مقالة منهجية

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

DOI:

10.3791/56176

⸱

يناير 10, 2018

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurological Surgery, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine, 2Department of Pathology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 3Department of Neurological Surgery, University Hospital-Case Medical Center, Case Comprehensive Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد على بروتوكول فحص كفاءة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال في الخلايا الجذعية جليوبلاستوما (جسكس). ويستند المقايسة مراسل تمايز خلايا الجذعية حيث التعبير عن تعزيز التجارة والنقل (اجفب) بدافع المروج توصيني البشرية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جليوبلاستوما (GBM) هو ورم الدماغ الأولية الأكثر شيوعاً والأكثر فتكاً في البالغين، مما تسبب في وفاة 14,000 تقريبا كل سنة في الولايات المتحدة وحدها. متوسط البقاء على قيد الحياة بعد التشخيص أقل من 15 شهرا مع العلاج الكيميائي الاستئصال، والإشعاع، وتيموزولوميدي الجراحية القصوى. وقد أصبح واضحا بصورة متزايدة التحديات الكامنة في تطوير علاجات أكثر فعالية في الخليج للحاسبات الآلية، وتشمل اختزاع لا ينضب، ومقاومته للعلاجات القياسية، وتعقيد الوراثية والتكيف الجزيئي والفئات السكانية الفرعية من الخليج للحاسبات الآلية الخلايا مع التشابه المظهرية للخلايا الجذعية الطبيعية، يشار هنا إلى جليوبلاستوما الخلايا الجذعية (جسكس). لأن جسكس مطلوبة لنمو الورم والتقدم، يمثل العلاج القائم على التمييز بين طريقة معالجة ناجعة لهذه الأورام المستعصية.

البروتوكول التالية تصف مجموعة من الإجراءات إنشاء إنتاجية عالية فحص منصة تهدف إلى تحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز أستروجليال GSC. في جوهر هذا النظام الدبقية فيبريلاري حمضية بروتين (توصيني) تمايز مراسل-بناء. ويتضمن البروتوكول الإجراءات العامة التالية: (1) إنشاء خطوط مراسل التمايز غسك؛ (2) اختبار/التحقق من أهمية المراسل بالنسبة للقدرات الذاتية-تجديد/كلونوجينيك غسك؛ وتدفق عالية القدرة (3)-الخلوي على أساس فحص المخدرات.

منصة الفحص يوفر نهج بسيطة وغير مكلفة لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز جسكس. وعلاوة على ذلك، استخدام المكتبات للأدوية التي وافقت عليها إدارة الأغذية والعقاقير وينطوي على إمكانية للتعرف على العوامل التي يمكن أن تكون أغراض أخرى أكثر سرعة. أيضا، يتوقع العلاجات التي تعزز سرطان الخلية الجذعية التمايز تآزر مع العلاجات "معيار الرعاية" الحالية التي أثبتت لاستهداف والقضاء على الدرجة الأولى أكثر من الخلايا السرطانية المتباينة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن أورام تحتوي على عدد صغير من سكان من الخلايا، وتسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) أو الشروع في ورم الخلايا، التي هي المسؤولة عن تطور الورم وورم خبيث، ومقاومة للعلاج الكيماوي وراديو 1، 2-وجود الخلايا الجذعية السرطانية وعلى نسلها أكثر تمايزاً داخل الأورام يعتبر عاملاً مهما في تعزيز عدم تجانس intratumoral وهكذا يمثل عقبة رئيسية في علاج السرطانات3. والهم التسلسل الهرمي لخلية الورم، قدمتها سرطان الخلية الجذعية من الناحية النظرية، وضع استراتيجيات جديدة لعلاج السرطان 4. نهج واحد لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية هو تحديد وتمنع المسارات مما يشير إلى أن من المعروف أن تكون مطلوبة خلال التطور الجنيني للجهاز المتأثر. في الواقع، نحن وآخرون قد نشرت سابقا أوراق متعددة تصف الاحتياجات الجارية ذات الصلة بالخلايا الجذعية إشارات المسارات العصبية القنفذ سونيك والشق في جليوبلاستوما5،،من67. وقد ساعد هذا العمل في توطيد الأساس المنطقي لعدة تجارب سريرية في الخليج للحاسبات الآلية. ثمة نهج ثان لاستهداف الخلايا الجذعية السرطانية تعزيز هذه التفرقة. هذا النهج قد تلقت الكثير من الدعم بسبب نتائج إيجابية من الدراسات السريرية والاكلينيكية في علاج اللوكيميا الحادة بروميلوسيتيك مع الأحماض الريتينويك (ATRA، بث فيتامين (أ)). هنا وجد ATRA إزالة كتلة النضوج وتعزيز سرطان الخلية التمايز8. في الآونة الأخيرة، بيكسيريلو والزملاء أناقة أظهرت أن BMP-4 يعزز التمايز غسك إلى astrocytes مع GBM مكافحة كبير الأثر في المختبر و في فيفو9.

