مقالة منهجية

قياس التغيرات في فيفو في خارج الخلية العصبية أثناء الطبع مكافأة السلوكيات في أنثى الهامستر السوري

DOI:

10.3791/56135

⸱

سبتمبر 12, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota, 3Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الورقة بالتفصيل استخدام تسجيلات أمبيروميتريك إمكانات ثابتة باستخدام ألياف الكربون أقطاب والتكنولوجيا الانزيمية بيوسينسور لقياس إطلاق الدوبامين وغلوتامات مع عالية الدقة الزمنية خلال السلوك الطبيعي مجزية في الهامستر الأنثى.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على قياس الإفراج العصبي على مقياس زمني سريع يسمح أنماط كبيرة مرتبطة بسلوكيات معينة أو التلاعب؛ أداة قوية في توضيح آليات والدوائر الأساسية. بينما استخدمت تقنية ميكرودياليسيس لعقود لقياس ما يقرب من أي أكثر من الفائدة في الدماغ، يقتصر هذا الأسلوب في الأزمنة. وبدلاً من ذلك، مسح سريعة فولتاميتري دوري كل وقتيا دقيقة وحساسة للغاية؛ ومع ذلك، نظراً لأن هذا الأسلوب صعباً من الناحية التقنية يعتمد على اليكترواكتيفيتي لأكثر الفائدة، هو القضاء على احتمال للكشف عن المواد نونيليكترواكتيفي (مثلاً، غلوتامات العصبي). هذه الورقة تفاصيل استخدام نظام تسليم المفتاح الذي يجمع بين الإمكانات الثابتة أمبيروميتري وبيوسينسينج الانزيمية لقياس العصبية اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي مع الدقة الزمنية. الاقتران من هذه التقنيات القوية هما يسمح بقياس منشط وطوريه كبيرة بسهولة نسبية، ويسمح بتسجيل من العصبية متعددة في وقت واحد. والهدف من هذه المخطوطة لإثبات عملية قياس الدوبامين وغلوتامات كبيرة في فيفو استخدام سلوك الطبيعي مجزية (أي، السلوك الجنسي) في اليرانب الإناث، مع الهدف النهائي المتمثل في عرض الجدوى التقنية لهذا التحليل لدراسة السلوكيات والنماذج التجريبية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على قياس الإفراج العصبي في الحيوانات يتصرف مستيقظا يسمح للباحثين الربط بين سلوكيات معينة مع الأنماط المكانية والزمانية لكبيرة أداة قوية للتحقيق في الآليات والدوائر الأساسية لكلا الطبيعية والسلوك استثابي في الوقت الحقيقي. تاريخيا، استخدمت ميكرودياليسيس لقياس المواد المتفاعلة كهربائياً ونونريكتيفي في الوسط خارج الخلية من الدماغ1. ويستخدم هذا الأسلوب تدفق مستمر من محلول مائي لتكوين الأيونية مماثل للسوائل خارج الخلية، من خلال تحقيق ميكرودياليسيس تتألف من رمح صغير مع تلميح مصنوع من غشاء الألياف المجوفة سيميبيرميابل2. بعد إدراج التحقيق، العصبية أو التحاليل الأخرى التي تهم يمكن عبور الغشاء سيميبيرميابل بنشر السلبي قبل يجري جمعها كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك])، وعلى فترات متقطعة للتحليل اللاحق تقنية الكيمياء التحليلية المستخدمة عادة لفصل، تحديد وقياس المكونات في خليط غير متجانس3.

على الرغم من أن ميكرودياليسيس هو أسلوب حساسة التي يمكن استخدامها لقياس أي تقريبا أكثر من الاهتمام، القرار الزماني منخفضة، مع معدلات أخذ العينات أقصى حدود دقيقة لعشرات الدقائق1،2. يمكن توضيح اختراع مسح سريعة فولتاميتري دوري (فسكف)، أسلوب الذي يعتمد على إمكانيات الأكسدة الأنواع اليكترواكتيفي، قرب لحظية تركيزات أكثر الفائدة في السائل خارج الخلية. باختصار (انظر روبنسون et al. 4 لإجراء استعراض شامل)، يتم تطبيق قطب رفع وخفض الجهد بطريقة موجه ثلاثية في مقياس وقت بسرعة4. عندما يكون الجهد في النطاق الصحيح، مجمع الفائدة مرارا وتكرارا تتأكسد وخفضت. أكسدة والحد من هذه النتائج في حركة الإلكترونات التي تخلق تيار المتردد صغيرة. مسح معدلات تجري بمقياس الفرعية الثانية مع أكسدة والحد من المركبات التي تحدث في ميكرو ثانية. بطرح الخلفية الحالية تم إنشاؤها بواسطة المسبار من الحالية الناجمة عن ذلك، واحد يمكن أن تولد جهد مقابل الأرض الحالية فريدة من نوعها لكل مجمع. حيث يعرف مقياس الوقت للذبذبات الجهد، يمكن استخدام هذه البيانات لحساب قطعة الحالية كدالة للزمن. وهكذا، قد تحددت تركيزات النسبية المجمع طالما نقل عدد الإلكترونات في كل الأكسدة والحد من رد فعل المعروف4.

