يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ

24.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56191

⸱

أغسطس 9, 2017

 ,  ,  , 
1UCLA Immunogenetics Center, Department of Pathology and Laboratory Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

ويرد هنا تدفق الخلوي طريقة لتحديد الكمية نشاط السامة للخلايا من الخلايا القاتلة الطبيعية البشرية.

الملخص

ضمن نظام المناعة الفطرية، لمفاوية المستجيب المعروفة باسم خلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية تلعب دوراً أساسيا في الدفاع المضيف ضد الخلايا الشاذة، وعلى وجه الخصوص القضاء على الأورام وفيروسي إصابة الخلايا. حوالي 30 من عيوب monogenic المعروفة، جنبا إلى جنب مع مجموعة كبيرة من الحالات المرضية الأخرى، يسبب نقص الخلية ناغورني كاراباخ الوظيفية أو الكلاسيكية، يظهر في انخفاض أو غياب النشاط السامة للخلايا. وتاريخيا، كانت قد أجرت التحقيق سيتوتوكسيسيتي مع أساليب المشعة، ومرهقة ومكلفة ويحتمل أن تكون خطرة. توضح هذه المقالة المطبقة سريرياً، تبسيط تدفق الخلوي طريقة لقياس نشاط ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا. في هذا التحليل، خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو المنقي الاستعدادات خلية ناغورني كاراباخ المحتضنة شارك في نسب مختلفة مع خط خلية ورم المستهدف من المعروف أن حساسة إلى ناغورني كاراباخ بوساطة الخلايا سيتوتوكسيسيتي (نككك). الخلايا المستهدفة المسماة مسبقاً مع صبغة فلورسنت للسماح بالتمييز ضدهم من خلايا المستجيب (ناغورني كاراباخ الخلايا). بعد فترة الحضانة، يتم تحديد الخلايا الهدف قتل بوصمة حمض النووي، الذي يتخلل الخلايا الميتة على وجه التحديد. هذا الأسلوب هو قابلة للتشخيص وتطبيقات البحوث سواء، بفضل قدرات متعددة المعلمة التدفق الخلوي، ميزة إضافية يحتمل أن يتيح إجراء تحليل أعمق من ناغورني كاراباخ خلية النمط الظاهري ووظيفة.

المقدمة

الخلايا (ناغورني كاراباخ) القاتل الطبيعية مجموعة فرعية متطورة من الإنسان الفطرية لمفاوية المشاركة حاسمة في القضاء على الخلايا المصابة فيروسي وتحول الخلايا الأخرى المسببة للأمراض التهديدات 1،2. ناغورني كاراباخ خلية حبيبات الحال البيت البروتينات السامة للخلايا، مثل بيرفورين وجرانزيميس. عند التنشيط، ناغورني كاراباخ الخلايا تشكل تفاعل معقد مع أهدافها المعروفة باسم المشبك المناعية، حيث يتم الإفراج عن هذه الجزيئات عن محلياً، مما أدى إلى تحلل الخلية الهدف المباشر والمبرمج، إلى جانب الإفراج عن سيتوكين وتشيموكيني وفي نهاية المطاف في استحثاث التهابات الدولة 1،،من34.

ناغورني كاراباخ خلية التنشيط ينطوي على سلسلة معقدة من تفعيل والمثبطة التفاعلات بين ناغورني كاراباخ الخلايا مستقبلات ويغاندس أعرب على سطح الخلايا المستهدفة، وتشكيل نظام محكم تنظيم. واحدة من أهم درس آليات تفعيل الخلية ناغورني كاراباخ هو "الذات المفقودة". في الواقع، عدم الكشف عن فئة أنا الرئيسية histocompatibility المعقد (MHC)، أو جزيئات مستضد (هلا) الكريات البيض البشرية، على المصابين أو تحول الخلايا المشغلات ناغورني كاراباخ خلية سيتوتوكسيسيتي. الورم والخلايا المصابة بالفيروسات عموما downregulate الخلية هذه المستضدات هربا من الحصانة T الخلية بوساطة، وبذلك أصبحت ناغورني كاراباخ الابتدائي الأهداف 1،،من34.