الأساس المنطقي للدراسة الحالية تستند إلى نهج "عكس هندسة" لاستهداف جسكس. ونظرا لعدم تجانس الواسعة الحالية في الخليج للحاسبات الآلية ومع التمايز الفقيرة كونها واحدة من السمات المميزة للسرطان، سألنا إذا نحن يمكن أن تعزز النمط الظاهري أكثر إيجابية-التفريق في دولة مثل أستروسيتي. هنا، لم يكن لدينا علم مسبق بالممرات مما يشير إلى أن الحفاظ على جسكس في عينة ورم معين ولكن بدلاً من ذلك يهدف إلى تحقيق النمط الظاهري المطلوب (مثلاً توصيني الإيجابية).

ويصف هذا التقرير الإجراءات المستخدمة لإنشاء غسك التمايز مراسل خطوط من توصيل الثقافات إثراء غسك غسك اختيار الاستنساخ. تم إنشاء خطوط نيوروسفيري جليوبلاستوما المستخدمة في مختبر البروفيسور أنجيلو فيسكوفي من المرضى مع تشخيص جليوبلاستوما الأولية في "مستشفى سان رافائيل"-ميلانو، إيطاليا. وقد درست هذه الخطوط على نطاق واسع في عدة منشورات 6،10،،من1112،،من1314. يوصي بشدة أن الأفراد الذين يرغبون في تنفيذ هذه التقنيات في المختبر تحديد أهمية المراسل بالنسبة لسرطان الخلايا الجذعية الذاتي تجديد القدرات في الخلايا أنهم يخططون للدراسة (وهذا صحيح بالنسبة لأي مراسل). بروتوكول مفصل لواحدة من في المختبر كلونوجينيك فحوصات المقبولة في المجال يتم توفيرها لإنجاز هذا15،16. وأخيراً، يرد بروتوكول مفصلة تصف الاستفادة من التمايز المراسل الخطوط في شاشة المخدرات تدفق-الخلوي على أساس في النهاية. من المذكرة، وبالمثل إلى نظام التمايز أستروجليال الموصوفة هنا، لدينا بنجاح المنشأة والتحقق من صحة غسك مراسل خطوط دمج مراسل (تمايز الخلايا العصبية) MAP2:GFP. ولذلك، تصف المنهجيات في هذه الورقة يمكن تطبيقها على دراسة التمايز الخلوي إلى مختلف الخلايا الأنساب.

يمكن العثور على بعض الأرقام الواردة في هذا التقرير في منشور صدر مؤخرا: "اتراكوريوم بزيلات وغيرها من العوامل حظر الأعصاب تشجيع التمايز أستروجليال وتستنزف جليوبلاستوما الخلايا الجذعية البالغة18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تم شراء أستروجليال ونظم مراسل lentivirus الخلايا العصبية الاستعدادات لينتيفيرال المعلبة، ومركزة. المعرفة الأساسية للتدفق الخلوي تقنية مطلوب. أيضا، الاستخدام كامل لهذا البروتوكول سوف يحتاج المستخدم الوصول إلى سيتوميتير تدفق مع قدرة إنتاجية عالية (يقبل لوحات 96-جيدا كمصدر العينة).

