بروتوكول لتجميع المرحلة الصلبة من أوليغوميرس من الحمض النووي الريبي تحتوي على 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiofenylmethyl تعديل وتوصيف عن طريق التعميم ديكرويسم

ملخص

توفر هذه المقالة إجراء مفصل على التوليف المرحلة الصلبة، وتنقية، وتوصيف دوديكامرز من الحمض النووي الريبي تعديلها في C2'- O -position. وتستخدم الأشعة فوق البنفسجية والدائرية تحلل ضوئي اللون الضوئية لتحديد وتوصيف الجوانب الهيكلية، أي أحادية أو خيوط مزدوجة.

الملخص

وقد تم استخدام توليف المرحلة الصلبة للحصول على البوليمرات الكنسي والمعدلة من الأحماض النووية، وتحديدا من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي، مما جعلها منهجية شعبية للتطبيقات في مختلف المجالات ولأغراض بحثية مختلفة. ويركز الإجراء الموصوف هنا على تخليق وتنقية وتوصيف دوديكامرز من الحمض النووي الريبي 5 '- [كوا كغغ أو كاو] -3' تحتوي على صفر، واحد، أو اثنين من التعديلات الموجودة في C2'- O- وضع. وتستند تحقيقات مجموعات 2-ثيوفينيل ميثيل، دمجها في النيوكليوتيدات رنا عن طريق التوليف العضوي القياسية وأدخلت في أوليغونوكلأوتيدس المقابلة عبر الفوسفوراميديت منها. يستعمل هذا التقرير كيمياء الفوسفوراميديت من خلال القواعد النووية الأساسية الأربعة (أوريدين (U)، سايتوسين (C)، غوانوسين (G)، أدينوسين (A))، فضلا عن النيوكليوتيدات 2-ثيوفينيل ميثيل فونكتيوناليزد تعديل في 2'- O- موضع؛ ومع ذلك، فإن منهجية قابلة للفارق كبيرآية من التعديلات التي تم تطويرها على مر السنين. تم تصنيع أوليغونوكلأوتيدس على دعم الزجاج المسام (كبغ) تليها الانقسام من الراتنج و ديبروتكتيون في ظل ظروف قياسية، أي خليط من الأمونيا وميثيل أمين (أما) تليها فلوريد الهيدروجين / ثلاثي إيثيل أمين / N- ميثيل بيروليدينون. تم تنقية أوليغونوكلأوتيدس المقابلة من خلال الكهربائي الكهربائي بولي أكريلاميد (20٪ تغيير طبيعة) تليها شطف، تحلية، والعزلة عبر كروماتوغرافي المرحلة عكس (سيب-باك، C ₁₈ عمود). تم تقييم الكمي والبارامترات الهيكلية من خلال تحليل الأشعة فوق البنفسجية المرئية (أوف-فيس) والتحليل الضوئي ثنائي الأبعاد (سد) على التوالي. ويهدف هذا التقرير ليكون بمثابة مصدر ودليل للباحثين المبتدئين والخبراء المهتمين في الشروع في هذا المجال. ومن المتوقع أن تكون بمثابة عمل جار مع تطوير تكنولوجيات ومنهجيات جديدة. وصف المنهجيات والتقنيات داخل ثيق تتوافق مع المزج دنا / رنا (تجديدها وشرائها في عام 2013) الذي يستخدم الكيمياء الفوسفوراميديت.

المقدمة

التوليف المرحلة الصلبة للحصول على أوليغونوكلأوتيدس من الحمض النووي / رنا هو أداة قوية التي خدمت العديد من التطبيقات في مختلف المجالات منذ 1970s ^{1 ، 2 ، 3} باستخدام اللبنات الفوسفوراميديت ⁴ . وتشمل الأمثلة على تأثيره الواسع ما يلي: تأثيره في وضع العلامات ( عن طريق تفاعلات الكيمياء النقية) ⁵ ، والتحقيق الهيكلي ⁶ ، والتكنولوجيات المضادة للعوامل ⁷ ، فضلا عن توضيح الآليات البيولوجية ^{8 و}

البروتوكول

1. الصلبة المرحلة توليف رنا أوليغونوكلأوتيدس

1. إعداد الحلول التي تحتوي على كل الفوسفوراميديت (الجدول 1).
   1. حساب عدد النيوكليوتيدات وتناسب في المعادلة ن + 1 (حيث ن = عدد النيوكليوتيدات) المقابلة لكل قاعدة وملء الجدول مع القيم المفقودة. حجم = 0.15 مل لكل النيوكليوتيدات بتركيز 0.1 م، المذاب في أسيتونيتريل اللامائية.
   2. تزن كل فسفوراميديت في زجاجات العنبر 10 مل من الفرن المجففة (سيبتوم أعلى العنب....

النتائج

يتم وصف تركيب دوديكامرز رنا التي تحتوي على صفر أو واحد أو اثنين من التعديلات ثيوفينيل ميثيل في C2'- O- وضع جنبا إلى جنب مع تنقية المقابلة وتوصيف. وعلاوة على ذلك، يتم تضمين وصف تفصيلي للتحليل الهيكلي التي أجريت عن طريق سد.

