مقالة منهجية

إعادة البناء ثلاثي الأبعاد بنية الأوعية الدموية المبيض الماوس مسح الوضوح السلبي

DOI:

10.3791/56141

⸱

ديسمبر 10, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Integrative Medicine and Neurobiology, School of Basic Medical Sciences; Institutes of Brain Science, Brain Science Collaborative Innovation Center, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, Institute of Acupuncture and Moxibustion, Fudan Institutes of Integrative Medicine, Fudan University, 2Program of Reproductive and Stem Cell Biology, Department of Obstetrics and Gynecology, Stanford University School of Medicine, Stanford University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا لتكيف من الوضوح السلبي وأسلوب إعادة البناء ثلاثي الأبعاد للتصور المفرج المبيض وجرابي الشعيرات الدموية في المبايض سليمة الماوس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المبيض هو الجهاز الرئيسي للجهاز التناسلي الإناث، وهو أمر أساسي لإنتاج الأمشاج الإناث ومراقبة النظام الغدد الصماء، ولكن العلاقات الهيكلية المعقدة وأبنية المفرج ثلاثي الأبعاد (3D) المبيض ليست وصفاً جيدا. من أجل تصور اتصالات ثلاثية الأبعاد والهندسة المعمارية من الأوعية الدموية في المبيض سليمة، الخطوة الهامة الأولى جعل المبيض واضح بصريا. تفاديا لانكماش الأنسجة، استخدمنا المائية الوضوح السلبي القائم على التثبيت (مسح الدهن-وتبادل جامدة تهجين الاكريلاميد "المائية الأنسجة" التصوير/إيمونوستينينج/في الموقع-التهجين-متوافق مع) البروتوكول طريقة لمسح مبيض سليمة . ثم استخدمت Immunostaining ومتقدمة مولتيفوتون المجهري [كنفوكل]، والصورة ثلاثية الأبعاد-عمليات إعادة البناء للتصور من سفن المبيض وجرابي الشعيرات الدموية. باستخدام هذا النهج، واظهرنا ارتباط إيجابي كبير (ف < 0.01) بين طول الشعيرات الدموية جرابي وحجم الجدار الحبيبي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المسام هي الوحدة الأساسية الهيكلية والوظيفية المبيض، وتطويره عالية تتصل المفرج داخل المبيض. توفير التغذية والهرمونات للمسام الأوعية الدموية وهكذا تلعب أدواراً هامة في نمو ونضج المسام1.

مزيج من التكنولوجيات، بما في ذلك علامات الأوعية الدموية انتقائية ونماذج الماوس المعدلة وراثيا وتطوير الأدوية، ازدادت معرفتنا حول المبيض شبكات الأوعية الدموية والأوعية، ووظيفة الأوعية الدموية في فوليكولوجينيسيس. ومن المعروف المبيض جهازا نشطاً نظراً لأنه يعيد تشكيل مختلف شبكات الأوعية الدموية والأنسجة أثناء فوليكولوجينيسيس والاباضه. هذا يعيد البناء النشطة في حجم وهيكل السفن المطلوب للوظيفة البيولوجية لتطوير وتوظيف المسام.

الأساليب التقليدية في غذائها وهيستومورفوميتريك باستخدام المقاطع المبيض وإيمونولابيلينج من الأوعية الدموية تقتصر على صور ثنائية الأبعاد (2D)2. مع تطوير تكنولوجيات إعادة الإعمار (3D) ثلاثي الأبعاد، يمكن أن تتداخل الصور 2D لشرائح الأنسجة جعل هيكل ثلاثي الأبعاد، ولكن هذا الأسلوب لا يزال لديها بعض القيود – تقطيع الأنسجة يمكن أن تدمر المجهرية، بعض أجزاء الأنسجة غالباً ما تكون مفقودة، وعمالة كبيرة وتشارك في إجراء عمليات إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من الصور التي تم الحصول عليها من الشرائح. كل الأنسجة التصوير ثلاثي الأبعاد مع الفحص المجهري [كنفوكل] يمكن التغلب على كثير من هذه القيود، ولكن هذه الأساليب محدودة في تقييم الأوعية في المبيض الجنينية3. يمكن استخدام أنسجة كله تطهير الطرق مثل الوضوح4 زيادة حجم تصور لحل هذه المشاكل في المبيضين بعد الولادة والكبار، ومثل هذه الأساليب تقديم موافقة الضوئية المبيض دون أي تشوهات هيكلية. تصوير بنية ثلاثية الأبعاد من المبيض سليمة توفر قاعدة بيانات صورة دقيقة للبرنامج تحليل الصور، مثل مجموعة إيماريس من البرامج المستخدمة في هذا العمل.