يتم تصنيف تقييم الدالة cell ناغورني كاراباخ أساسا إلى تحبب أو سيتوتوكسيسيتي فحوصات. ومع ذلك، فحوصات تحبب، مثل تدفق سيتوميتريك الكشف عن علامة تحبب المرتبطة CD107a، فقط إرشادية ناغورني كاراباخ خلية التنشيط وليس من وظيفتها في نهاية المطاف، قتل مباشرة من الخلايا الهدف 5،6،،من78. ومن ثم، اجتذب هذا القيد المحققين لفحوصات سيتوتوكسيسيتي كبديل أكثر دلالة وأكثر مباشرة.

منذ فترة طويلة "المعيار الذهبي" لتقييم الخلية بوساطة نشاط السامة للخلايا من خلايا تي وناغورني كاراباخ هو فحص الإصدار الكروم (CRA). CRA ينطوي على تسمية الخلايا المستهدفة مع 51Cr إشعاعيا وتفرخ لهم المشاركة مع خلايا المستجيب. هذا التحليل غارق في مبدأ أن تحلل الخلية يؤدي إلى الإفراج عن البروتين زمنياً 51Cr في المادة طافية، الذي يمكن أن يقاس بالعد غاما. هذا الفحص، بينما فعالة، وإشكالية بالنسبة لمجموعة متنوعة من الأسباب: ارتفاع تكاليف المواد ومعالجة والتخلص من المشعة 51Cr وعفوية الإفراج عن 51Cr وتوحيد صعبة--مما يجعل من غير العملي تماما 9،10.

منذ ذلك الحين وضعت عددا من الاختبارات غير المشعة، التي تشمل العلامات الفلورية والإفراج عن إنزيم، وحتى الإضاءة الحيوية، كبدائل لطعنة 11،12،،من1314. يصف لنا هنا تدفق الخلوي طريقة لقياس ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا نشاط في الخلايا الهدف K562 بسيطة وحساسة، واستنساخه. خلايا K562 هي خط خلية اريثروليوكيميك بشرية مع انخفاض التعبير عن فئة هلا أنا والتعبير المتزايد من يغاندس لمستقبلات أكتيفاتوري في ناغورني كاراباخ، مما يجعلهم عرضه بشكل خاص إلى ناغورني كاراباخ الخلية بوساطة سيتوتوكسيسيتي 15. في هذا التحليل، K562 الخلايا المسماة مسبقاً مع كاربوكسيفلوريسسين اسيتات سوكسينيميديل إستر (CFSE) ومثقف شارك في نسب مختلفة مع أما خلايا الدم المحيطية وحيدات النوى (ببمكس) أو تنقيته ناغورني كاراباخ الخلايا 1. كفسي هو صبغة فلورسنت مستقرة وملزمة البروتين يسمح تمييز الخلايا المستهدفة من المستجيب ناغورني كاراباخ الخلايا 16،17. بعد الحضانة المشتركة، وصمة عار حمض النووي، على وجه التحديد تتخلل غشاء الخلايا الميتة، يستخدم لتحديد الخلايا الهدف قتل (انظر الجدول للمواد). ثم تكتسب العينات في سيتوميتير تدفق لتحديد النسبة المئوية للميت (أي، وصمة عار +) كفسي + الخلايا المستهدفة.

يمكن استخدام هذا الفحص كفحص تشخيصي روتيني monogenic العيوب التي تؤثر في حجرة خلية ناغورني كاراباخ، التي يوجد منها حوالي 30 العيوب المعروفة يسبب عوز خلية ناغورني كاراباخ الوظيفية أو الكلاسيكية، وليمفوهيستيوسيتوسيس هيموفاجوسيتيك الابتدائي أو الثانوي. كما أنها مفيدة للتحقيق في نشاط الخلية ناغورني كاراباخ في المرضى مع القوباء المتكررة، وشديدة العدوى الفيروسية، لتقييم إعادة تشكيل المناعة بعد زرع الخلايا المكونة للدم أو وظيفة immunomodulatory العلاج 18،،من1920، ومجموعة كبيرة من تطبيقات البحوث الأساسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم جمع العينات وفقا للإرشادات الأخلاقية التي وضعها برنامج حماية البحوث البشرية بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ووافق IRB.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الكواشف

ملاحظة: ما لم ينص على خلاف ذلك ، يجب السماح لجميع الكواشف بالتوازن في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. يجب أن تظل جميع الكواشف معقمة.

