتحليلات الشظايا الآلية.
Sequenzer - نظام التحليل الجيني CEQ8000Beckman CoulterNAلتحليلات الشظايا الآلية.
GeneMarker V1.95SoftgeneticsNAلتحليل نتائج تحليلات الشظايا الآلية.
مقياس NA يجب أن تكون مطحنة جهاز طرد مركزي مبرد NA: جهاز طرد مركزي درجة من البيولوجيا الجزيئية للمياه في NA خالية من قارورة مخروطية NA أسطوانة قياس NA وحدة الرحلان الكهربائي الأفقي NA صبغة جهاز طرد مركزي صغير PerfectSpin P

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carreon-Martinez, L., Heath, D. D. Revolution in food web analysis and trophic ecology: diet analysis by DNA and stable isotope analysis. Mol Ecol. 9 (1), 25-27 (2010).
  2. Hardy, C. M., Krull, E. S., Hartley, D. M., Oliver, R. L. Carbon source accounting for fish using combined DNA and stable isotope analyses in a regulated lowland river weir pool. Mol Ecol. 19 (1), 197-212 (2010).
  3. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Saunders, W. C. Tangled webs: reciprocal flows of invertebrate prey link streams and riparian zones. Freshwater Biol. 50 (2), 201-220 (2005).
  4. Baxter, C. V., Fausch, K. D., Murakami, M., Chapman, P. L. Fish invasion restructures stream and forest food webs by interrupting reciprocal prey subsidies. Ecol. 85 (10), 2656-2663 (2004).
  5. Traugott, M., Kamenova, S., Ruess, L., Seeber, J., Plantegenest, M. Empirically Characterising Trophic Networks: What Emerging DNA-Based Methods, Stable Isotope and Fatty Acid Analyses Can Offer. Adv. Ecol. Res. Vol 49: Ecological Networks in an Agricultural World. 49, Elsevier Academic Press Inc. 177-224 (2013).
  6. Diaz Arredondo, M. A., Guzman del Proo, S. A. Feeding habits of the spiny lobster (Panulirus interruptus Randall, 1840) in Bahia Tortugas, Baja California Sur. Cienc Mar. 21 (4), 439-462 (1995).
  7. Letourneur, Y., Galzin, R., Harmelin-Vivien, M. Temporal variations in the diet of the damselfish Stegastes nigricans (Lacepède) on a Réunion fringing reef. J Exp Mar Biol Ecol. 217 (1), 1-18 (1997).
  8. Akin, S., Winemiller, K. O. Seasonal variation in food web composition and structure in a temperate tidal estuary. Estuar Coast. 29 (4), 552-567 (2006).
  9. Redd, K. S., Jarman, S. N., Frusher, S. D., Johnson, C. R. A molecular approach to identify prey of the southern rock lobster. Bull Entomol Res. 98 (3), 233-238 (2008).
  10. Gergs, R. Dreissena polymorpha in Lake Constance: An example of a keystone engineer? Universität Konstanz. , (2009).
  11. Sheppard, S. K., Harwood, J. D. Advances in molecular ecology: tracking trophic links through predator-prey food-webs. Funct Ecol. 19 (5), 751-762 (2005).
  12. Jarman, S. N., Ward, R. D., Elliott, N. G. Oligonucleotide primers for PCR amplification of coelomate introns. Mar Biotechnol (NY). 4 (4), 347-355 (2002).
  13. Verma, S. K., Singh, L. Novel universal primers establish identity of an enormous number of animal species for forensic application. Mol Ecol Notes. 3 (1), 28-31 (2003).
  14. Deagle, B. E., et al. Molecular scatology as a tool to study diet: analysis of prey DNA in scats from captive Steller sea lions. Mol Ecol. 14 (6), 1831-1842 (2005).
  15. Jarman, S. N., Deagle, B. E., Gales, N. J. Group-specific polymerase chain reaction for DNA-based analysis of species diversity and identity in dietary samples. Mol Ecol. 13 (5), 1313-1322 (2004).