1-نظام مراسل النسخي لينتيفيرال

ملاحظة: في جميع التحليلات سيتوميتريك التدفق، استخدام الخلايا الأبوية، غير ترانسدوسيد، أو ترانسدوسيد ناقل الخلايا (غير الفلورية) لإنشاء خط الأساس الأسفار. أيضا، علما بأن في كل الخطوات حيث يسمى تريتوريشن الميكانيكية، أن يكون لطيف. تريتوريشن قاسية يمكن قتل عدد كبير من جسكس الهشة والتأثير على نتائج التدفق الخلوي.

  1. بلايت 1 × 106 خلايا في 2 مل من الخلايا الجذعية العصبية كاملة النمو المتوسطة في لوحة 6-مولتيويل.
  2. ترانسدوسي الخلايا عن طريق إضافة lentivirus مراسل في تعدد العدوى (وزارة الداخلية) تساوي 5.
  3. إضافة 2 ميليلتر من بوليبريني لتركيز نهائي 8 ميكروغرام/مل.
  4. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 بين عشية وضحاها.
  5. في اليوم التالي، استبدال المتوسطة النمو لإزالة الفيروسات غير منضم. ضع اللوحة في الحضانة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2 واحتضانها ح 24.
  6. الحصاد 0.5 مل الحجم الإجمالي؛ زيادة ونقصان لأسفل الخلايا في 360 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في أنبوب مخروطي 15 مل وإزالة المادة طافية بالطموح. إضافة 0.5 مل متوسط نمو جديدة من الخلايا الجذعية العصبية إلى الخلايا المتبقية وإعادة اللوحة إلى حاضنة لاستمرار التوسع.
  7. إضافة 200 ميليلتر من كاشف الانفصال واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  8. فصل الخلايا بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    ملاحظة: قد يؤدي تريتوريشن قاسية قتل كبير من جسكس، وعادة ما يتحقق الانفصال التام بعد 20-30 مرة.
  9. للتقليل من مرفق خلية أو التجميع، إضافة 800 ميليلتر من موازنة الملح الحل (حبس هانك) لوحدة تخزين نهائي 1 مل.
  10. نقل 200 ميليلتر من كل تعليق خلية إلى بئر صفيحة 96-مولتيويل.
  11. لتنفيذ هذا الإجراء، استخدام cytometer تدفق benchtop مع قدرة لوحة 96-جيدا مزودة بليزر أزرق للإثارة ولديها القدرة على الكشف عن بروتين فلوري أخضر. أداء تحليل تدفق سيتوميتريك مع خلايا قابلة للتطبيق على الأقل 10,000 للحصول على كل.
  12. تحديد النسبة المئوية للتجارة والنقل-إيجابية الخلايا عن طريق التدفق الخلوي.

2-سوبكلون التحديد والتوسع، والتحقق من الصحة

  1. لوحة خلايا في 100 ميليلتر من متوسط الخلايا الجذعية العصبية في كثافة الخلايا 0.7 كل من صفيحة 96-مولتيويل جيدا.
  2. ثقافة استنساخ لمدة 11 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2. هذه الخطوة هو درجة عالية من نوع الخلية التابعة وسيتطلب على الأرجح تعديلاً على أساس خط الخلية المستخدمة. كقاعدة عامة، قطر مجال 100 ميكرومتر ≥ مؤشرا جيدا على وجود كلونوجينيك جسكس في نيوروسفيريس.
  3. استخدام مجهر فلوري مزودة بعامل تصفية فيتك، وضع علامة على الآبار التي تحتوي نيوروسفيري واحد حيث ~ 1-5 ٪ الخلايا هي الحاملات للتجارة والنقل.
    ملاحظة: تحديد النسبة المئوية الدقيقة للخلايا بروتينات فلورية خضراء-الإيجابية ليست حاسمة جداً في هذه المرحلة. سيتم تقييم كل من سوبكلونيس في وقت لاحق بالتدفق الخلوي. يتم إجراء هذه الخطوة للحد من المجموع عدد من الحيوانات المستنسخة تحليلها مع التركيز على نيوروسفيريس التي تنشأ قبل متمايز، توصيني سالب، GSC.
  4. قم بتوسيع استنساخ مراسل المحدد حتى هناك عدد كاف من الخلايا لتحليلها بالتدفق الخلوي. بئر الفرعية المتلاقية للوحة 6-مولتيويل التي تحتوي على 1.5x10 ≤5 خلايا/مل ينبغي توفير عدد كاف من الخلايا.
    ملاحظة: إجراء مفصل للعزل والتوسع في جسكس هو متاح 17.