  1. قم بإعداد محلول عمل 2x من Tween-20 (أي 0.2٪) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من محلول Tween-20 إلى 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون الكالسيوم والمغنيسيوم باستخدام ماصة p20.
    1. نظرا للزوجة العالية ل Tween-20 ، اتخذ الخطوات التالية لضمان الدقة: اجمع ببطء لتجنب تكوين الفقاعات ، ولا تغمر الطرف بالكامل لتجنب الترحيل ، والماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات في PBS لغسل كل Tween-20 من الحافة.
  2. أضف 2 ميكرولتر من محلول مخزون IL-2 (2.1E6 وحدة دولية / مل) إلى 198 ميكرولتر من الوسائط الكاملة (أي تخفيف 1: 100) ، وهو RPMI مع 1٪ بنسلين ستربتومايسين و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، ثم انتقل إلى تخفيف إضافي بنسبة 1: 100 عن طريق إضافة 2 ميكرولتر من المحلول الوسيط IL-2 إلى 198 ميكرولتر من الوسائط الكاملة لإعداد محلول عمل 7x (210 وحدة دولية / مل).
  3. أضف 2 ميكرولتر من محلول مخزون CFSE (5 ملليمتر) إلى 500 ميكرولتر من الوسائط العادية (RPMI). الدوامة ، قم بالدوران لأسفل لإزالة القطرات من الغطاء ، ثم تابع التخفيف الإضافي 1:20 عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من المحلول الوسيط CFSE إلى 950 ميكرولتر من RPMI العادي للحصول على حل عمل 2x من 1 ميكرومتر. دوامة جيدا والحفاظ عليها محمية من الضوء.
< p class = "jove_title" >2. عزل PBMCs كخلايا مستجيبة

ملاحظة: تم التحقق من صحة هذا الاختبار للاستخدام الفعال مع إجمالي PBMCs من عناصر التحكم السليمة. ومع ذلك ، يوصى بالتحقق من محتوى خلية NK مع كل مستحضر PBMC (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1). أيضا ، يعتمد حجم الدم الكامل لجمعه على تواتر الخلايا القاتلة الطبيعية في الدم الكامل المحيطي وقد يختلف هذا من شخص لآخر ، خاصة بين المتبرعين الأصحاء والمرضى.

  1. اجمع ما لا يقل عن 4 مل من الدم الكامل للإنسان في أنابيب جمع الدم الهبارين الصوديوم أو الليثيوم. قم بتخزين عينات الدم في درجة حرارة الغرفة عند جمعها واستخدامها في غضون 30 ساعة من الجمع.
  2. تمييع الدم الكامل ب 4 مل من PBS (أي حجم متساو من PBS للدم الكامل).
  3. أضف 4 مل من محلول تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتراكب الدم الكامل المخفف بعناية فوق محلول تدرج الكثافة عن طريق إمالة الأنبوب.
  4. جهاز طرد مركزي عند 650 × جم لمدة 24 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل.
  5. اجمع بعناية طبقة الخلايا أحادية النواة ، وهي الطبقة البيضاء الرقيقة أسفل الطبقة العليا من البلازما والصفائح الدموية ، في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. ارفع مستوى الصوت إلى 15 مل باستخدام PBS.
  6. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 10 دقائق مع تشغيل الفرامل. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 0.5 مل من الوسائط الكاملة.
  7. استخدم عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا ، واضبط تركيز PBMC على 5 × 106 خلايا / مل مع وسائط كاملة.
  8. تحقق من محتوى الخلية NK عن طريق قياس التدفق الخلوي (انظر الخطوة 4).
  9. ابدأ الفحص في غضون 30 دقيقة. احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 دقائق ، أو ضعها في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ من ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
< p class = "jove_title" >3. عزل الخلايا القاتلة الطبيعية كخلايا مستجيبة

ملاحظة: هذا الجزء من البروتوكول هو بديل لإستخدام إجمالي PBMCs كخلايا مستجيبة. العائد النموذجي من 4 مل من الدم الكامل من فرد سليم هو حوالي 4 × 105 خلايا NK ، أو ما يقرب من 5-15٪ من PBMCs ، على الرغم من أن هذا التردد يختلف بين المتبرعين < فئة الدعم = "xref">21. يوصى بإجراء فحص النقاء بعد العزل.