تجعل هذه الخصائص الكيميائية وعالية الدقة الزمنية فسكف تقنية قوية للكشف عن تغيير تركيزات المواد الكيميائية في الجسم الحي. ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب على الرغم من هذه المزايا المتعددة، الخبرة التقنية الواسعة ومعدات غالية الثمن والإعداد. علاوة على ذلك، لا يمكن قياس العصبية نونيليكترواكتيفي (مثلاً، الغلوتامات) باستخدام هذا الأسلوب. لحسن الحظ، والتقدم التكنولوجي في المجال الكيمياء الكهربائية5، فضلا عن تسويق هذه الاختراعات، أدخلت نهج بسيط نسبيا لقياس العصبية غير اليكترواكتيفي في الحيوانات يتصرف مستيقظا دون المساس بالزمانية الدقة في تقنية تعرف باسم التكنولوجيا الانزيمية بيوسينسور. ويستخدم هذا الأسلوب الانزيمية تحويل العصبي نونيليكترواكتيفي الاهتمام إلى ركائز اثنين، واحد منها هو بيروكسيد الهيدروجين اليكترواكتيفي تم الكشف عنه أكسدة أمبيروميتريك الحالي تولدها بإمكانيات تطبيق5 . (انظر الشكل 1) قياس المسابير biosensor المتاحة تجارياً بطريقة انتقائية تحليلها للفائدة بشكل تنافسي تخفيض مساهمة إينتيرفيرينتس الذاتية. في حالة غلوتامات، المساهمة حمض الأسكوربيك إينتيرفيرينت المشتركة (أإ) تنافسية ينخفض إلى التيار المقاسة بتعريب شارك أوكسيديز AA على سطح الانزيمية النشطة من أجهزة الاستشعار، وتحويل AA لغير اليكترواكتيفي ديهيدرواسكورباتي والماء. وباﻹضافة إلى ذلك، يستبعد بوليمر نافيون مشحونة سلبا على طبقة موجودة تحت الطبقة إنزيم مركبات أنيونى الذاتية.

يمكن قياس هذا الإعداد التجريبية biosensor نفس العصبية اليكترواكتيفي كما هو الحال في فسكف، ولكن بدلاً من ذلك أنها توظف إمكانات إصلاحها تسجيل6. خلافا للجهد تتأرجح المطبقة في فسكف، في تسجيل الثابتة ذات الإمكانات الجهد يتم الاحتفاظ في الأكسدة المحتملة لأكثر الفائدة. على الرغم من أنها أقل كيميائيا انتقائية من فسكف العصبية متعددة قد يؤدي إلى الأكسدة نفس المحتملة، في مناطق الدماغ التي تحرف أغلبية ساحقة نحو ناقل عصبي واحد، طبيعة تسليم المفتاح لهذا النهج ترجح عدم وجود مادة كيميائية خصوصية.

القدرة على قياس الإفراج العصبي اليكترواكتيفي ونونيليكترواكتيفي في قرب الوقت الحقيقي وربطه بأحداث سلوكية معينة توفر فرصة لدراسة التلاقي العصبي الإفراج. هذه المخطوطة تفاصيل استخدام هذا النظام استجواب كبيرة الدوبامين وغلوتامات ردا على مكافأة الطبيعية في الهامستر يتصرف مستيقظا. الهدف من هذه الورقة أن التفاصيل العملية لقياس هذا الإصدار العصبي أثناء السلوك الجنسي في اليرانب الإناث، بهدف إثبات جدواه في دراسة السلوكيات والنماذج التجريبية الأخرى.

قداد نموذجا مثاليا للاستخدام في تسجيلات الكهروكيميائية
تاريخيا، استخدمت نماذج الجرذان والفئران في دراسة السلوك الجنسي. هذه أنواع القوارض الدخول في تسلسل copulatory ديناميكية، التي تنطوي على السلوكيات التماس الإناث العديدة التي تشمل التنقل والاندفاع، والإذن التلوي لجذب الذكور مطاردة وجبل الإناث7في نهاية المطاف. المتصاعدة من الذكور (مع أو بدون الإيلاج المهبلي) تستغرق بضع ثوان فقط، خلالها يمارس الأنثى لها السلوك الجنسي الموقف (يطلق عليها قعس) أيضا إلا لبضع ثوان قبل استئناف سلوكيات التماس النشط. وهذا النمط من السلوك، ويتألف من مستويات عالية من النشاط تتخللها فترات قصيرة من الجمود، إشكالية بالنسبة لقياس كبيرة في سلوك الحيوانات. أولاً، يمكن أن تكون هناك حركة القطع الأثرية في التسجيلات أمبيروميتريك التي لا علاقة لها بالنشاط العصبي. ثانيا، الحركة يرتبط بالإفراج عن العصبية خاصة في بعض مناطق الدماغ. على سبيل المثال، اقترن إطلاق الدوبامين إلى النشاط الحركي في المخطط الظهرية والبطني8،9، استنتاجا بأن تشكل الأساس لقياسات ميكرودياليسيس الدوبامين بعد بسيتشوستيمولانت 10من الإدارة. لأن سلوك التماس أنثى نموذجية في موسt القوارض تنطوي على مستويات عالية من النشاط الحركي، وهي ممثلة بالجزء الأكبر من اختبار السلوك الجنسي بعد 10 دقائق، وهذا يجعل من الصعب تنسب التغيرات في كبيرة على مكونات السلوك الجنسي الصريح بشكل جماعي آخر فقط دقيقة.

لتحليل الشخصية الكيميائية العصبية للسلوك الجنسي للإناث، سعى هذا المعمل من أنواع التي يوجد الحد الأدنى من النشاط الحركي المصاحبة للسلوك الجنسي. تسلسل كوبولاتوري في الهامستر السوري (Mesocricetus الذهبي) مثالي للتسجيلات الكيميائية العصبية نظراً لعدم وجود سلوكيات التماس عادة ما ينظر في الجرذان والفئران11. نتيجة لذلك، سيدخل اليرانب الإناث والحفاظ على الموقف قعس لما يزيد عن 9 دقائق من أصل 10 دقائق اختبار الدورة12. مع عدم وجود حركات الحركي دخيلة الإناث، في فيفو يمكن الحصول على التسجيلات الكهروكيميائية التي يمكن أن ترتبط بمكونات تفاعلات الجنسية مع الذكور.