إعادة عرض المبيض طوال مرحلة البلوغ جزء من نظام ديناميكي الفسيولوجية، وهذا يجعل المبيض نموذجا ممتازا لإجراء تحقيقات في تنظيم الأوعية. وعلاوة على ذلك، يمكن دراسة تقييم دور المبيض الأوعية الدموية في ظروف مرضية من الجهاز التناسلي الإناث مثل متلازمة تكيس المبيض أو سرطان المبيض عن طريق تصوير أنسجة المبيض كله. تطوير أسلوب الوضوح السلبي واستعمال برمجيات تحليل الصور المتقدمة قدمت المعلومات المكانية المفصلة عن العلاقات بين هياكل المبيض مثل المسام والأوعية الدموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع الإجراءات التي تنطوي على الموضوعات الحيوان يتبع المبادئ التوجيهية "اللجنة الأخلاقيات الحيوان" في شانغهاي كلية الطب، جامعة فودان (الموافقة على رقم 20160225-013).

1-إعداد الماوس شفافة المبيض

  1. إعداد الحلول
    1. تحضير المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS) الحل (1 م، درجة الحموضة 7.6) مع 0.1% Triton X-100 (ببست). جعل 1 ل 10 x إلى برنامج تلفزيوني حل الأسهم، مزيج ز 87 من كلوريد الصوديوم، 3.1 ز نة2بو4 · 2 ح2س، و 28.7 ز غ2هبو4 ·12H2سين إضافة dH2س 1 لتر وآثاره ~ 2 حاء ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم N 1 وتخزين في درجة حرارة الغرفة. تمييع هذا الحل الأسهم 10 x من 1/10 باستخدام dH2س ومن ثم جعل 0.1% X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني.
    2. إعداد الحل المائية (درجة الحموضة 7.5) والاخت 4% (wt/المجلد) بارافورمالدهيد (PFA) الحل والاكريلاميد 4% (wt/المجلد) بيساكريلاميدي 0.05% (wt/المجلد) 0.25% (wt/المجلد) خامسا-044 البادئ في الماء المقطر مزدوجة على الجليد.
    3. إعداد الحل المقاصة (pH 8.5) عن طريق خلط 200 ملم بورات الصوديوم مخزن يحتوي على 4% (wt/المجلد) الصوديوم دوديسيل كبريتات (الحزب الديمقراطي الصربي) في الماء المقطر مزدوجة.
  2. إعداد نضح والمبيض ترانسكارديال
    1. تبقى جميع الحلول على الجليد خلال جميع الإجراءات.
    2. تخدير الكبار من الإناث البرية نوع C57BL/6 الماوس مع حقن داخل الحل بينتوباربيتال (0.35 ملغ/كغ). بمجرد أنه يظهر أي رد تو-قرصه، هو تخديره الماوس بشكل صحيح.
    3. استخدام الشريط مثبت لإصلاح الماوس مع أطرافه ملقاة على لوحة مسطحة رغوة.
    4. كشف القلب عن طريق شق على الرهابه العملية من خلال الصدر والجلد، والعظام مع المقص.
    5. جعل شق في الاذين الأيمن للحيوان، ومن ثم نتخلل البطين الأيسر مع 20 مل من برنامج تلفزيوني المثلج x 1 في 10 مل/دقيقة.
    6. نتخلل الحيوان مع مالا يقل عن 20 مل من محلول المائية في 10 مل/دقيقة.
    7. جداً الجلد على البطن على طول الخط ميديوفينترال مع مقص، الذي يعرض انتيروكوليا كله، وإزالة الأمعاء. جمع المبايض وكذلك الرحم للحفاظ على سلامة مورفولوجيا المبيض.
    8. إزالة الأنسجة الدهنية حول المبيض تحت مجهر.
  3. جليحه
    1. مكان المبايض في 10 مل هيدروجيل الحل عند 4 درجة مئوية للتثبيت لمدة 3 أيام.
    2. نقل المبيض في أنبوب 5 مل وملء الأنبوب مع الحل المائية. تمتد بارافيلم عبر الجزء العلوي من الأنبوب والتفاف ثم بارافيلم حول رقبة الأنبوب.
      تنبيه: تأكد من أنه لا يوجد أي فقاعات بين بارافيلم والحل المائية.
    3. ضع الأنبوب على شاكر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة أقصاها 3 ح السماح المائية بلمرة.
    4. قم بإزالة المبيض من الجل باستخدام ملعقة وعناية الجل الزائد من حول المبيض من المناديل الورقية. يغسل المبيض أربع مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x.
  4. إزالة المبنى للمجهول
    1. غمر المبيض في 10 مل الحل المقاصة. تهز بلطف 80 لفة في الدقيقة في 37 درجة مئوية لبدء عملية تطهير.
    2. وفي الأسبوع الأول، تغيير الحل كل 3 أيام. بعد أسبوع واحد، قم بتحديث الحل إزالة مرة واحدة أسبوع حتى المبيض يصبح واضحا. وعادة ما تستغرق هذه العملية حوالي 2-3 أسابيع.
      ملاحظة: يمكن أن تكون مباشرة من إيمونوستينيد المبيض أو يمكن تخزينها في أزيد الصوديوم (0.02 في المائة) في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع قبل إيمونوستينينج.

