Method Article

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

DOI:

10.3791/56176

⸱

January 10th, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 3Department of Neurological Surgery, University Hospital-Case Medical Center, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد على بروتوكول فحص كفاءة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال في الخلايا الجذعية جليوبلاستوما (جسكس). ويستند المقايسة مراسل تمايز خلايا الجذعية حيث التعبير عن تعزيز التجارة والنقل (اجفب) بدافع المروج توصيني البشرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جليوبلاستوما (GBM) هو ورم الدماغ الأولية الأكثر شيوعاً والأكثر فتكاً في البالغين، مما تسبب في وفاة 14,000 تقريبا كل سنة في الولايات المتحدة وحدها. متوسط البقاء على قيد الحياة بعد التشخيص أقل من 15 شهرا مع العلاج الكيميائي الاستئصال، والإشعاع، وتيموزولوميدي الجراحية القصوى. وقد أصبح واضحا بصورة متزايدة التحديات الكامنة في تطوير علاجات أكثر فعالية في الخليج للحاسبات الآلية، وتشمل اختزاع لا ينضب، ومقاومته للعلاجات القياسية، وتعقيد الوراثية والتكيف الجزيئي والفئات السكانية الفرعية من الخليج للحاسبات الآلية الخلايا مع التشابه المظهرية للخلايا الجذعية الطبيعية، يشار هنا إلى جليوبلاستوما الخلايا الجذعية (جسكس). لأن جسكس مطلوبة لنمو الورم والتقدم، يمثل العلاج القائم على التمييز بين طريقة معالجة ناجعة لهذه الأورام المستعصية.

البروتوكول التالية تصف مجموعة من الإجراءات إنشاء إنتاجية عالية فحص منصة تهدف إلى تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال GSC. في جوهر هذا النظام الدبقية فيبريلاري حمضية بروتين (توصيني) تمايز مراسل-بناء. ويتضمن البروتوكول الإجراءات العامة التالية: (1) إنشاء خطوط مراسل التمايز غسك؛ (2) اختبار/التحقق من أهمية المراسل بالنسبة للقدرات الذاتية-تجديد/كلونوجينيك غسك؛ وتدفق عالية القدرة (3)-الخلوي على أساس فحص المخدرات.

منصة الفحص يوفر نهج بسيطة وغير مكلفة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز جسكس. وعلاوة على ذلك، استخدام المكتبات للأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وينطوي على إمكانية للتعرف على العوامل التي يمكن أن تكون أغراض أخرى أكثر سرعة. أيضا، يتوقع العلاجات التي تعزز سرطان الخلية الجذعية التمايز تآزر مع العلاجات "معيار الرعاية" الحالية التي أثبتت لاستهداف والقضاء على الدرجة الأولى أكثر من الخلايا السرطانية المتباينة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن أورام تحتوي على عدد صغير من سكان من الخلايا، وتسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) أو الشروع في ورم الخلايا، التي هي المسؤولة عن تطور الورم وورم خبيث، ومقاومة للعلاج الكيماوي وراديو 1، 2-وجود الخلايا الجذعية السرطانية وعلى نسلها أكثر تمايزاً داخل الأورام يعتبر عاملاً مهما في تعزيز عدم تجانس intratumoral وهكذا يمثل عقبة رئيسية في علاج السرطانات3. والهم التسلسل الهرمي لخلية الورم، قدمتها سرطان الخلية الجذعية من الناحية النظرية، وضع استراتيجيات جديدة لعلاج السرطان 4. نهج واحد لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية هو تحديد وتمنع المسارات م....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم شراء أستروجليال ونظم مراسل lentivirus الخلايا العصبية الاستعدادات لينتيفيرال المعلبة، ومركزة. المعرفة الأساسية للتدفق الخلوي تقنية مطلوب. أيضا، الاستخدام كامل لهذا البروتوكول سوف يحتاج المستخدم الوصول إلى سيتوميتير تدفق مع قدرة إنتاجية عالية (يقبل لوحات 96-جيدا كمصدر العينة).