نوبات copulatory في الهامستر
بعد إدخال حيوان التحفيز الذكور في قاعة الاختبار، سيعكف الذكور في البداية في التحقيق (منظمة العفو الدولية) من الناحية الشرجية التناسلية للإناث قبل تركيب لها (الشكل 2أ). وللذكور جبل، يجب أن تحمل الأنثى تقبلا موقف جنسي المعروف باسم قعس، التي قالت أنها الأقواس ظهرها وينحرف لها ذيل حيث أن الذكور المتصاعدة يمكن الوصول القضيب إلى مهبلها. سيتم تحميل الأنثى، قبض لها هيندقوارتيرس مع كل الكفوف (الشكل 2ب)، الذكور وتبدأ الجه في محاولة للحصول على القضيب الولوج (الشكل 2-ج). الذكور سوف جبل الأنثى (دون الإدراج)، فضلا عن إينتروميت لعدد من المرات قبل أن تحقق في نهاية المطاف القذف. ويطلق على هذا التسلسل يتصاعد وإينتروميشنس مما يؤدي إلى القذف نوبة "كوبولاتوري". وسيكون الذكور عدة نوبات copulatory ضمن جلسة عمل واحدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وافق على "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من "جامعة مينيسوتا" جميع الإجراءات الموصوفة هنا، ووفقا "دليل" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية 13 .

1-الحيوانات وجراحة كانوليشن

  1. السورية الحصول على الهامستر من مورد حيوانات شائعة في حوالي 55 يوما عمر.
    ملاحظة: على الرغم من أن سن الحيوانات تختلف بسبب القيود المفروضة على مختلف نماذج تجريبية، للسلوك الجنسي فإنه من المهم الحصول على الحيوانات ناضجة جنسياً التي هي كلها تقريبا في نفس العمر.
  2. بيت الحيوانات في التي تسيطر عليها درجة الحرارة (22 درجة مئوية) والبيئة الإضاءة (14 ح خفيفة تليها 10 ح الظلام بإطفاء الأنوار في ح 13:00)، مع الغذاء والمياه المتاحة libitum الإعلانية إلا خلال فترات الاختبار التجريبي-
    ملاحظة: نظراً لإنتاج الهامستر موسميا، هذا 14:10 دورة الضوء/الظلام يحاكي ظروفها الطبيعية تربية.
  3. بعد التأقلم مدتها أسبوع واحد للمختبر، أداء أوفاريكتوميس الثنائية العقيم وداخل الجمجمة كانولاتيونس ستيريوتاكسيك تحت التخدير العام (مثلاً، بينتوباربيتال)، وإدارة مناسبة مؤسسياً وافق عليها علاج مسكن والمضادات الحيوية بعد العمليات الجراحية كما تم وصفه سابقا 14 ، 15-
    ملاحظة: لدراسة السلوك الجنسي، أوفاريكتوميس تعتبر ضرورية لإزالة الذاتية المصدر الرئيسي للهرمونات الجنسية حيث أن الحيوانات يمكن أن يتسبب موحد للتقبل الجنسي مع هرمون خارجية وفقا للجدول الزمني التجريبي.
    1. لغرس مسبار تتميز وجلوتاماتيرجيك على حد سواء، زرع ستيريوتاكسيكالي دليل القنيات (0.7 مم؛ الرقم 3) في مجال الاهتمام (مثلاً، استهدف هذا المعمل accumbens نواة الحق (NAc)) كما هو موضح بالتفصيل التدرجي في أماكن أخرى 15-
      ملاحظة: على الرغم من أن البيانات المقدمة من تسجيلات استشعار واحد واحد المسبار غلوتامات أو الدوبامين للحيوان الواحد، يسمح هذا النظام لتسجيل واحد ليصل إلى 4 أجهزة الاستشعار في حيوان مفردة؛ وهكذا، يمكن زرعها القنيات 1-4 اعتماداً على التصميم التجريبي المرجوة والنتائج.
      1. تحديد إحداثيات منطقة اهتمام أطلس ستيريوتاكسيك باستخدام عملية الزرع (مثلاً، الدماغ الهامستر الذهبي واسطة مورين & الخشب)، آخذة في الاعتبار أن أجهزة الاستشعار يمتد 1 مم أدناه القنية في أنسجة المخ.
    2. بعد أن يتم تخفيض قنية ستيريوتاكسيكالي إلى الموقع المطلوب الظهرية البطني، إلصاق في الجمجمة باستخدام غطاء مصنوع من اﻷكريليك الأسنان، المضمون مع مسامير العظام الفولاذ المقاوم للصدأ ورأس بلاستيك جبل ( رقم 3 ; انظر 15 لمزيد من التفاصيل).
    3. لاختبار ألياف الكربون، إدراج قطب مرجعية (350 قطر ميكرومتر، والطول الإجمالي 7.5 ملم) في نصف الكرة الغربي كونترالاتيرال-
      ملاحظة: موقع معين أو المسافة من القنية ليس المطلوبة؛ يمكن وضع أقطاب مرجعية في أي مكان في نصف الكرة الغربي contralateral ملائم.