3-تحديد التعبير GFAP:GFP بالتدفق الخلوي

  1. الحصاد قاسمة للخلايا (0.5 مل) من كل استنساخ مراسل والضوابط غير ترانسدوسيد لتحديد النسبة المئوية الدقيقة للخلايا الحاملات للتجارة والنقل. تفكر في الحيوانات المستنسخة مراسل التي تحتوي على خلايا الحاملات للتجارة والنقل ~ 1-5%.
  2. تدور الخلايا في 360 x ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة طافية بالطموح.
  3. إضافة 200 ميليلتر من الخلية تفكك كاشف كل بيليه، واحتضان هذه الأنابيب في حمام مائي بتعيين إلى 37 درجة مئوية.
  4. تريتوراتي الخلايا بلطف تحقيق تعليق خلية مفردة (عادة ما بين 20 إلى 30 مرة).
  5. للتقليل من مرفق خلية أو التجميع، إضافة 800 ميليلتر حبس إلى وحدة تخزين نهائي 1 مل.
  6. نقل 200 ميليلتر كل من صفيحة 96-مولتيويل جيدا من كل تعليق خلية.
  7. لتنفيذ هذا الإجراء، استخدام cytometer تدفق benchtop مع قدرة لوحة 96-جيدا. أداء تحليل تدفق سيتوميتريك مع خلايا قابلة للتطبيق على الأقل 10,000 للحصول على كل.

4-الدا الذاتي تجديد المقايسة لتقييم قدرة كلونوجينيك

ملاحظة: لعناصر التحكم، كلا الوالدين، غير ترانسدوسيد، فضلا عن الإعراب عن التجارة والنقل ترانسدوسيد lentivirus، ينبغي استخدام الخلايا لتحديد إمكانات كلونوجينيك النسبية خطوط مراسل التمايز غسك إلى الثقافات غسك الأصلية التي كانت مشتقة.

  1. ننأى سوبكلونيس مراسل التمايز في تعليق خلية واحدة كما هو موضح أعلاه.
  2. لوحة خلايا في لوحات 96-مولتيويل في 100 ميليلتر من وسائط النمو كاملة من الخلايا الجذعية العصبية في الخلية كثافة تتراوح ما بين 5 و 500 الخلايا الواحدة وكذلك.
  3. احتضان خلايا لمدة 9 إلى 11 يوما في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  4. نقاط إيجابية الآبار التي تصور مباشرة من نيوروسفيريس تحت مجهر خفيفة. ينبغي النظر في بئر "إيجابيا" إذا كان يحتوي على نيوروسفيري كبير واحد على الأقل.
  5. قم بتوصيل البيانات: عدد الآبار التي تم تحليلها والعدد من الآبار الإيجابية باستخدام واجهة على شبكة الإنترنت الدا المتاحة في http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html.