  1. اجمع ما لا يقل عن 4 مل من الدم الكامل للإنسان في أنابيب جمع الدم الهبارين الصوديوم أو الليثيوم. خذ 50 ميكرولتر من الدم الكامل للتلطيخ كعينة ما قبل التخصيب.
  2. أضف كوكتيل التخصيب إلى عينات الدم عند 50 ميكرولتر / مل (انظر جدول المواد). تخلط جيدا وتحتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. أضف حجما متساويا من PBS + 2٪ FBS لتخفيف العينة وخلطها جيدا برفق.
  4. أضف 4 مل من محلول تدرج الكثافة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. قم بتراكب العينة المخففة بعناية فوق وسط تدرج الكثافة.
  5. جهاز طرد مركزي عند 1,200 × جم لمدة 10 دقائق مع إيقاف تشغيل الفرامل.
  6. اجمع بعناية طبقة الخلايا المخصبة في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. اغسل الخلايا عن طريق رفع الحجم إلى 50 مل باستخدام PBS + 2٪ FBS.
  7. جهاز طرد مركزي بحرارة 300 × جم لمدة 10 دقائق.
  8. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 0.5 مل من الوسائط الكاملة.
  9. باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم ، قم بحساب الخلايا واضبط التركيز على 5 × 105 خلايا / مل. خذ 50 ميكرولتر من معلق الخلية المنقى للتلطيخ كعينة ما بعد التخصيب.
  10. احتفظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 دقائق ، أو ضعها في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
< p class = "jove_title" >4. التنميط المناعي لتقييم محتوى الخلايا القاتلة الطبيعية

  1. باستخدام 50 ميكرولتر إجمالي PBMCs المعزولة ، أو الدم الكامل قبل التخصيب ، أو الخلايا القاتلة الطبيعية المنقاة ، تلطخ الجسم المضاد المترافق بالفلوروكروم المضاد ل CD56 كعلامة خلية NK. يمكن أيضا تضمين علامات لأنواع الخلايا الأخرى والأسلالات (مثل خلايا CD3 + T وخلايا CD19 + B) لتقييم أصل التلوث ، إن وجد.
  2. احتضن لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية ، واغسله بإضافة 2 مل من PBS + 2٪ FBS.
  3. جهاز طرد مركزي بحجم 450 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. بالنسبة إلى PBMCs أو الخلايا القاتلة الطبيعية ، قم بشفط الخلايا وإعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من PBS + 2٪ FBS.
  5. بالنسبة لعينات الدم الكاملة ، قم بإجراء تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC):
    1. بعد الطرد المركزي ، قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليقها في 2 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (31.75 جم من كلوريد الأمونيوم + 4.16 جم من قاعدة تريس + 6.65 جم من EDTA ، مذاب في 5000 مل من الماء منزوع الأيونات).
    2. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. كرر الغسيل مرتين ، واستنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق العينة المحللة في 100 ميكرولتر من PBS + 2٪ FBS.
      ملاحظة: يمكن أيضا إجراء تحلل كرات الدم الحمراء قبل تلطيخها.
    4. تابع تحليل التدفق الخلوي.
فئة