2. بيوسينسور، واختبار ألياف الكربون

  1. عقب أسبوع للشفاء من عملية جراحية، إدارة نظام فتيلة الهرمون للحث على التقبل الجنسي.
    1. حقن 10 ميكروغرام لنزوات استراديول في 0.1 مل زيت بذر القطن تحت الجلد (الليبي)، حوالي 48 ساعة و 24 ساعة قبل السلوك الجنسي للاختبار، للحث على التقبل الجنسي تجاه الذكور 11-
    2. حقن 500 ميكروغرام من البروجسترون في 0.1 مل زيت بذر القطن، الليبي، ح 4 قبل الأخذ بالذكور للحث على التقبل الجنسي 11-
  2. اختبار جميع الحيوانات في بداية مرحلة مظلمة دورة اليومية، السلوكيات الاجتماعية من القوارض خاضعة للتعديل تحت الضوء الأبيض والضوء الأحمر اختبار ظروف 16 ، 17 ، 18-
  3. لاختبار غلوتامات بيوسينسور الانزيمية، معايرة أجهزة الاستشعار في المختبر ( الشكل 4) قبل الاستخدام كما هو موضح مسبقاً 15 ، 19-
    1. إجراء المعايرة حلول جديدة اليوم للاختبار في 20 مل زجاج أنابيب الطرد المركزي. لحل أكثر، يذوب 7.4 مغ حمض الجلوتاميك ل في 10 مل من غلاة نقي ح 2 س بعكس الأنبوب بلطف. جعل الحل إينتيرفيرينت بتذويب ملغ 176.1 AA في 10 مل ح نقية فائقة 2 سين
    2. إعداد للمعايرة عن طريق وضع محرض مغناطيسية على قاعدة موقف خاتم مختبر الأساسية. ضع كوب تغلف 20 مل على رأس محرض المغناطيسية، والمشبك في مكانها باستخدام المشبك الشق 2 متوسطة. بار
      1. إضافة إثارة مغناطيسية و 20 مل من الفوسفات 100 مم مخزنة المالحة (PBS) في الكأس تغلف. الاتصال الكأس تغلف بحمام مائي المتداولة لتسخين الحل المخزن المؤقت إلى 37 درجة مئوية.
        ملاحظة: يجب أن تقوم معايرات biosensor الانزيمية في درجة حرارة الجسم أن النشاط الأنزيمي يتأثر بدرجة الحرارة-
    3. وضع صاحب معايرة جهاز استشعار على رأس الكأس تغلف، وتعيين المضخم معايرة 4-قناة في الأعلى، تأمين في مكان باستخدام المشبك زاوية قائمة. الاتصال المضخم لجهاز تكييف واقتناء بيانات إلى بيانات سجل معايرة.
    4. اختبار حساسية كل بيوسينسور الانزيمية غلوتامات (أو التحاليل الأخرى من أهمية بالنسبة للأخرى المتاحة تجارياً biosensor المسابر مثل الجلوكوز) قبل تسجيل تجريبي بوضع التحقيق في حامل المعايرة فوق تغلف الكأس، غمر تجويف الاستشعار وجزء من سلك الإشارة كلوريد الفضة (AgCl) في المخزن المؤقت للحل.
      1. قبل توصيل كل أجهزة الاستشعار (حتى 4) يجري اختبار بمنفذ على المضخم معايرة 4-قناة، الشروع في تسجيل جديد على واجهة الكمبيوتر استخدام البرمجيات اقتناء للتنزيل مجاناً. السماح لأجهزة الاستشعار للوصول إلى خط أساس مستقر.
    5. البدء في إضافة الحقن أكثر عند أجهزة الاستشعار قد وصلت إلى خط أساس مستقر. استخدام الثقب في حامل المعايرة لإدخال تلميح ماصة للحل المخزن المؤقت. استخدام أداة التعليق التوضيحي رئيسية سريعة في برنامج التسجيل لإضافة تعليق توضيحي عندما يتم حقنه.
      1. جعل 10 ميكرومتر الإضافات من غلوتامات بيبيتينج 40 ميكروليتر من الحل أكثر في الحل المخزن المؤقت. الانتظار لجهاز استشعار لتحقيق الاستقرار بين الإضافات. إضافة 3 حقن الحل أكثر قبل إضافة حقنه واحدة من الحل AA إينتيرفيرينت (ميكروليتر 50 حقن حجم 250 ميكرو التغيير في تركيز).
        ملاحظة: يسمح المعايرة لتحويل التغييرات في إشارة أمبيروميتريك (ينظر أثناء التسجيل التجريبي الانزيمية في الخطوة 2، 12) إلى أحداث تغييرات في تركيز غلوتامات، إذا رغبت في ذلك. راجع مرجع 15 لتعليمات تدريجية. يتم معايرة المجسات تتميز المستخدمة من قبل هذا المعمل أثناء عملية التصنيع مقدم التجارية. يجب معايرة غلوتامات المسابير في وقت الاستخدام كما يمكنك تقليل حساسيتها على مر الزمن كما تتحلل العناصر الانزيمية 19. لأن التحلل لا أقطاب ألياف الكربون، المعايرة تقوم بها الشركة قبل الشحن غير كافية على طول ك tهنا زيادة في احتمال الأضرار بألياف الكربون رقيقة (350 ميكرومترات القطر) من خلال معالجة إضافية-
  4. خط غرفة الاختبار مع الأسرة مأخوذة من الحيوان ' قفص المنزل s-
    ملاحظة: وهذا يزيد من الإناث ' s الألفة مع اختبار الدائرة، فضلا عن تعرض الذكور لحفز جنسياً العظة التزاوج حاسة الشم التي تم توزيعها من قبل الإناث في الاستجابة للعلاج استراديول-
  5. طفيفة تخدير الحيوانات قبل الإدراج المسبار isoflurane أو مخدر متفجرة أخرى في دائرة التعريفي.
  6. إزالة أوبدوراتور الانسداد من قنية دليل، وإدراج القطب ألياف الكربون أو مسبار الانزيمية عن طريق رمح الدليل.
  7. بعد الإدراج التحقيق، وضع الحيوان في قاعة الاختبار.
    ملاحظة: يستخدم هذا المعمل 10-غال زجاج حوض السمك (24.5 × 48.9 × 29.4 سم)، ولكن يجوز أيضا الدوائر جولة من ناحية المساواة-
  8. بدء تسجيل إشارة أمبيروميتريك الفيديو والوقت غير الساحلية في أحد البرامج متاحة تجارياً، ووصف بالتفصيل في مكان آخر 15-
  9. توصيل جهاز استشعار لنظام التسجيل: بوتينتيوستات عن طريق كبل محمية كهربائياً وقطب كهربائي. تثبيت اتصال جهاز استشعار بالشد على مرفق رقم pin على جبل الرأس. تعزيز الاتصال باستخدام مختبر الفيلم إذا لزم الأمر-
    ملاحظة: هناك حاجة إلى موصل مخصص لإرفاق كل من ألياف الكربون القطب والقطب الإشارة إلى بوتينتيوستات، بينما يمكن توصيل أجهزة الاستشعار غلوتامات الانزيمية مباشرة بوتينتيوستات-
    10. السماح
  10. بجهاز استشعار لحجته في الدماغ قبل الاختبار التجريبي-
    ملاحظة: مرات الموازنة تختلف تبعاً لاستشعار التسجيل (مثلاً، أجهزة الاستشعار الانزيمية تتطلب الموازنة ح 2-4، بينما أقطاب ألياف الكربون فقط تتطلب حوالي 30 دقيقة). إذا كان يتم زرعها كلا النوعين من أجهزة الاستشعار، حجته لأطول وقت استشعار الانزيمية.
  11. بعد الموازنة الاستشعار، إدخال الذكور تحفيز في قاعة الاختبار.
  12. وبعد جبل الأولى مع الإدراج القضيب (يسمى الولوج) من الذكور التحفيز، يستمر تسجيل 10-30 دقيقة إضافية، تبعاً لأهداف تجريبية.
  13. عقب اختبار سلوكية، قم بفصل الإناث ' استشعار s-
    14. قداد
  14. إزالة كلا من قاعة الاختبار. إزالة الفراش، وتنظيف الدائرة باستخدام الإيثانول 70%-
    ملاحظة: بسبب الموازنة قصيرة المطلوبة لتسجيلات ألياف الكربون، يمكن أن تتكرر الخطوات 2.3-2.14 لاختبار الحيوانات متعددة في نفس اليوم. وفي المقابل، نظراً لأن أجهزة الاستشعار الانزيمية تتطلب حوالي 4 ح للموازنة، اختبار الحيوان واحد فقط يوميا للحد من التباين بين الموضوع ممكن بسبب الاختلافات في الحيوانات ' الإيقاعية وقت الاختبار.

