تم تحقيق اشتقاق قوي من الخلايا الجذعية المحفزة البشرية (هيبس) باستخدام فيروس سينداي غير متكامل (سيف) ناقلات بوساطة إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. تم تنفيذ صيانة الخلايا هيبس والتوسع النسيلي باستخدام ظروف زراعة خالية من الكينو و كيميائيا مع المؤتلف الإنسان لامينين 521 (لن-521) مصفوفة و E8 الأساسية (E8) المتوسطة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التكامل الانشطار الحرة من الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان المستحث باستخدام مصفوفة لامينين 521
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وتعتبر الظروف الخالية من الغينو والظروف المحددة تماما معلمات أساسية للتوليد القوي والقابل للتكاثر للخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان. صيانة خلايا هيبس على الخلايا المغذية أو المصفوفات غير محددة عرضة للفروق دفعة، التلوث المسببة للأمراض وخطر المناعة. استخدام المصفوفة الإنسان لامينين 521 (لن-521) المؤتلف محددة في تركيبة مع تركيبات وسائل الإعلام خالية من شينو ومحددة يقلل من التباين ويسمح للجيل ثابت من خلايا هيبس. ناقل فيروس سينداي (سيف) هو نظام غير قائم على الحمض النووي الريبي القائم على الحمض النووي الريبي، وبالتالي التحايل على المخاوف المرتبطة التأثير المحتمل التخريبية على سلامة الجينوم نواقل دمج يمكن أن يكون. وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه النواقل كفاءة عالية نسبيا في إعادة برمجة الخلايا الليفية الجلدية. وبالإضافة إلى ذلك، الأنزيمية خلية واحدة تمرير الخلايا يسهل صيانة متجانسة من خلايا هيبس دون خبرة سابقة كبيرة من الجذعية سيليرة لبنانية الثقافة. نحن هنا وصف البروتوكول الذي تم اختباره على نطاق واسع وتطويرها مع التركيز على استنساخ وسهولة الاستخدام، وتوفير وسيلة قوية وعملية لتوليد وخلايا هيبس الإنسان محددة وخالية من خلايا الخلايا الليفية.
المقدمة
منذ اشتقاق الأول من خطوط الخلايا هيبس تاكاهاشي وآخرون. 1 ، 2 ، وقد وفرت خلايا هيبس أداة مفيدة لنمذجة المرض، واكتشاف المخدرات وكمادة المصدر لتوليد العلاجات خلية في الطب التجديدي 3 . وقد اعتمدت ثقافة الخلايا هيبس منذ فترة طويلة على المشاركة في الثقافة مع الخلايا المغذية الليفية 4 ، 5 أو على ماتريجيل 6 ومع تركيبات وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل الأبقار الجنين (فبس). وتعتبر الفروق بين الدفعة والدفعة نتيجة شائعة للطبيعة غير المعرفة لظروف الثقافة هذه، مما يؤدي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على جمع مواد المريض واشتقاق خلايا هيبس من قبل مجلس مراجعة الأخلاقيات، ستوكهولم، 28 مارس 2012، رقم التسجيل: 2012 / 208-31 / 3. وينبغي إجراء خطوات ثقافة الخلية في خزانات السلامة الأحيائية ما لم يذكر خلاف ذلك. دائما ممارسة تقنيات التعامل مع العقيمة عند العمل مع الخلايا. السماح لوسائل الإعلام، لوحات والكواشف للوصول إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 في الرطوبة العالية.
1. عزل الخلايا الليفية البشرية من خزعة الجلد
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
من خزعة إلى خلايا هيبس
العملية برمتها من خزعة إلى خلايا هيبس أنشئت، واضحة من إعادة برمجة ناقلات وجاهزة لتوصيف، يستغرق حوالي 16 أسبوعا ( الشكل 1 ). ويرد جدول زمني أكثر تفصيلا في الشكل 2A . هناك حاجة إلى حوالي 4 أسابيع لإنشاء وتوسيع الثقافات الليفية. بدأت مستعمرات الخلايا هيبس الأولى في الظهور .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
النتيجة المتوقعة من هذا البروتوكول هو الجيل الناجح لعدة خطوط الخلايا هيبس المستمدة كلونالي. الأهم من ذلك، فإن طريقة لصيانة وتوسيع خلايا هيبس أنشئت هنا هو موثوق بها ويمكن أن يؤديها مع القليل من الخبرة السابقة من ثقافة الخلايا الجذعية. ومن المعروف أن الأنزيمية خلية واحدة الممرات مع روكي جنبا إلى جنب مع مصفوفة لن-521 للحفاظ على الخلايا كما طبيعية كاريوتيبتيك، متعددة القدرات وقادرة بسهولة على التفريق مع تجنب عدم التجانس التي يسببها المستعمرة باسد الممهدة يمكن أن تحفز
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإبلاغ.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل من قبل سف (B13-0074) و فينوفا (2016-04134) وكلاء التمويل.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Dispase | Life Technologies | 171105-041 | الهضم |
| كولاجيناز | سيجما | C0130 | هضم |
| الجيلاتين | سيجما | G1393 | مصفوفة الخلايا الليفية |
| IMDM | Life Technologies | 21980002-032 | Fibroblast medium |
| FBS | Invitrogen | 10270106 | Fibroblast |
| mediumبنسلين / ستربتومايسين | لايف تكنولوجيز | 15070-063 | المضادات الحيوية |
| الأساسية 8 وسائط | ThermFisher Scientific | A1517001 | iPS وسائط زراعة الخلايا |
| LN-521 | Biolamina | LN521-03 | مصفوفة ثقافة الخلايا |
| iPS TrypLE حدد 1X | كاشف تفكك | 12563011 ThermoFisher | |
| Scientific مثبط rho-kinase Y27632 | Millipore | SCM075 | مثبط Rho-kinase (ROCKi) |
| CytoTune – iPS 2.0 إعادة برمجة مجموعة | Life Technologies | A1377801 | ناقلات إعادة برمجة فيروس سينداي |
| 35 مم طبق زراعة الأنسجة | Sarstedt | 83.3900.300 | زراعة الخلايا |
| 60 مم أطباق زراعة الأنسجة | Sarstedt | 83.3901.300 | زراعة الخلايا |
| 24 لوحة زراعة أنسجة جيدة | Sarstedt | 83.3922.300 | قوارير زراعة الأنسجة |
| T25 لزراعة | الخلايا VWR | 734-2311 | زراعة الخلايا |
| 15 مل أنابيب | كورنينج | 430791 | الطرد المركزي |
| 1.5 مل أنبوب | Eppendorf | 0030123.301 | أنبوب 1.5 مل |
| CoolCell LX | Biocision | BCS-405 | التجميد |
| DMSO | Sigma | D2650-100ml | تجميد الخلايا الليفية |
| Cryovials 1.8 مل | VWR | 479-6847 | Cryovials |
| PSC Cryoconservation | Gibco | A2644601 | PSC Cryomedium RevitaCell |
| Supplement Trypsin-EDTA (0.05٪) | ThermoFisherScientific | 25300054 | إنزيم تفكك الخلايا الليفية |
| DMEM / F12 | Life Technologies | 31331-028 | إنزيمات الجهاز الهضمي المخففة |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | PBS |
| HBSS | ThermoFIsher Scientific | 14025-050 | تحضير الخزعة |
| كثافة الدم | Sigma | BRAND ، 718920 | عد الخلايا |
| Parafilm | VWR | 291-1213 | لوحات مانعة للتسرب للتخزين |
المراجع
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced p....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