5. إذابة الخلايا المستهدفة K562 وزراعتها وحصادها

  1. Aliquot 10 مل من الوسائط الكاملة في أنبوب مخروطي سعة 15 مل واتركها تدفئ في حمام مائي 37 درجة مئوية. لإذابة خلايا K562 وزراعتها ، استخدم فقط الوسائط الدافئة مسبقا إلى 37 درجة مئوية لجميع الخطوات.
  2. ضع قارورة واحدة من خلايا K562 المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى يذوب معظمها.
  3. انقل خلايا K562 شبه المذابة إلى الوسائط الكاملة ، الدافئة مسبقا إلى 37 درجة مئوية ، في الأنبوب المخروطي سعة 15 مل. اغسل الجزء الداخلي من القارورة المبردة ببعض الوسائط المسخنة مسبقا ، وأضف الغسيل إلى أنبوب سعة 15 مل.
  4. جهاز طرد مركزي عند 140 × جم لمدة 7 دقائق مع تشغيل الفرامل. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسائط الكاملة.
  5. اقتبس كمية مناسبة من تعليق الخلية لعد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم.
  6. اضبط التركيز على 1 × 105-2 × 105 خلايا / مل وزراعته في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل قبل الاستخدام. حافظ على المزرعة في نطاق الكثافة هذا لمدة لا تزيد عن 3 أشهر ، ثم قم بإذابة حصة جديدة. لا تتجاوز أبدا تركيز الخلية 1 × 106 خلايا / مل في المزرعة.
  7. للاستخدام في الفحص ، امزج مزرعة الخلايا K562 جيدا مع ماصة مصلية سعة 10 مل وقم بإزالة حصة لحساب وتقييم صلاحية الخلية باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم وتلوين Trypan Blue.
    1. إذا كانت الجدوى أقل من 85٪ ، فتابع خطوات إزالة الخلايا الميتة التالية.
      1. أضف 15 مل من محلول تدرج الكثافة إلى الأنابيب المخروطية سعة 50 مل ، حسب الحاجة. اجمع جميع الخلايا من المزرعة وقم بتراكب معلق الخلية ببطء فوق محلول تدرج الكثافة عن طريق إمالة الأنبوب.
      2. جهاز طرد مركزي عند 650 × gلمدة 24 دقيقة مع إيقاف تشغيل الفرامل. اجمع طبقة الخلايا الحية بعناية في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. ارفع مستوى الصوت إلى 50 مل باستخدام PBS.
      3. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 10 دقائق مع تشغيل الفرامل. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسائط الكاملة. عد الخلايا وتحقق من صلاحية الخلية (كما في 5.7).
      4. استزراع في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة يومين على الأقل قبل الاستخدام.
  8. اجمع الخلايا المستهدفة 5x105 K562 وأجهزة الطرد المركزي عند 140 × جم لمدة 7 دقائق.

6. وضع العلامات على الخلايا المستهدفة K562

ملاحظة: تأكد من إعادة تعليق خلايا K562 بشكل جيد قبل إضافة حل عمل CFSE.

  1. الماصة 500 ميكرولتر من محلول عمل CFSE إلى 500 ميكرولتر من خلايا K562 للحصول على تركيز نهائي يبلغ 0.5 ميكرومتر. باستخدام نفس الطرف 1000-1250 ميكرولتر، امزج على الفور عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل 3-5 مرات.
  2. احتضن في حمام مائي 37 درجة مئوية أو في حاضنة مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في الظلام.
    ملاحظة: نظرا لأن وقت تأخر توازن درجة الحرارة أطول في الحاضنة مقارنة بالحمام المائي ، فقد يلزم تعديل وقت الحضانة خاصة للأحجام > 1 مل.
  3. قم بإخماد تفاعل الملصقات ب 10 مل من الوسائط الكاملة لمدة 10 دقائق في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  4. جهاز الطرد المركزي لخلايا K562 المسمى بمعدل 140 × جم لمدة 7 دقائق.
  5. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم ورفع التركيز إلى 1x105 خلايا / مل في الوسائط الكاملة.
  6. ضع الخلايا في حاضنة مرطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. يمكن الاحتفاظ بالخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 10 دقائق ، أو في حاضنة ثاني أكسيد الكربونالمرطبة عند 37 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام. لا تبرد بالطاقة.
< ص الفئة = "jove_title" >7. الطلاء

ملاحظة: إذا كانت الخلايا القاتلة الطبيعية محدودة ، فيمكن خفض تركيز كل من خلايا K562 و NK إلى النصف ، بحيث يتم طلاء نصف الخلايا في الفحص. ينتج عن الفحص نتائج قابلة للمقارنة مع نصف كمية الخلايا (طالما أن النسب ظلت متسقة).