2-إيمونوستينينج

  1. يغسل المبيض مرتين في ببست في يوم 1 في 37 درجة مئوية في شاكر.
  2. احتضان المبيض في شاكر في الحل الأساسي الأجسام المضادة/ببست (الجدول 1) في يوم 2-3 عند 37 درجة مئوية. في الأعمال المعروضة هنا، الأجسام المضادة الأولية كانت الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء 1 (CD31) و hydroxylase التيروزين المخفف الساعة 01:10 و 01:50 في ببست، على التوالي.
    تنبيه: إذا كان يتم استخدام أنواع اثنين أو أكثر من الأجسام المضادة الأولية، تأكد من هناك مصادر حيوانية مختلفة.
  3. يغسل الأجسام المضادة الأولية مع المخزن المؤقت ببست في 37 درجة مئوية في يوم 4 في شاكر.
  4. احتضان المبيض مع الأضداد الثانوي المطلوب في ببست في يوم 5-6 في 37 درجة مئوية في شاكر. في الأعمال المعروضة هنا، كانت الأجسام المضادة الثانوية 488 الطحين أليكسا hydroxylase التيروزين واليكسا 594 الدقيق ل CD31 المخفف في 01:50 في ببست.
  5. يغسل الأجسام المضادة الثانوية مع المخزن المؤقت ببست في 37 درجة مئوية في يوم 7 في شاكر.
  6. نقل الأنسجة إلى الانكسار حل مطابق لتجانس الانكسار في يوم 8. وضع الأنسجة على ورقة مع خطوط الشبكة للتحقق من الوضوح البصري عن طريق التحقق من ما إذا كان يمكن رؤية خطوط الشبكة. بمجرد الأنسجة قد أوضح تماما، فإنه يمكن تصويرها.
  7. جعل اسطوانة معجون الذي يمكن أن يحيط فقط الأنسجة، ثم الشكل إلى شكل حدوة حصان واضغط ريدج الخارجي محكم إلى شريحة زجاج بغية جعل مساحة مغلقة. ينبغي أن يكون ارتفاع المعجون أطول قليلاً من المبيض.
  8. مكان المبيض أوضح بعناية في وسط المعجون وإضافة الانكسار مطابقة الحل. وضع صحن أسفل زجاج أكثر المعجون محكم واستخدام المعجون لإصلاح الطبق.