3. والتضحية ونضح

  1. عقب انتهاء فترة الاختبار، تخدير عميق الإناث اختبار هذا الموضوع مع وكيل يوثانيزينج (مثلاً، هذا المعمل يستخدم حقنه داخل حل الفينيتوئين وبينتوباربيتال 0.2 مل) .
  2. ترانسكارديالي نتخلل الحيوان مع 25 مم PBS، درجة الحموضة 7.6، لإزالة كل الدم المتداولة، يليه تثبيت 20 دقيقة باستخدام 4% بارافورمالدهيد-برنامج تلفزيوني-
  3. إزالة الدماغ و postfix في ~ 30 مل الحل بارافورمالدهيد 4 ٪ في أنبوب مخروطي 50 مل بين عشية وضحاها.
    1. مخزن الدماغ في 10 ٪ حل السكروز-برنامج تلفزيوني حتى جاهزة لقسم المسلسل.
      ملاحظة: العقول يمكن تخزين إلى 2 أسابيع، مع التغييرات حل السكروز أسبوعية لتجنب النمو المحتمل للملوثات-
  4. المسلسل قسم الدماغ في 40 ميكرومتر شرائح من خلال منطقة مزروع أما مع مبضع تجميد أو كريوستات كما تم وصفه سابقا 19-
  5. جبل شرائح متسلسل على الشرائح المتاحة تجارياً المغلفة بمادة لاصقة (أو انظر 20 جعل). السماح لتجف، على الأقل بين عشية وضحاها.
  6. وصمة عار الشرائح مع صبغ كريسيل البنفسجي، واضحة، وكما سبق ذكره ساترة 20-
  7. الصور الشرائح باستخدام مجهر الحقل مشرق لتأكيد وضع تشريحي للاستشعار-

4. الترميز السلوكية

  1. عرض وإضافة تعليقات توضيحية الفيديو باستخدام البرمجيات الحرة للتنزيل تجارياً (انظر الجدول للمواد) البطيء للسلوكيات رمز التحديد الوقت غير الساحلية إلى إشارة أمبيروميتريك.
    ملاحظة: لاستخدام التعليمة البرمجية MATLAB في التحليل (انظر أدناه )، وإضافة تعليقات توضيحية في بداية و نهاية كل من الإناث ' s وذكر ' السلوكيات s.
    1. تعليق ستارتلوردوسيس في الإطار عند الإناث يبدأ دورسوفليكسيون ظهرها وعيوب لها ذيل صعودا. إضافة تعليق توضيحي اندلوردوسيس عند الأنثى ينهي هذا الموقف، الذي غالباً ما يحدث عند الأنثى أحل إلى موقع آخر في قاعة الاختبار.
    2. تعليم ستارتاي عند الأنثى في الموقف قعس والذكر يتحرك له آنف نحو الأنثى ' s المنطقة الناحية الشرجية التناسلية، حيث قد يحدث استنشاق، لعق، أو نوزلينج لها المنطقة العجانيه. إضافة تعليق توضيحي أندي عند الذكور يزيل له آنف من مقربة من الإناث ' المنطقة الناحية الشرجية التناسلية s-
    3. تعليم ستارتماونت عند الذكور النهج ويضع له فوريباوس على الأنثى في تصاعد موقف، بغض النظر عن التوجه لمحاولة جبل (مثلاً، الجانب، الردف).
    4. تعليم ستارتينتروميشن عند الجه الناجح المكاسب المحملة وصول القضيب الذكور إلى الإناث ' المهبل s-
      ملاحظة: الولوج سلوكيا يمكن تمييزها من الجه المحملة التي تحدث قبل الولوج، كما الذكور واضح يسحب أطرافه العليا نحو جسده والتوجهات له الحوض إلى الأمام، وتجعيد الشعر ذيله إلى أعلى، مما يشير إلى اختراق (انظر < فئة قوية = "إكسفيج" > الشكل 4 ج).
      1. وعند الاقتضاء، تعليق توضيحي القذف.
        ملاحظة: في نهاية نوبة التزاوج وبالاقتران مع الولوج نجاح، سوف ينزل الذكور. على الرغم من أن المرء غير قادر على تصور الانبعاثات الفعلية، الهامستر الذكور قد سمة وطئ الحركة مع أقدامهم هند أثناء الولوج 21، ومن ثم إضافة تعليق توضيحي القذف في الحدوث حركة القدم.
    5. تعليم اندينتروميشن و اندماونت في أن واحد في الإطار عند الذكور أزال له آثار أقدام هما الجبهة، وبالتالي، أي اتصال مع الإناث. بسبب عجز متكرر لتصور رمز انسحابه، واحد هذه السلوكيات اثنين للسماح للاتساق والموثوقية عبر التزاوج نوبات.
      ملاحظة: نوبة التزاوج يتبع قذف نجاح أو عند الإناث فواصل الموقف قعس بعد واحد على الأقل جبل.