  1. في حالة استخدام إجمالي PBMCs ، قم بتسمية صفيحة 96 بئر ، قاع U ، معالجة بزراعة الأنسجة للظروف التالية لكل بئر: (1) المستجيب (E): الهدف (T) = 50: 1 + IL-2 - التحكم الإيجابي في السمية الخلوية للخلايا NK ؛ (2) ه: T = 50: 1 ؛ (3) ه: T = 25: 1 ؛ (4) ه: T = 12.5: 1 ؛ (5) ه: T = 6.25: 1 ؛ (6) T - الخلايا المستهدفة فقط - التحكم السلبي لموت K562 ؛ (7) E - الخلايا المستجيبة فقط؛ (8) T + Tween - التحكم الإيجابي في وفاة K562
  2. في حالة استخدام الخلايا الطبيعية النقية ، قم بتسمية لوحة معالجة بزراعة الأنسجة المكونة من 96 بئرا ، قاع U ، للظروف التالية لكل بئر: (1) المستجيب (E): الهدف (T) = 5: 1 + IL-2 - التحكم الإيجابي في السمية الخلوية للخلايا القاتلة الطبيعية ؛ (2) ه: T = 5: 1 ؛ (3) ه: T = 2.5: 1؛ (4) ه: T = 1.25: 1 ؛ (5) ه: T = 0.625: 1 ؛ (6) T - الخلايا المستهدفة فقط - التحكم السلبي لموت K562 ؛ (7) E - الخلايا المستجيبة فقط؛ (8) T + Tween - التحكم الإيجابي في وفاة K562
  3. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط الكاملة إلى الشروط 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7. لهذا ولجميع الخطوات اللاحقة ، (موصى به) استخدم ماصة متعددة القنوات.
  4. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المستجيبة (PBMCs عند 5 × 106 خلايا / مل أو خلايا NK منقاة عند 5 × 105 خلايا / مل) إلى الظروف 1 ، 2 ، 3. أضف خلايا المستجيب للظروف 4-7 عن طريق التخفيف التسلسلي. لا تغير الأطراف من حالة إلى أخرى.
    1. امزج الحالة 3 ، خذ 100 ميكرولتر ، وانقله إلى الحالة 4.
    2. امزج الحالة 4 ، خذ 100 ميكرولتر ، وانقله إلى الحالة 5.
    3. امزج الحالة 5 ، خذ 100 ميكرولتر ، وانقله إلى الحالة 7 ؛ لا تحتوي الحالة 6 على خلايا مستجيبة.
  5. أضف 100 ميكرولتر من محلول عمل Tween المحضر 2x 0.2٪ إلى الحالة 8 (التركيز النهائي: 0.1٪ Tween-20) ؛ الحالة 8 لا تحتوي على خلايا مستجيبة.
  6. أضف 30 ميكرولتر من محلول العمل IL-2 إلى الحالة 1. يجب إضافة IL-2 إلى تعليق الخلية المستجيبة قبل إضافة تعليق الخلية المستهدفة (التركيز النهائي: 27 وحدة دولية / مل).
  7. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة (الخلايا المسماة K562 عند 1 × 105 خلايا / مل) إلى الشروط 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 8. لا تحتوي الحالة 7 على خلايا مستهدفة.
  8. امزج جميع الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات وقم بالطرد المركزي للوحة عند 120 × جم لمدة دقيقتين.
  9. احتضان في حاضنة ثاني أكسيد الكربونالمرطبة 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. في نهاية الحضانة ، ضع اللوحة على الجليد وانتقل إلى تلوين قابلية للحياة في غضون 30 دقيقة.
< p class = "jove_title" >8. تلطيخ للبقاء والاستحواذ

  1. قم بإعداد بقعة الخلايا الميتة (انظر جدول المواد) عن طريق إضافة 3 ميكرولتر من محلول المخزون 5 ميكرومتر إلى 600 ميكرولتر من PBS.
  2. أضف 50 ميكرولتر من صبغة الخلايا الميتة المخففة إلى كل بئر للحصول على حجم نهائي يبلغ 250 ميكرولتر وتركيز نهائي قدره 0.005 ميكرومتر.
  3. تابع تحليل التدفق الخلوي. باستخدام مقياس التدفق الخلوي ، اجمع ما لا يقل عن 1,000 حدث في بوابة الخلية المستهدفة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2) للحصول على نتائج ذات مغزى إحصائيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قبل إعداد المقايسة، المستحسن جداً أن يتم تقييم محتوى الخلية ناغورني كاراباخ في السكان المستجيب للاختيار. ويبين الشكل 1 تلطيخ CD56 نموذجية قبل (أزرق فاتح) وبعد تخصيب خلية ناغورني كاراباخ (أحمر). ناغورني كاراباخ الخلايا تتألف يصل إلى 15% ببمكس وينبغي أن يكون على الأقل 80 ٪ نقية بعد تخصيب اليورانيوم.