3-[كنفوكل] مجهرية

  1. للتصوير مجهر [كنفوكل]، في لوحة "ني-هاء" اختيار العدسة (في هذا غمر المياه قضية 25 X عدسة الهدف، 1.1-نا، 2 مم-WD) مع المسافة العمل المناسبة (في هذه الحالة مم 2.0).
  2. في لوحة "حيازة"، حدد العدد من القنوات. وهنا استخدام ثلاث قنوات.
    1. أولاً، استخدم علامة التبويب "ميناء العين" وعصا تحكم س وص لنقل الأنسجة إلى وسط الميدان عن طريق التحقق من خلال العدسات المجهر.
    2. بعد إيقاف تشغيل ضوء مصراع الكاميرا، انقر فوق علامة التبويب "حية" لضبط الليزر "السلطة"، "الجيش الكرواتي (كسب)"، و "إزاحة' لكل قناة بشكل منفصل. العالي للطاقة الليزر وذات الجهد العالي يمكن أن يؤدي إلى إشارات أعلى، وإزاحة أعلى يمكن الحد من الضوضاء الخلفية.
    3. تحديد السليم "حجم المسح" و "العد". استخدام حجم 1024 × 1024 ميكرومتر2 المسح الضوئي وعد من 4 إلى 8.
  3. بعد إعداد جودة الصورة لتحديد عمق النسيج في لوحة "زد كثافة التصحيح"، وبعد تحديد مكان العدسة على طبقة أعلى من المبيض (في وسط النسيج) وضبط حيازة للطبقة العليا، انقر فوق "plus" زر تحديد الطبقة العليا.
    1. تحريك العدسة لأسفل وتعيين HV المناسبة وطاقة الليزر للجزء السفلي من الأنسجة وإضافة المعلومات طبقة أدنى إلى الجدول التصحيح الكثافة Z. انقر فوق "إلى ND" لمزامنة الإعداد مع الفريق "اقتناء ND".
  4. لوحة في "شراء ND"، أول مجموعة خطوات عدد المسح الضوئي. ثم، ضع علامة على علامات التبويب "Z" و "الصورة الكبيرة".
    1. الانتقال إلى الإطار "مسح الصورة الكبيرة" لتحديد حجم الحقل وفقا لحدود الأنسجة مع مساعدة التصور الأنسجة من خلال العدسات. العودة إلى لوحة "اقتناء ND" لإدخال حجم منطقة المسح ("حقول") واختر التداخل بين 10% و 15%.
    2. انقر فوق "تصحيح تشغيل Z"، لا "التشغيل الآن"، تلقائياً تعيين السليم الجيش الكرواتي، وطاقة الليزر، وإزاحة لكل طبقة، وانتظر الصورة لعملية.

4-3D التعمير المسام الفردية وعلى فاسكولاتوريس

  1. أولاً، استخدم إيماجيج5 لفتح الملف الأصلي شيكل. انقر فوق الزر "الصورة" واختر "اللون" و "القنوات سبليت". ثم، انقر فوق "ملف" وحفظ القنوات بشكل منفصل كسلسلة ملف tiff باستخدام الخيار "تسلسل الصور" في "حفظ باسم".
  2. استخدام إيماريس لفتح واحدة من سلسلة ملف tiff. انقر فوق الزر "تحرير"، ثم اختر "إضافة قنوات" لإضافة بقية القنوات. يمكن تغيير اسم ولون القناة في علامات التبويب "عرض التسوية". سمك الأنسجة قد تحتاج إلى تصحيح في لوحة "خصائص الصورة" في القائمة المنسدلة تحت "تحرير".
  3. للاقتصاص 3D الصور النهائية وإزالة الأجزاء الزائدة، انقر فوق الزر "تحرير"، ثم اختر "3D المحاصيل". يمكن ضبط حجم الحقل بواسطة سحب الحدود.
  4. لإعادة بناء الإشارات السفينة مع خوارزمية خيوط في تفوق الفريق، انقر فوق الزر "خيوط" لإنشاء خيوط جديدة ثم انقر فوق التالي.
    1. بغية تحديد أكبر وأنحف القطر، انتقل إلى لوحة "شريحة" والعثور على السفينة التتبع. المسافة تلقائياً سيظهر على اللوحة "قياس" عن طريق تحديد نقطتين في عرض الحد الأقصى من السفينة.
    2. العودة إلى لوحة "تفوق" وإدخال قياس العرض وانقر فوق التالي.
  5. ضبط عتبة نقطة انطلاق والبذور. في لوحة "الكاميرا"، اختر "تحديد". إذا كان بعض المجالات المنتجة بشكل تلقائي بحاجة إلى إزالتها، اضغط shift وانقر على النقطة. باختيار "الانتقال" وتحريك الماوس، يمكن تدويرها الهيكل التأكد من أن جميع النقاط الصحيحة التي تم الاحتفاظ بها ومن ثم انقر فوق التالي.
  6. اختر عتبة أعلى للتباين المحلي ثم انقر فوق التالي. لا حدد "كشف الأشواك"، والاستمرار في وضع اللمسات الأخيرة على إعادة بناء الاسطوانة الأوعية الدموية. يمكن تحرير اللون بواسطة النقر فوق علامة التبويب "اللون". ويمكن استخراج البيانات الإحصائية في لوحة "إحصاء" من خيوط أعيد بناؤها. ويمكن إزالة الأجزاء الزائدة في لوحة "تحرير".
    ملاحظة: يمكن استخدام خوارزميات أخرى لقياس حجم المسام مجموع أو الجدران الحبيبي. في الأعمال المعروضة هنا، اتسمت بويضات أوتوفلوريسسينسي الأجسام المضادة الثانوية على حد سواء. بسبب كمية كبيرة من البيانات، استخدم ملقم محطة عمل لتحليل البيانات.