تم الحصول على أربعة فروع من الحمض النووي الريبي (بما في ذلك حبلا مع تسلسل تكميلي) عن طريق التوليف المرحلة الصلبة، و.......

المناقشة

القصد من هذه المخطوطة هو أن تكون بمثابة دليل للباحثين في الميدان، مبتدئا أو خبير، لتحقيق بنجاح أو تعزيز تخليق قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي. وتركز منهجية وصفها على استخدام التوليف المرحلة الصلبة باستخدام المزج الآلي / الحمض النووي الريبي المزج عن طريق الكيمياء الفوسفوراميديت القياسية. ويصف التقرير تصورا خطوة بخطوة للتوليف، وتنقية، وتوصيف دوديكامرز الحمض النووي الريبي. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم استخدام سد لتحديد الزخارف الهيكلية الثانوية والتحولات تمسخ ا.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
AbsolveTM	PerkinElmer	6NE9711
Acetonitrile 99.9٪ ، HPLC Grade	Fisher Scientific	75-05-8
Acetonitrile 99.9٪ ، اللامائي لتسلسل الحمض النووي	Fisher BioRecodes	75-05-8
Acrylamide ، 99 + ٪	ACROS Organics	164850025
كلوريد الأمونيوم 98 + ٪	Alfa Aesar	12125-02-9
سترات الأمونيوم ، ثنائي الأساس 98٪	سيجما ألدريتش	3012-65-5
فلوريد الأمونيوم   98.0٪ ، ACS الصف	ألفا إيسار	12125-01-8
هيدروكسيد الأمونيوم 28 - 30٪ في الماء ، ACS Plus	Fisher Chemical	1336-21-6
بيرسولفات الأمونيوم	ACROS Organics	1444
Argon-فائقة النقاء	؛ Airgas	7440-37-1
Bis-acrylamide Ultra نقاء	VWR-Amresco	172
حمض البوريك	فيشر Scientific	A73-1
ثنائي إيثيل بيروكربونات ، 97٪	ACROS Organics	A0368487
الإيثانول ، اللامائي ، الصف النسيجي	فيشر الكيميائية	64-17-5
حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك ، ملح ثنائي الصوديوم تجفيف 100.2٪	فيشر كيميكال	6381-92-6
فورماميد	Thermo Scientific	75-12-7
حمض الهيدروكلوريك ، 36.5 - 38.0٪ ، معتمد ACS Plus	Fisher Chemical	7647-01-0
سداسي هيدرات كلوريد المغنيسيوم ، 99٪	فيشر ساینتفيك	7786-30-3
ميثانول ، 99.9٪ ،   ؛ HPLC الصف	فيشر الكيميائية	67-56-1
ميثيل أمين 40٪ في الماء	سيجما ألدريتش	74-89-5
1-ميثيل -2-بيروليدينون ، وهيدرائي ، 99.5٪	ألدريتش	872-50-4
Opti-TOFTM 96 إدراج جيد (123 × 81 مم)   ؛	MDS SCIEX	1020157
RNase Away	المنتجات الحيوية الجزيئية	7005-11
أسيتات الصوديوم ، اللامائية 99.2٪ ، معتمد من ACS	Fisher Chemical	127-09-3
كلوريد الصوديوم ، 100.5٪ ، معتمد من ACS	Fisher Chemical	7647-14-5
ثنائي هيدرات أحادي القاعدة فوسفات الصوديوم 99.0٪	Sigma	13472-35-0
2 '، 4' ثلاثي إيثيل أمين ، 99 + ٪	ألفا إيسار	121-44-8
TEMED	Amresco	761
ثلاثي إيثيل أمين ثلاثي هيدروفلوريد ، 98٪	ألدريتش	73602-61-6
حمض ثلاثي فلورو أسيتيك ، 99٪	ألفا إيسار	76-05-1
6'-ثلاثي هيدروكسي أسيتوفينون مونوهيدرات 98٪	سيجما ألدريتش	480-66-0
تريس بيس	فيشر Scientific	BP154-3
Urea	Fisher Scientific	U15-3
الكواشف لتخليق الحمض النووي الريبي: < / قوي >
مزيج Deblock ، 3٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك في ثنائي كلورو ميثان	Glen Research	؛ 40-4140-57
مزيج الغطاء أ ، THF / بيريدين / أنهيدريد الخليك	Glen Research	40-4110-52
Cap Mix B ، 10٪ 1-methylimidazole في	THF Glen Research	40-4120-52
Activator ، 0.25 M 5-ethylthio-1H-tetrazole في الأسيتونيتريل اللامائي	Glen Research	؛ 30-3140-52
محلول مؤكسد ، 0.02 M اليود في THF / بيريدين / Water	Glen Research	40-4330-52
U-RNA-CPG	Glen Research	20-3330-xx
Ac-G-RNA-CPG   ؛	Glen Research	20-3324-xx
AC-G-CE Phosphoramidite	Glen Research	10-3025-xx
U-CE Phosphoramidite	Glen Research	10-3030-xx
Ac-C-CE Phosphoramidite	Glen Research	10-3015-xx
Bz-A-CE Phosphoramidite	أبحاث جلين	10-3003-xx