تحليل تدفق سيتوميتريك في هذا التحليل ينطوي على الكشف عن معلمتين: كفسي، يمكن اكتشافها في نفس القناة فيتك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الأسلوب الموصوفة هنا يوفر بديلاً واضحة وفعالة من حيث التكلفة للمقايسة الإفراج عن الجمهورية التشيكية التقليدية 51لتقييم نشاط ناغورني كاراباخ الخلايا السامة للخلايا. هذا الأسلوب هو حساس واستنساخه، وأقل استهلاكاً للوقت من الأساليب القياسية السابقة، مثل اللجنة السويسرية للطعون، ويمكن استخدامها على حد سواء سريرية وبحوث التطبيقات.

بينما يعمل المقايسة مع مجموع ببمكس والمخصب ناغورني كاراباخ الخلايا، خيار استخدام ببمكس دون الحاجة إلى تنقية السكان خلية فائدة كبيرة عند التعامل مع كميات صغيرة م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب يعلن أي تعارض للمصالح المالية.

شكر وتقدير

نود أن نشكر نارسيسو جيل، مركز إيمونوجينيتيكس، وجامعة كاليفورنيا لمساعدتها مع إعداد مخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x ، بدون Ca2 + و Mg2 +) Corning(Cellgro)21-040-CM
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Tween-20SigmaBP337-100
RPMI 1640 MediaCorning (Cellgro)10-040-CV
مصل الأبقار الجنيني المعطل بالحرارةأوميغا ScientificFB-02
البنسلين StreptomycinLife Technologies15140-163حل مخزون بسعر 10,000 وحدة / مل
IL-2R & D Systems202-IL-050المجففة بالتجميد من 0.2 & م محلول مفلتر في الأسيتونيتريل و TFA مع BSA كبروتين ناقل. إعادة التكوين مع 500 ul في 100 & mu ؛ جم / مل في حمض الخليك المعقم 100 ملي مولار يحتوي على ما لا يقل عن 0.1٪ من ألبومين مصل الأبقار (2.1x10E6 وحدة دولية / مل)
خلايا K562ATCCCCL-243خط الخلايا السرطانية   ؛
قوارير ثقافة الخلايا T-75مجموعة تكاثر الخلايا Corning431464
CFSELife Technologies (CellTrace)C34554إعادة تكوين قارورة I مع 18 ul DMSO لإعداد محلول مخزون 5 ملم. لا تجمد/تذوب.
الأسهم Sytox RedLife TechnologiesS34859في 5 & mu ؛ M في 1 مل DMSO. قد يخضع محلول DMSO لدورات متعددة من التجميد والذوبان دون تدهور الكاشف.
أنابيب جمع الدم من الصوديوم / الهيبارين الليثيوم BD02-687-95
U-bottom 96 بئرماصات كورنينجCLS3897
مصليةBD Falcon
البوليسترين أنابيب مستديرة القاع (5 مل)BD Falcon14959-5
50 مل أنبوب مخروطي بولي بروبيلينBD Falcon352070
15 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلينBD Falcon352097
كاشف خزانالولايات المتحدة الأمريكية العلمية2321-2230
كوكتيل تخصيب الخلايا الطبيعية البشريةتقنيات الخلايا الجذعية (RosetteSep)15065
يتم توفير حل لوحة