5. مثال على "تحليل البيانات"

ملاحظة: استخدام ألياف الكربون الإمكانات الثابتة والتسجيلات الانزيمية الدوبامينغلوتامات nd، على التوالي، يسمح للقدرة على قياس منشط وأنماط طورية الإفراج الكهروكيميائية. هذا المعمل يستخدم نظام حيازة الحرة والتجارية وتسجيل برامج لتسجيل وتحويل الإشارات من تمثيلي إلى رقمي (التحيز 0.600 الخامس، معدل أخذ العينات = 1 هرتز).

  1. وصف بروتوكول تحليل البيانات المثال
    1. على الرغم من أن يمكن استخدام برامج أخرى، قياس منشط وطوريه التغييرات (عابر) في الإشارات الكهروكيميائية مسجل باستخدام MATLAB.
      1. للبيانات المقدمة، وحساب منشط الإشارات باستخدام عامل تصفية متوسط متحرك 50 نقطة. تم حساب تمثيل الإشارة عابرة فقط تم تسويتها عن طريق طرح إشارة منشط من البيانات الخام. عند تحديد قمم طورية، هناك عدة خيارات حسابي (مثلاً، وسم قمم كالتغيرات في إشارة أكثر من 1 SD فوق المتوسط)-
      2. تحديد مواقع هذه القمم، أي، ماكسيما المحلية، من إشارة تم تسويتها باستخدام الدالة MATLAB بيكفيندير مع السعة ذروة الحد الأدنى تعيين إلى جذر متوسط مربع الإشارة. موقع قمم الكشف من إشارة طبيعية استخدمت لاستخراج السعة من كل الذروة. القدرة على الكشف عن قمم يسمح للتعرف على أي سلوكيات الوقت غير الساحلية قد تزامنت مع، أو القيادة في ذروة نسبي في الكيميائية العصبية تحت التحقيق.
    2. الجزء البيانات المجهزة وفقا للشروح سلوكية (راجع الخطوة 3)؛ وطالب ' s t-تم استخدام اختبار لتقييم الاختلافات في مستوى الناقل العصبي منشط وحدوث العابرين والسعة ل العابرين خلال قعس بوت قبل التزاوج مقابل قعس أثناء التزاوج نوبات. لقياس التغييرات في أنماط منشط الإفراج الكهروكيميائية، قورنت نقاط البيانات التي تحدث أثناء موقف قعس مباشرة قبل نوبة التزاوج (أي، قبل التزاوج نوبة قعس) إلى نقاط البيانات أثناء نوبة التزاوج دورة استخدام تي-test.
  2. إعداد البيانات الأولية لبروتوكول تحليل البيانات وصف
    ملاحظة: كما ورد، على الرغم من أن التحليلات أو برامج أخرى قد تكون أيضا خيارات قابلة للتطبيق، من أجل استخدام التعليمة البرمجية MATLAB الموصوفة أعلاه، يجب أن تكون مستعدة في البيانات الخام بالطريقة التالية:
    1. تصدير ملفات الشرح والجهد. للقيام بذلك، تحت ' ملف ' التبويب، حدد ' التصدير ' تعمل وحدد ' الشروح ' التبويب حفظ التعليقات التوضيحية. تحت ' ملف ' التبويب، حدد ' التصدير ' تعمل واختر " TSV ' علامة التبويب حفظ قياسات الجهد كملف ملحق TSV.
    2. فتح كل ملف مع برنامج جداول بيانات، وحفظ باسم ' xls/xlsx ' لجعل الملفات المتوافقة مع MATLAB.
      ملاحظة: للحصول ' الشرح ' الملف، وهناك إضافية الشروح التي يجب يدوياً إضافة الصادرات فيما بعد في برنامج جدول بيانات يملي على بدء و نهاية كلا مرحلة ما قبل التزاوج نوبة قعس (المشروح بريمبلوردورسيس ) ونوبة التزاوج حيث أنه يمكن مقارنة هذه النقاط الزمنية مباشرة كما هو مذكور في الخطوة 5.1.2.
      3. تعليم
    3. بدء قعس بوت قبل التزاوج (ستارتبريمبلوردوسيس) في نفس الوقت كما يبدأ سلوك قعس (ستارتلوردوسيس) هذا أيضا يتضمن سلوكاً جبل، وأيضا في بداية جديدة التزاوج نوبة إذا الأنثى لا يزال الموقف قعس.
    4. تعليم نهاية قعس بوت قبل التزاوج (اندبريمبلوردوسيس) عندما يبدأ أول جبل.
    5. تعليم بدء نوبة التزاوج (ستارتمب) من اندبريمبلوردوسيس، وفي الوقت نفسه، وهذا يدل على بدء نوبة التزاوج.
    6. تعليم نهاية نوبة التزاوج (اندمب) في أما نهاية جبل يحتوي القذف (راجع الخطوة 4.1.4.1)، أو بعد الأنثى ' s إنهاء الموقف قعس (اندلوردوسيس)-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الكهروكيميائية والسلوكية الترميز المنهجية المبينة أعلاه، بدأ هذا المعمل لتوصيف منشط وتقلبات طورية في الدوبامين وغلوتامات خلال في فيفو تسجيلات للسلوك الجنسي. بسبب طريقة دقيقة وقتيا لهذه المنهجية، ونحن أكثر دقة تميز كبيرة خلال السلوك الجنسي؛ وكذلك تنسب تغييرات محددة في الإفراج عن أنماط للمقابلة منشط التغييرات أثناء نوبات التزاوج، وتقلبات عابرة المقابلة أثناء استلام للأنثى من السلوكيات كوبولاتوري الفردية (مثل، الولوج والقذف) من الذكور المتصاعدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من معقدة نسبيا، يمكن أن تنشأ بعض المشاكل عند استخدام هذا الأسلوب. أولاً، يجب أن يكون موضع ستيريوتاكسيك التحقيقات دقيقة: خلافا ميكرودياليسيس أن عينات قطرها أوسع من الوسط خارج الخلية المحيطة بالمسبار، هذا الأسلوب يسمح فقط بقياس العصبي التي تأتي في اتصال مباشر مع التحقيق. ثانيا، في حالة تسجيل ألياف الكربون، بسبب عرض صغير من الألياف، ويمكن أن يحدث الكسر، ويجب إدراجها في التحقيق مع الرعاية المتعمد. وفي حالة جلوتاماتيرجيك أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، يمكن أن يحدث تدهور الانزيمية إذا لم يتم استخدام التحقيق داخل ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلف يود أن يشكر الجامعية بوتشير أليكس لمساعدته في تشغيل التجارب السلوكية والجامعية دانيال كروس لمساعدته بتشغيل التعليمة البرمجية Matlab. يدعم هذا المشروع NSF دائرة الرقابة الداخلية 1256799 إلى R.L.M.، والمعهد الوطني "تعاطي المخدرات" من "معاهد الصحة الوطنية في" إطار جائزة رقم T32DA007234.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