5-المخدرات مكتبة إضعاف إعداد

  1. إزالة لوحات مكتبة من مخزن في-80 درجة مئوية، وتغطي برقائق الألومنيوم (حماية مركبات حساسة للضوء). ذوبان الجليد لما يقرب من 30 دقيقة إلى ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. استخدام 12-قناة بيبيتور متعدد القنوات لتمييع المركبات المكتبة إلى 0.2 مم في المتوسط كاملة من الخلايا الجذعية العصبية. [دمس] مخفف إلى 10 في المائة في متوسط النمو
    ملاحظة: ينبغي أن يكون تركيز النهائية [دمس] 0.1% عند إضافة إلى الخلايا. قد يؤدي وجود تركيز أعلى من [دمس] في الثقافة سمية. ولهذا السبب، من المستحسن اختبار حساسية إلى [دمس] في خط الخلية المستخدمة، قبل العلاج.
  3. استخدام [دمس] كمراقبة المركبات لعلاج الخلايا الموجودة في الأعمدة اليمنى واليسرى لكل لوحة (الأعمدة 1 و 12؛ آبار A إلى H).
  4. تغطي لوحات مكتبة المخفف مع رقائق الألومنيوم وإرجاع لوحات مكتبة الأصلي للثلاجة-80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

6-المخدرات الشاشة

ملاحظة: يجب استخدام الخلايا المعالجة [دمس] تعيين fluorescence الأساس وضبط النابضة.

  1. لوحة 5 × 103 خلايا في صفيحة 96-مولتيويل في ميليلتر 99 من الخلايا الجذعية العصبية كاملة النمو المتوسطة.
  2. استخدام 12-قناة بيبيتور متعددة القنوات، يعامل الخلايا مع مركبات مكتبة المخفف بتركيز نهائي 2 ميكرومتر (1 ميليلتر من المخدرات 0.2 مم إلى 99 ميليلتر من تعليق خلية) أو مع [دمس] (تحكم). احتضان لوحات ح 72 شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
  3. 12-قناة بيبيتور متعدد القنوات باستخدام إضافة 150 ميليلتر من كاشف تفكك خلية لكل بئر واحتضان لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. فصل الخلايا من تريتوراتينج برفق مع 12-قناة بيبيتور الأقنية حتى يتحقق تعليق خلية مفردة (عادة ما بين 20 إلى 30 مرة). يختلف مقدار الوقت المطلوب لفصل نيوروسفيريس تماما بين خطوط GSC. بينما الكاشف تفكك خلية الموصى بها (انظر المواد) آمنة والحضانة لمدة تصل إلى 45 دقيقة قد لا يؤثر على استمرارية في عدة أسطر غسك اختبار، التحقق من كل خط المؤسسة العلمية العالمية لاستخدامه في الفرز.
    ملاحظة: وحدة التخزين النهائي في كل كذلك ينبغي أن يكون حوالي 250 ميليلتر (100 ميليلتر من تعليق خلية + 150 ميليلتر من كاشف تفكك الخلية).
  5. تحديد النسبة المئوية للخلايا معربا عن مراسل GFAP:GFP من التدفق الخلوي. استخدام استراتيجية النابضة القياسية. أولاً، ينثر الأرض إلى الأمام والجانب للحصول على شعور عام بحجم الخلية وقدرتها على البقاء. قم بوضع بوابة على السكان خلية واحدة قابلة للحياة. هذا هو عدد السكان الذي سيتحدد الفلورية الخضراء (اجفب). مجمع أي أن النتائج زيادة في النسبة المئوية للتجارة والنقل-إيجابية الخلايا بأكثر من ثلاثة انحرافات معيارية السيطرة على (يعامل [دمس]) يعتبر إيجابيا "ضرب". وينبغي تعديل هذه العتبة وفقا لتطبيق معين والصرامة المطلوبة.
    ملاحظة: لسرعة نقل عالية ينصح الشاشة استخدام سوبكلون مراسل غسك واحد. وبعد تحديد ضرب، يجب التحقق من كل ضرب ضد سوبكلونيس مراسل إضافية من نفس الخط GSC. لزيادة الثقة ليضرب الحقيقي هو يوصي أيضا باختبار المركبات ضد سوبكلونيس مراسل معزولة عن مختلف GSC نيوروسفيريس خطوط.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كانت ترانسدوسيد مع المراسل أستروجليال lentivirus ترميز للبروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) تنصهر في إطار مع كاسيت مقاومة زيوسين ثلاثة خطوط مستقلة نيوروسفيريس المستمدة من المريض ومدفوعة بواسطة توصيني المروج العنصر البشري ( الشكل 1). استنساخ الفردية التالية تم عزلة بواسطة طلاء الخلايا 0.7 كل بئر في صفيحة جيدا 96 (الشكل 2)، وأعقب ذلك التدفق سيتوميتريك تحديد النسبة المئوية للخلايا معربا عن التجارة والنقل (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في حين أن معظم الدراسات السابقة من جسكس وركزت أساسا على العلامات التي تحدد لهم، في هذه الدراسة قررنا اتخاذ نهج عكسي. نحن تركز أساسا على نسلها متمايزة المتولدة عن جسكس (مثلاً، يعبر عن أستروجليال وعلامات العصبية الخلايا). هنا نظهر استخدام المخدرات إنتاجية عالية يستند إلى الخلية فحص النظام، الذي يستند إلى توصيني البشرية تعتمد على مروج التعبير عن التجارة والنقل. أجريت جميع التجارب التي تستخدم خطوط الخلايا جليوبلاستوما نيوروسفيري المستمدة من المريض. يتم وصف بروتوكول مفصلة تصف العزلة والتوسع في هذه الخطوط في جالي et al