المراجع

  1. Iannello, A., Debbeche, O., Samarani, S., Ahmad, A. Antiviral NK cell responses in HIV infection: I. NK cell receptor genes as determinants of HIV resistance and progression to AIDS. J Leukoc Biol. 84 (1), 1-26 (2008).
  2. Caligiuri, M. A. Human natural killer cells. Blood. 112 (3), 461-469 (2008).
  3. Topham, N. J., Hewitt, E. W. Natural killer cell cytotoxicity: how do they pull the trigger? Immunology. 128 (1), 7-15 (2009).
  4. Warren, H. S., Smyth, M. J. NK cells and apoptosis. Immunol Cell Biol. 77 (1), 64-75 (1999).
  5. Tognarelli, S., Jacobs, B., Staiger, N., Ullrich, E. Flow Cytometry-based Assay for the Monitoring of NK Cell Functions. J Vis Exp. (116), (2016).
  6. Somanchi, S. S., McCulley, K. J., Somanchi, A., Chan, L. L., Lee, D. A. A Novel Method for Assessment of Natural Killer Cell Cytotoxicity Using Image Cytometry. PLoS One. 10 (10), e0141074(2015).
  7. Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. J Immunol Methods. 294 (1-2), 15-22 (2004).
  8. Atkinson, E. A., Gerrard, J. M., Hildes, G. E., Greenberg, A. H. Studies of the mechanism of natural killer (NK) degranulation and cytotoxicity. J Leukoc Biol. 47 (1), 39-48 (1990).
  9. Kim, G. G., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Gooding, W., Whiteside, T. L. A novel multiparametric flow cytometry-based cytotoxicity assay simultaneously immunophenotypes effector cells: comparisons to a 4 h 51Cr-release assay. J Immunol Methods. 325 (1-2), 51-66 (2007).
  10. Kane, K. L., Ashton, F. A., Schmitz, J. L., Folds, J. D. Determination of natural killer cell function by flow cytometry. Clin Diagn Lab Immunol. 3 (3), 295-300 (1996).
  11. Jang, Y. Y., et al. An improved flow cytometry-based natural killer cytotoxicity assay involving calcein AM staining of effector cells. Ann Clin Lab Sci. 42 (1), 42-49 (2012).
  12. Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. J Immunol Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
  13. Karimi, M. A., et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 9 (2), e89357(2014).
  14. Oppenheim, D. E., et al. Glyco-engineered anti-EGFR mAb elicits ADCC by NK cells from colorectal cancer patients irrespective of chemotherapy. Br J Cancer. 110 (5), 1221-1227 (2014).
  15. West, W. H., Cannon, G. B., Kay, H. D., Bonnard, G. D., Herberman, R. B. Natural cytotoxic reactivity of human lymphocytes against a myeloid cell line: characterization of effector cells. J Immunol. 118 (1), 355-361 (1977).
  16. Jedema, I., van der Werff, N. M., Barge, R. M., Willemze, R., Falkenburg, J. H. New CFSE-based assay to determine susceptibility to lysis by cytotoxic T cells of leukemic precursor cells within a heterogeneous target cell population. Blood. 103 (7), 2677-2682 (2004).
  17. Lecoeur, H., Fevrier, M., Garcia, S., Riviere, Y., Gougeon, M. L. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparametric characterization of cell-mediated cytotoxicity. J Immunol Methods. 253 (1-2), 177-187 (2001).
  18. Carotta, S. Targeting NK Cells for Anticancer Immunotherapy: Clinical and Preclinical Approaches. Front Immunol. 7, 152(2016).
  19. Mandal, A., Viswanathan, C. Natural killer cells: In health and disease. Hematol Oncol Stem Cell Ther. 8 (2), 47-55 (2015).
  20. Rezvani, K., Rouce, R. H. The Application of Natural Killer Cell Immunotherapy for the Treatment of Cancer. Front Immunol. 6, 578(2015).
  21. Angelo, L. S., et al. Practical NK cell phenotyping and variability in healthy adults. Immunol Res. 62 (3), 341-356 (2015).
  22. Zons, P., et al. Comparison of europium and chromium release assays: cytotoxicity in healthy individuals and patients with cervical carcinoma. Clin Diagn Lab Immunol. 4 (2), 202-207 (1997).
  23. Yovel, G., Shakhar, K., Ben-Eliyahu, S. The effects of sex, menstrual cycle, and oral contraceptives on the number and activity of natural killer cells. Gynecol Oncol. 81 (2), 254-262 (2001).
  24. Laue, T., et al. Altered NK cell function in obese healthy humans. BMC Obes. 2, 1(2015).
  25. Hazeldine, J., Lord, J. M. The impact of ageing on natural killer cell function and potential consequences for health in older adults. Ageing Res Rev. 12 (4), 1069-1078 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity
Posted by JoVE Editors on 9/10/2017. Citeable Link.

An erratum was issued for: A Flow Cytometry-Based Cytotoxicity Assay for the Assessment of Human NK Cell Activity. Figure 4 has been corrected to show background-corrected data.

Figure 4 was updated from:

Target cell death vs effector ratio graph; healthy donor vs patient comparison, percent cell death.

to:

Effector:Target cell death comparison graph, healthy donor vs patient, cytotoxicity analysis.

الوسوم

K562
تحليل القائم على الخلوي سيتوتوكسيسيتي تدفق لتقييم نشاط الخلايا البشرية ناغورني-كاراباخ
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.