  16. Jarman, S. N., Redd, K. S., Gales, N. J. Group-specific primers for amplifying DNA sequences that identify Amphipoda, Cephalopoda, Echinodermata, Gastropoda, Isopoda, Ostracoda and Thoracica. Mol Ecol Notes. 6 (1), 268-271 (2006).
  17. Hayashi, K., Yandell, D. W. How sensitive is PCR-SSCP? Hum Mutat. 2 (5), 338-346 (1993).
  18. Glavač, D., Dean, M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations. Hum Mutat. 2 (5), 404-414 (1993).
  19. Mülhardt, C. Der Experimentator Molekularbiologie / Genomics. , 7th ed, Spektrum Akademischer Verlag. Heidelberg. (2013).
  20. Lee, S. V., Bahaman, A. R. Discriminatory Power of Agarose Gel Electrophoresis in DNA Fragments Analysis. Gel Electrophoresis - Principles and Basics. , InTech. (2012).
  21. Wang, X. W., et al. A new electrophoresis technique to separate microsatellite alleles. Afr J Biotechnol. 8 (11), 2432-2436 (2009).
  22. Gemmer, I., Gergs, R. Characterization of the first twelve microsatellite loci for the amphipod Gammarus roeselii (Crustacea: Amphipoda). Conserv Genet Resour. 5 (4), 955-957 (2013).
  23. Olafsson, K., Hjorleifsdottir, S., Pampoulie, C., Hreggvidsson, G. O., Gudjonsson, S. Novel set of multiplex assays (SalPrint15) for efficient analysis of 15 microsatellite loci of contemporary samples of the Atlantic salmon (Salmo salar). Mol Ecol Resour. 10 (3), 533-537 (2010).
  24. Baric, S., Hollrigl, A., Fureder, L., Petutschnig, J., Dalla Via, J. First analysis of genetic variability in Carinthian populations of the white-clawed crayfish Austropotamobius pallipes. Bull. Fr. Peche Piscicult. (380-381), 977-990 (2006).
  25. Koester, M., Gergs, R. No evidence for intraguild predation of Dikerogammarus villosus (Sowinsky, 1894) at an invasion front in the Untere Lorze, Switzerland. Aquat Invasions. 9 (4), 489-497 (2014).
  26. Sonnenberg, R., Nolte, A. W., Tautz, D. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Front Zool. 4 (6), 6(2007).
  27. Koester, M., Bayer, B., Gergs, R. Is Dikerogammarus villosus (Crustacea, Gammaridae) a 'killer shrimp' in the River Rhine system? Hydrobiologia. 768 (1), 299-313 (2016).
  28. Koester, M., Claßen, S., Gergs, R. Establishment of group-specific PCR primers for the identification of freshwater macroinvertebrates. Conserv Genet Resour. 5 (4), 1091-1093 (2013).
  29. Martin, P., Koester, M., Schynawa, L., Gergs, R. First detection of prey DNA in Hygrobates fluviatilis (Hydrachnidia, Acari): a new approach for determining predator-prey relationships in water mites. Exp Appl Acarol. 67 (3), 373-380 (2015).
  30. Deagle, B. E., et al. Studying Seabird Diet through Genetic Analysis of Faeces: A Case Study on Macaroni Penguins (Eudyptes chrysolophus). PLoS One. 2 (9), e831(2007).
  31. Sint, D., Niederklapfer, B., Kaufmann, R., Traugott, M. Group-Specific Multiplex PCR Detection Systems for the Identification of Flying Insect Prey. PLoS One. 9 (12), e115501(2014).
  32. Zarzoso-Lacoste, D., Corse, E., Vidal, E. Improving PCR detection of prey in molecular diet studies: importance of group-specific primer set selection and extraction protocol performances. Mol Ecol Resour. 13 (1), 117-127 (2013).
  33. Vestheim, H., Jarman, S. Blocking primers to enhance PCR amplification of rare sequences in mixed samples - a case study on prey DNA in Antarctic krill stomachs. Front Zool. 5 (1), 12(2008).
  34. Harper, G. L., et al. Rapid screening of invertebrate predators for multiple prey DNA targets. Mol Ecol. 14 (3), 819-827 (2005).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DNA PCR SSCP

مقالات ذات صلة