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ودعمت هذا العمل تم جزئيا ب R01CA187780 المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ESGRO Complete AccutaseEMD MilliporeSF006
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma AldrichD2650
HBSS (محلول الملح المتوازن من Hank)Sigma AldrichH6648
Human GFAP Differentiation Reporter (pGreenZeo ، Virus)SBI (System Biosciences)SR10015VA-1
50 مل كاشف معقم يمكن التخلص منه الخزانات Corning4870
6 لوحةآبار Thermo Fisher Scientific130184
96 لوحة بئرFalcon353072
Biolite T25 سم & sup2 ؛ قارورة تهويةثيرمو فيشر ساینتفيك130189
بيوليت T75 سم & sup2 ؛ قارورة تهويةثيرمو فيشر Scientific130190
15 مل أنابيب الطرد المركزيCelltreat229411
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر ساينتفيك05-408-129
ماصة Ovation متعددة القنوات ، 12 قناة ، 0.5 - 20uLVistaLab Technologies1060-0020
ماصة Ovation متعددة القنوات ، 12 قناة ، 5-250uLVistaLab التقنيات1060-0250
أطراف ماصة متعددة 12 قناة 25 & mu; لVistaLab Technologies4060-1002
أطراف ماصة متعددة 12 قناة 250 مو ؛ لVistaLab Technologies4060-9025
Guava easyCyte 5HT Benchtop Flow Cellular EMDMillipore0500-4005
المجموعات السريرية للمعاهد الوطنية للصحة 1 و 2 مكتبات الجزيئات الصغيرةEvotec
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>لتحضير وسائط الخلايا الجذعية العصبية (500 مل) < / قوي ><قوي > التركيز النهائي < / قوي >
BSAGoldBio.comA-421-2500.20٪
DMEM / F12 10Xكورنينج90-091-PB1X
ملح الصوديوم الهيبارينسيجما ألدريتشH31490.0002٪
هيبس 1Mسيجما ألدريتشH40365.4 ملي مولار
الأنسولين - ترانسفيرين - السيلينيوم (ITS -G) (100X)Life Technologies41400-0451X
NaHCO3Sigma AldrichS-576114.5 ملي مولار
البنسلين - الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل) 100Xجيبكو15140-1221X
البروجسترونسيجما ألدريتشP878316 نانومتر
بوتريسينسيجما ألدريتشP57804.8 & M
Basic FGF (FGF2) ، HumanGoldBio1140-02-5010 نانوغرام / مل
EGF ، HumanGoldBio1150-04-10020 نانوغرام / مل
فلتر أعلى الزجاجة ، 150 مل ، 33 مم ، 0.22 ميكرومتر ، PES ، S ، IndCorning431160استخدم لتصفية الوسائط المعقمة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Maher, E. A., et al. Malignant glioma: genetics and biology of a grave matter. Genes Dev. 15 (11), 1311-1333 (2001).
  2. Bonavia, R., Inda, M. M., Cavenee, W. K., Furnari, F. B. Heterogeneity maintenance in glioblastoma: a social network. Cancer Res. 71 (12), 4055-4060 (2011).
  3. Bao, S., et al. Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation of the DNA damage response. Nature. 444 (7120), 756-760 (2006).
  4. Sul, J., Fine, H. A. Malignant gliomas: new translational therapies. Mt Sinai J Med. 77 (6), 655-666 (2010).
  5. Bar, E. E., Chaudhry, A., Farah, M. H., Eberhart, C. G. Hedgehog signaling promotes medulloblastoma survival via Bc/II. Am J Pathol. 170 (1), 347-355 (2007).