5-إحصائية تحليل

ملاحظة: يتم عرض بيانات تحليل الصورة كوسيلة ± الأخطاء المعيارية.

  1. إجراء مقارنات بين المسام باستخدام الاختبار t عينة مستقلة، واستخدم اختبار الارتباط بيرسون لمقارنة معاملات الارتباط للجدار جرابي وطول شعري. تعيين قيمة P < 0.05 كالحد لدلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

علينا تكييف أسلوب الوضوح السلبي إلى طريقة سريعة وبسيطة المبيض الخامل المقاصة مع الحفاظ على الهيكل الحبيبي والأوعية الدموية والحصول على إشارة الفلورية أعلى من علامات المسمى السفن والمسام. هندسة 3D المفرج جرابي تحددها إيمونوستينينج ل CD31، علامة لخلايا بطانية6. تم تتبعه تلطيخ CD31 في المبيض الفئران الكبار باستخدام خوارزمية الشعيرة وأظهرت العلاقات المتبادلة بين الشعيرات الدموية جرابي والمسام الابتدائي والثانوي (الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الدراسة الحالية، ونحن نقدم 3D التصوير لتقييم العلاقات بين الشعيرات الدموية والمسام تنامي الفردية. في أعمالنا السابقة باستخدام البروتوكول نفسه 9، قمنا بدراسة أدوار المفرج الكبيرة، والتفاعلات بين المسام، وموقع المسام في المبايض سليمة الماوس. النهج الوضوح السلبي الذي سمح لنا بدراسة فاسكولاتوريس الجزئي والكلى، وفوليكولوجينيسيس، والعلاقات المتبادلة بين صفراء المجاميع والمسام، وكذلك فيما يتعلق بإعادة بناء هيكل المبيض مراحل إنمائية مختلفة.

للحصول على بيانات الصورة ثلاثية ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من "الصندوق الخاص الصيني" عن Postdocs (رقم 2014T70392 إلى يلافن)، مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81673766 إلى يلافن) والصندوق فتيلة المعلم الجديد، زوزو مؤسسة جامعة فودان، وتطوير المشروع الذروة شانغهاي التكاملية تخصصات الطب (20150407).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أكريلاميدفيتيكv900845http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/vetec/v900845
طحين اليكسا 488 (التخفيف 1:50) لايف تكنولوجيزA11039https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Chicken-IgY-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11039
طحين أليكسا 594 (التخفيف 1:50)لايف تكنولوجيزA11012https://www.thermofisher.com/antibody/product/Goat-anti-Rabbit-IgG-H-L-Cross-Adsorbed-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-11012
بيساكريلاميدأمريسكو172http://www.amresco-inc.com/BIS-ACRYLAMIDE-0172.cmsx
طبق زجاجي ذو قاع زجاجي أسود (Willco-Dish)تيد بيلا14032http://www.tedpella.com/section_html/706dish.htm#black_wall
حمض البوريككاشف كيميائي سينوفارم10004818http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10004818
فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم دوديكاهيدرات (Na2< / sub>HPO4 12H2< / sub>O)كاشف سينوفارم الكيميائي10020318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10020318
FocusClearCelexplorerFC-102http://www.celexplorer.com/product_list.asp?MainType=107&BRDarea=1
ParafilmBemisPM996http://www.parafilm.com/products
بارافورمالديهايدسينوفارم كيماويكال كاشف80096618http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=80096618
PECAM1 / CD31 ، جزيء التصاق الخلايا البطانية الصفائح الدموية 1 (التخفيف 1:10) Abcamab28364http://www.abcam.com/cd31-antibody-ab28364.html
Photoinitiator VA044Wakova-044 / 225-02111http://www.wako-chem.co.jp/specialty/waterazo/VA-044.htm
أزيد الصوديومسيجماS2002http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/s2002?lang=en®ion=US
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)كاشف سينوفارم الكيميائي10019318http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019318
ثنائي هيدرات فوسفات ثنائي هيدروجين الصوديوم (NaH2PO4 2H2O)كاشف سينوفارم الكيميائي20040718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=20040718
كاشف كيميائيدوديسيل الصوديوم30166428
هيدروكسيد الصوديوم http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30166428 هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)كاشف سينوفارم الكيميائي10019718http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=10019718
كاشف كيميائي تريتون X-100سينوفارم30188928http://en.reagent.com.cn/enshowproduct.jsp?id=30188928
هيدروكسيلاز التيروزين (TH ، التخفيف 1:50)Abcamab76442http://www.abcam.com/tyrosine-hydroxylase-phospho-s40-antibody-ab51206.html