1-نظام مراسل النسخي لينتيفيرال

ملاحظة: في جميع التحليلات سيتوميتريك التدفق، استخدام الخلايا الأبوية، غير ترانسدوسيد، أو ترانسدوسيد ناقل الخلايا (غير الفلورية) لإنشاء خط الأساس الأسفار. أيضا، علما بأن في كل الخطوات حيث يسمى تريتوريشن الميكانيكية، أن يكون لطيف. تريتوريشن قاسية يمكن قتل عدد كبير من جسكس الهشة والتأثير على نتائج التدفق ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت ترانسدوسيد مع المراسل أستروجليال lentivirus ترميز للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) تنصهر في إطار مع كاسيت مقاومة زيوسين ثلاثة خطوط مستقلة نيوروسفيريس المستمدة من المريض ومدفوعة بواسطة توصيني المروج العنصر البشري ( الشكل 1). استنساخ الفردية التالية تم عزلة بواسطة طلاء الخلايا 0.7 كل بئر في صفيحة جيدا 96 (الشكل 2)، وأعقب ذلك التدفق سيتوميتريك تحديد النسبة المئوية للخلايا معربا عن التجارة والنقل (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن معظم الدراسات السابقة من جسكس وركزت أساسا على العلامات التي تحدد لهم، في هذه الدراسة قررنا اتخاذ نهج عكسي. نحن تركز أساسا على نسلها متمايزة المتولدة عن جسكس (مثلاً، يعبر عن أستروجليال وعلامات العصبية الخلايا). هنا نظهر استخدام المخدرات إنتاجية عالية يستند إلى الخلية فحص النظام، الذي يستند إلى توصيني البشرية تعتمد على مروج التعبير عن التجارة والنقل. أجريت جميع التجارب التي تستخدم خطوط الخلايا جليوبلاستوما نيوروسفيري المستمدة من المريض. يتم وصف بروتوكول مفصلة تصف العزلة والتوسع في هذه الخطوط في جالي et al

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ودعمت هذا العمل تم جزئيا ب R01CA187780 المعاهد الوطنية للصحة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ESGRO Complete AccutaseEMD MilliporeSF006
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma AldrichD2650
HBSS (محلول الملح المتوازن من Hank)Sigma AldrichH6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo ، Virus)SBI (System Biosciences)SR10015VA-1
50 مل كاشف معقم يمكن التخلص منه الخزانات Corning4870
6 لوحةآبار Thermo Fisher Scientific130184
96 لوحة بئرFalcon353072
Biolite T25 سم & sup2 ؛ قارورة تهويةثيرمو فيشر ساینتفيك130189
بيوليت T75 سم & sup2 ؛ قارورة تهويةثيرمو فيشر Scientific130190
15 مل أنابيب الطرد المركزيCelltreat229411
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر ساينتفيك05-408-129
ماصة Ovation متعددة القنوات ، 12 قناة ، 0.5 - 20uLVistaLab Technologies1060-0020
ماصة Ovation متعددة القنوات ، 12 قناة ، 5-250uLVistaLab التقنيات1060-0250
أطراف ماصة متعددة 12 قناة 25 & mu; لVistaLab Technologies4060-1002
أطراف ماصة متعددة 12 قناة 250 مو ؛ لVistaLab Technologies4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cellular EMDMillipore0500-4005
المجموعات السريرية للمعاهد الوطنية للصحة 1 و 2 مكتبات الجزيئات الصغيرةEvotec
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>لتحضير وسائط الخلايا الجذعية العصبية (500 مل) < / قوي ><قوي > التركيز النهائي < / قوي >
BSAGoldBio.comA-421-2500.20٪
DMEM / F12 10Xكورنينج90-091-PB1X
ملح الصوديوم الهيبارينسيجما ألدريتشH31490.0002٪
هيبس 1Mسيجما ألدريتشH40365.4 ملي مولار
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS -G) (100X)Life Technologies41400-0451X
NaHCO3Sigma AldrichS-576114.5 ملي مولار
البنسلين - الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) 100Xجيبكو15140-1221X
البروجسترونسيجما ألدريتشP878316 نانومتر
بوتريسينسيجما ألدريتشP57804.8 & M
Basic FGF (FGF2) ، HumanGoldBio1140-02-5010 نانوغرام / مل
EGF ، HumanGoldBio1150-04-10020 نانوغرام / مل
فلتر أعلى الزجاجة ، 150 مل ، 33 مم ، 0.22 ميكرومتر ، PES ، S ، IndCorning431160استخدم لتصفية الوسائط المعقمة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-406....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glioblastoma Stem CellsFlow Cytometry ScreeningGFAP Reporter ConstructSmall Molecule ScreeningCellular Differentiation AssayDrug Repurposing PlatformLentivirus TransductionNeurosphere FormationGFP Positive CellsHigh Throughput Screening

Related Articles