  6. Chu, Q., Orr, B. A., Semenkow, S., Bar, E. E., Eberhart, C. G. Prolonged inhibition of glioblastoma xenograft initiation and clonogenic growth following in vivo Notch blockade. Clin Cancer Res. 19 (12), 3224-3233 (2013).
  7. Schreck, K. C., et al. The Notch target Hes1 directly modulates Gli1 expression and Hedgehog signaling: a potential mechanism of therapeutic resistance. Clin Cancer Res. 16 (24), 6060-6070 (2010).
  8. Warrell, R. P. Jr, et al. Differentiation therapy of acute promyelocytic leukemia with tretinoin (all-trans-retinoic acid). N Engl J Med. 324 (20), 1385-1393 (1991).
  9. Piccirillo, S. G., et al. Bone morphogenetic proteins inhibit the tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature. 444 (7120), 761-765 (2006).
  10. Bar, E. E., et al. Cyclopamine-mediated hedgehog pathway inhibition depletes stem-like cancer cells in glioblastoma. Stem Cells. 25 (10), 2524-2533 (2007).
  11. Bar, E. E., Lin, A., Mahairaki, V., Matsui, W., Eberhart, C. G. Hypoxia increases the expression of stem-cell markers and promotes clonogenicity in glioblastoma neurospheres. Am J Pathol. 177 (3), 1491-1502 (2010).
  12. Kahlert, U. D., et al. CD133/CD15 defines distinct cell subpopulations with differential in vitro clonogenic activity and stem cell-related gene expression profile in in vitro propagated glioblastoma multiforme-derived cell line with a PNET-like component. Folia Neuropathol. 50 (4), 357-368 (2012).
  13. Lim, K. S., et al. Inhibition of monocarboxylate transporter-4 depletes stem-like glioblastoma cells and inhibits HIF transcriptional response in a lactate-independent manner. Oncogene. 33 (35), 4433-4441 (2014).
  14. Kahlert, U. D., et al. ZEB1 Promotes Invasion in Human Fetal Neural Stem Cells and Hypoxic Glioma Neurospheres. Brain Pathol. 25 (6), 724-732 (2014).
  15. Hu, Y., Smyth, G. K. ELDA: extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays. J Immunol Methods. 347 (1-2), 70-78 (2009).
  16. Meyer, M., et al. Single cell-derived clonal analysis of human glioblastoma links functional and genomic heterogeneity. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), 851-856 (2015).
  17. Galli, R., et al. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64 (19), 7011-7021 (2004).
  18. Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Atracurium Besylate and other neuromuscular blocking agents promote astroglial differentiation and deplete glioblastoma stem cells. Oncotarget. 7 (1), 459-472 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Glioblastoma Stem CellsFlow Cytometry ScreeningGFAP Reporter ConstructSmall Molecule ScreeningCellular Differentiation AssayDrug Repurposing PlatformLentivirus TransductionNeurosphere FormationGFP Positive CellsHigh Throughput Screening

مقالات ذات صلة