شركة مضادات شركة تقدم شركة شركة يعمل

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
NembutalOak Pharmaceuticals Inc.76478-501-50حقن البنتوباربيتال الصوديوم ، USP. يستخدم هذا المختبر 8.5 مجم / 100 جرام من وزن الجسم ، ويتم حقنه داخل البيروتين.
Loxicom مسكن  مختبرات نوربروك 6451603670الالتهاب غير الستيروئيدية والمسكنات المستخدمة للسيطرة على الألم بعد الجراحة. عام: meloxicam. 
مضاد حيوي Enroflox مختبرات نوربروك 5552915411مضاد حيوي فلوروكينولون للوقاية من العدوى بعد الجراحة. عام: إنروفلوكساسين.
Beuthanasia-D ميرك للصحةالحيوانية 00061047305البنتوباربيتال الصوديوم ، عامل الفينيتوين الصوديوم.
مسامير العظامPinnacle Technologies، Inc.8111-161/8 "برغي عظمي (Pkg. من 16) يستخدم لتثبيت غطاء الجمجمة على الجمجمة.
أكريليك الأسنان (Bosworth Duz-All)Bosworth 166261C يستخدم أكريليك الأسنان ذاتي المعالجة في بناء غطاء الجمجمة لتثبيت القنية وتثبيت الرأس على الجمجمة.
إعداد المستشعر الحيوي للأجهزة بيناكل تكنولوجيز8400-K2Pinnacle مجموعات أجهزة كاملة للمستخدمين الجدد لنظام الاستشعار الحيوي المربوط للفئران. تشمل المجموعات مبدل ، ومضخم ، ونظام تكييف البيانات واكتساب
حزمة كمبيوتر الفيديو الأساسيةPinnacle Technologies، Inc.9000-K1تتضمن حزمة الكمبيوتر الأساسية جهاز كمبيوتر تم تكوينه مسبقا مع مساحة تخزين كبيرة على القرص الصلب ، وشاشة عالية الوضوح ، ولوحة مفاتيح وماوس ، ومصدر طاقة غير منقطع ، وجميع الكابلات اللازمة.
فيديو EQ700 كاميرا EverFocus   حزمةPinnacle Technologies, Inc.  9000-K10 تم الحصول على كاميرا صندوقية قادرة على الرؤية الليلية EQ700 مع مصدر الأشعة تحت الحمراء المستقل كجزء من حزمة كمبيوتر الفيديو Pinnacle. تتوفر أيضا خيارات كاميرا القبة (9000-K9) والكاميرا عالية الدقة (9000-K11).
برنامج اقتناء سيرينياPinnacle Technologies، Inc.مجاني - متاح للتنزيل من pinnaclet.comسيرينيا & nbsp ؛ يوفر الاستحواذ نظاما أساسيا واحدا لتسجيل البيانات من أي نظام أجهزة Pinnacle. يتميز البرنامج بمزامنة جميع تدفقات البيانات والإعدادات القابلة للتكوين من قبل المستخدم وتوحيد البيانات وخيارات التصدير المتعددة. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن البرنامج وحدات مراجعة وتحليل أساسية لتسجيلات المستشعرات الحيوية. سيرينيا  يقدم برنامجا مجانيا للكمبيوتر الشخصي مثاليا للحصول على البيانات ومراجعتها.
فأر مربوط  في المختبر  مجموعة المعايرةPinnacle Technologies، Inc.7000-K2-T-BAS من أجل ربط التغييرات الحالية التي تم قياسها بواسطة جهاز استشعار حيوي بالتغيرات الفعلية في تركيز التحليل ، من الضروري معايرة المستشعر الحيوي قبل الزرع في. تؤكد العملية أيضا سلامة وانتقائية أجهزة الاستشعار. تتضمن مجموعة المعايرة دورق مغلف سعة 20 مل (# 7058) ، 1/2 بوصة × 1/8 بوصة قضيب تحريك مغناطيسي ( # 7059) ، مشبك الزاوية اليمنى ( # 7056 ) ، مشبك ضبط أحادي الشق ( # 7055 ) ، مكبر صوت معايرة 4 قنوات (# 7053) ، وحامل معايرة (# 7051). 
لوحة التقليب Corning6795-410DCorning Digital Stirrer ، 5 "× 7" ، 120 فولت تيار متردد يستخدم لتدوير النمام المغناطيسي في دورق مغلف أثناء معايرة in vitro < / em> لأجهزة الاستشعار الحيوية للغلوتامات.
حمام مائي قادر على تداول الحلقة المغلقةPolyScience8006A11BPolyScience 8006A11B 6L حمام دائري رقمي قياسي ساخن ، تم استخدام حمام مائي 120VAC مع أنابيب بلاستيكية لتسخين الدورق المغلف إلى درجة الحرارة الفسيولوجية.
مستشعر ألياف الكربون مع قنية الفئران BASiPinnacle Technology، Inc.7002-CFSقطب من ألياف الكربون يستخدم لتسجيل النقل العصبي للدوبامين.
القطب المرجعي Ag / AgClPinnacle Technology، Inc.7065ضروري لتسجيلات ألياف الكربون.
أجهزة الاستشعار الحيوية للغلوتامات  بيناكل للتكنولوجيا7001 مسبار المستشعر الحيوي الأنزيمي يستخدم لتسجيل النقل العصبي الجلوتاماتيرجي.
قنية دليل BASiPinnacle Technologies، Inc.7030 قنيات التوجيه المزروعة في منطقة الدماغ ذات الأهمية لتوجيه المسبار.
BASi قنية البلاستيك غطاء الرأس للفئران بيناكل تكنولوجيز7011 حامل الرأس على تثبيت المسبار وتثبيته على البوتينسيوستات.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7, Unit 7.1.1-7.1.28 (2009).
  2. Chaurasia, C. S., et al. AAPS-FDA Workshop white paper: Microdialysis principles, application and regulatory perspectives. Pharm Res. 24 (5), 1014-1025 (2007).
  3. Lindsay, S., Kealey, D. High performance liquid chromatography. , John Wiley and Sons. New York, NY. (1987).