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, H. M., Russell, D. L. Blood and lymphatic vasculature in the ovary: development, function and disease. Hum Reprod Update. 20 (1), 29-39 (2014).
  2. McFee, R. M., et al. Inhibition of vascular endothelial growth factor receptor signal transduction blocks follicle progression but does not necessarily disrupt vascular development in perinatal rat ovaries. Biol Reprod. 81 (5), 966-977 (2009).
  3. Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (20), 7212-7217 (2008).
  4. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  5. Schindelin, J., et al. Fiji: an Open Source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  6. Cao, G., Fehrenbach, M. L., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Zhu, J. X., Delisser, H. M. Angiogenesis in platelet endothelial cell adhesion molecule-1-null mice. Am J Pathol. 175 (2), 903-915 (2009).
  7. Manni, L., Holmäng, A., Lundeberg, T., Aloe, L., Stener-Victorin, E. Ovarian expression of alpha (1)- and beta (2)-adrenoceptors and p75 neurotrophin receptors in rats with steroid-induced polycystic ovaries. Auton Neurosci. 118 (1 - 2), 79-87 (2005).
  8. Chourasia, T. K., Chaube, R., Singh, V., Joy, K. P. Annual and periovulatory changes in tyrosine hydroxylase activity in the ovary of the catfish Heteropneustes fossilis. Gen Comp Endocrinol. 166 (1), 111-116 (2010).
  9. Feng, Y., et al. CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions. Sci Rep. 7, 44810(2017).
  10. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  11. Liang, H., Schofield, E., Paxinos, G. Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique. J Vis Exp. (108), e53673(2016).
  12. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  13. Phillips, J., Laude, A., Lightowlers, R., Morris, C. M., Turnbull, D. M., Lax, N. Z. Development of passive CLARITY and immunofluorescent labelling of multiple proteins in human cerebellum: understanding mechanisms of neurodegeneration in mitochondrial disease. Sci Rep. 6, 26013(2016).
  14. Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY. J Vis Exp. (112), (2016).
  15. Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing. Exp Mol Med. 48 (12), e274(2016).
  16. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  17. Chung, A. S., Ferrara, N. Developmental and pathological angiogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 563-584 (2011).
  18. Rodgers, R. J., Irving-Rodgers, H. F. Formation of the ovarian follicular antrum and follicular fluid. Biol Reprod. 82 (6), 1021-1029 (2010).
  19. Siu, M. K. Y., Cheng, C. Y. The blood-follicle barrier (BFB) in disease and in ovarian function. Adv Exp Med Biol. 763, 186-192 (2014).
  20. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat Methods. 4, 331-336 (2007).
  21. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  22. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).
  23. Kuwajima, T., et al. Clear(T): a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
  24. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).
  25. Lai, H. M., et al. Rationalisation and validation of an acrylamide-free procedure in three-dimensional histological imaging. PLOS ONE. 11, e0158628(2016).
  26. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  27. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free-of-acrylamide SDS-based tissue clearing (FASTClear): A novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualisation of human brain tissues. Neuropathol Appl Neurobiol. 43, 346-351 (2016).
  29. Xu, N., et al. Fast free-of-acrylamide clearing tissue (FACT)-an optimized new protocol for rapid, high-resolution imaging of three-dimensional brain tissue. Sci Rep. 7, 9895(2017).
  30. Migone, F. F., Cowan, R. G., Williams, R. M., Gorse, K. J., Zipfel, W. R., Quirk, S. M. In vivo imaging reveals an essential role of vasoconstriction in rupture of the ovarian follicle at ovulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 2294-2299 (2016).
  31. Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. A whole-mount approach for accurate quantitative and spatial assessment of fetal oocyte dynamics in mice. Biol Reprod. 93 (113), (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

3D ReconstructionMultiphoton Confocal MicroscopyImmunostaining CD31Follicular CapillariesHydrogel FixationTissue ClearingImage Analysis

مقالات ذات صلة