  4. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49 (10), 1763-1773 (2003).
  5. Hu, Y., Mitchell, K. M., Albahadily, F. N., Michaelis, E. K., Wilson, G. S. Direct measurement of glutamate release in the brain using a dual enzyme-based electrochemical sensor. Brain Res. 659 (1-2), 117-125 (1994).
  6. Agnesi, F., et al. Wireless instantaneous neurotransmitter concentration system-based amperometric detection of dopamine, adenosine, and glutamate for intraoperative neurochemical monitoring. J Neurosurg. 111 (4), 701-711 (2009).
  7. Erksine, M. S. Solicitation behavior in the estrous female rat: A review. Horm Beh. 23 (4), 473-502 (1989).
  8. Weiner, I., Gal, G., Rawlins, J. N., Feldon, J. Differential involvement of the shell and core subterritories of the nucleus accumbens in latent inhibition and amphetamine-induced activity. Behav Brain Res. 81 (1-2), 123-133 (1996).
  9. Heidbreder, C., Feldon, J. Amphetamine-induced neurochemical and locomotor responses are expressed differentially across the anteroposterior axis of the core and shell subterritories of the nucleus accumbens. Synapse. 29 (4), 310-322 (1998).
  10. Pierce, R. C., Kalivas, P. W. Amphetamine produces sensitized increases in locomotion and extracellular dopamine preferentially in the nucleus accumbens shell of rats administered repeated cocaine. J Pharmacol Exp Ther. 275 (2), 1019-1029 (1995).
  11. Pfaff, D. W. Drive: Molecular and physiological analyses of a simple reproductive behavior. , The M.I.T. Press. Cambridge, MA. (1999).
  12. Carter, C. S. Postcopulatory sexual receptivity in the female hamster: The role of the ovary and the adrenal. Horm Behav. 3 (3), 261-265 (1972).
  13. Guide for the care and use of laboratory animals, 8th ed. , The National Academies Press. New York, NY. National Research Council (2011).
  14. Meisel, R. L., Camp, D. M., Robinson, T. B. A microdialysis study of ventral striatal dopamine during sexual behavior in female Syrian hamsters. Beh Brain Res. 55 (2), 151-157 (1993).
  15. 4 Channel EEG/EMG/Biosensor Manual V005. , Pinnacle Technology. (2012).
  16. Pellis, S. M., Pellis, V. C. Play-fighting differs from serious play fighting in both target of attack and tactics of fighting in the laboratory rats Rattus norvegicus. Aggress Behav. 13 (3), 227-242 (1987).
  17. Pellis, S. M., Pellis, V. C. Differential rates of attack, defense and counterattack during the developmental decrease in play fighting by male and female rats. Dev Psychobiol. 23 (3), 215-231 (1990).
  18. Pellis, S. M., Hastings, E., Shimizu, T., Kamitakahara, H., Komorowska, J., Forgie, M. L., Kolb, B. The effects of orbital frontal cortex damage on the modulation of defensive responses by rats in playful and non-playful social contexts. Behav Neurosci. 120 (1), 72-84 (2006).
  19. Wakabayashi, K. T., Kiyatkin, E. A. Rapid changes in extracellular glutamate induced by natural arousing stimuli and intravenous cocaine in the nucleus accumbens shell and core. J Neurophysiol. 108 (1), 285-299 (2012).
  20. Kapelsohn, K. I. Improved methods for cutting, mounting, and staining tissue for neural histology. Protoc Exch. , (2015).
  21. Siegel, H. I. Chapter 7: Male sexual behavior. The Hamster: Reproduction and Behavior. , Plenum Press. New York, NY. (1985).
  22. Day, J. J., Carelli, R. M. The nucleus accumbens and pavlovian reward learning. Neuroscientist. 13 (2), 148-159 (2007).
  23. Meisel, R. L., Mullins, A. J. Sexual experience in female rodents: Cellular mechanisms and functional consequences. Brain Res. 1126 (1), 56-65 (2006).
  24. Meredith, G. E., Pennartz, C. M., Groenewegen, H. J. The cellular framework for chemical signaling in the nucleus accumbens. Prog Brain Res. 99, 3-24 (1993).
  25. Hedges, V. L., Staffend, N. A. Neural mechanisms of reproduction in females as a predisposing factor for drug addiction. Front Neuroendocrinol. 31 (2), 217-231 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة