والهدف من هذا البروتوكول لتغيير بينيترانسي لقاتله تعمل متحولة الهيكل العظمى في الزرد بالانتقاء الوراثي. طفرات قاتلة لا يمكن أن ينمو إلى مرحلة البلوغ، وولدت أنفسهم، ولذلك يصف هذا البروتوكول وسيلة لتتبع وتحديد penetrance عبر أجيال متعددة من ذرية الاختبار.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحويل الزرد الفتاكة Penetrance متحولة الهيكل العظمى بذرية اختبار
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وغالباً ما تعمل متحولة الزرد الاختراق غير كامل، يظهر فقط في بعض طفرات. تعمل المثيرة للاهتمام التي تظهر غير متسق يمكن أن يكون من الصعب على الدراسة، ويمكن أن يؤدي إلى التباس النتائج. بروتوكول الموصوفة هنا نموذج تربية مباشرة الزيادة والنقصان penetrance في طفرات مميتة الزرد الهيكل العظمى. لأنه لا يمكن بشكل انتقائي ولدت طفرات مميتة مباشرة، وتستخدم الاستراتيجية الكلاسيكية الوراثي لاختبار ذرية. ويشمل هذا الأسلوب أيضا بروتوكولات الزرد التنميط كومبيتيتيفي اليل محددة بكر (الصناعية) والمصبوغة الزرد اليرقات الغضاريف والعظام. تطبيق استراتيجية تربية الموصوفة هنا يمكن أن تزيد في بينيترانسي النمط الظاهري الهيكل العظمى للاهتمام تمكين المزيد من النتائج استنساخه في تطبيقات المتلقين للمعلومات. وباﻹضافة إلى ذلك، تناقص penetrance متحولة من خلال هذه الاستراتيجية الوراثي يمكن أن تكشف عن العمليات الإنمائية الأكثر حاسمة تتطلب وظيفة الجينات المتحولة. بينما على وجه التحديد يعتبر الهيكل العظمى هنا، فإننا نقترح أن هذه المنهجية ستكون مفيدة لجميع خطوط متحولة الزرد.
المقدمة
الزرد نظام نموذج قوي لفهم التنمية الهيكل العظمى. مع سلالات متحولة الزرد، يمكن فك علماء البيولوجيا وظيفة الجينات أثناء سكيليتوجينيسيس. ومع ذلك، يمكن أن يقدم الزرد تعمل متحولة الهيكل العظمى مع متغير بينيترانسي1،2،3،4 التي يمكن أن تعيق تحليلات الخلقية والوراثية. والغرض من هذا الأسلوب ثلاثة إضعاف. أولاً، توليد خطوط متحولة الزرد التي تنتج دائماً تعمل شديدة تمكن الدراسات الإنمائية المتلقين للمعلومات مثل تسجيل الوقت الفاصل بين5 وزرع6. يمكن أن تكون شلت هذه الأنواع من الدراسات بمحاولة دراسة تعمل فقط الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأنجزت جميع التجارب المبينة في هذا البروتوكول وفقا والامتثال من جامعة كولورادو وجامعة "ولاية أوريغون رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجان (إياكوك)-
1-إعداد "الأوراق المالية غير محددة ابتداء من"
- تحديد الناقلين متخالف من اليل طافرة من اهتمام زعنفة مقطع 11 والتنميط بمخزون حيوانات كامل-الأخوة بأسلوب الاختيار، مثل الصناعية 12 ، ، من 13 14. وأجرى هذا البروتوكول مع سلالة mef2ca b1086 الزرد.
- التنميط الصناعية
ملاحظة: تم تصميم الإشعال اليل محددة للصناعية بالشركة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هذا البروتوكول أسلوب تربية طويلة الأمد مفيدة لفهم الزرد طفرات الهيكل العظمى (الشكل 1). تربية انتقائية عن طريق اختبار ذرية ينبغي أن تسفر عن تحول في بينيترانسي عموما كل التنازلي والتصاعدي في بضعة أجيال (الشكل 2). في عملنا السابق، قاد جولتين من الوراثي penetrance متوسط الانخفاض من 17% إلى 3%1. وبالمثل، في خط تصاعدي، نحن تحول penetrance متوسط أعلى من 63% إلى 93% في ثلاثة أجيال. إذا بعد أربع جولات من الوراثي لم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الوراثي، يكشف عن الخفايا وظيفة الجينات
التحول تعمل متحولة أن تكون أكثر أو أقل حدة بالانتقاء الوراثي طريقة مباشرة لاكتساب رؤى جديدة في وظيفة الجينات. بالمقارنة مع الأساليب القياسية لتربية غير محددة، يمكن أن تسفر عن البروتوكول المعروضة هنا فهم كثير أكثر اكتمالا لتعمل المسخ. على وجه التحديد، عن طريق توليد سلالات شديدة، اتساع نطاق كامل من تعمل متحولة قد تكشف عن، بما في ذلك بعض أن ينتبه مع الأرصدة غير محددة. وهكذا، يمكن اكتشاف أدوار إنمائية جديدة للجينات قيد الدراسة. وفي المقابل، ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونود أن أشكر كيميل تشاك للتوجيه ووكر Macie لعملها في إتقان وصمة عار الهيكل العظمى، ووكر تشارلين ودوود جون للحصول على مساعدة في وضع هذه الاستراتيجية تربية أولمان بوني لمشورة مفيدة الزرد. وأيد هذا العمل DE024190 K99/R00 إلى جتن.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| بارافورمالدهايد ، حبيبات ، صلبة | شركة تيد بيلا. | 18501 | Pelleted PFA هو بديل أكثر أمانا لمسحوق |
| PFA كلوريد المغنيسيوم ، | Acros Organics | الصلبة 223210010 | |
| 10x PBS ، Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 دليل على الإيثانول | |||
| Alcian Blue ، Anatech | Ltd الصلبة. | 867 | يجب أن يكون من Anatech |
| Alizarin Red ، صلب | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol ، سائل | فيشر | BP229 1 | |
| بيروكسيد الهيدروجين ، سائل | فيشر | BP263500 | |
| هيدروكسيد البوتاسيوم ، الصلبة | فيشر | P250 500 | |
| StepOnePlus في الوقت الحقيقي آلة PCR | الأنظمة الحيوية | التطبيقية | |
| لوحة تفاعل بصرية سريعة من MicroAmp بسعة 96 بئر مع الباركود (0.1 مل) | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4346906 | |
| ختم Microseal 'B' | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix ، High ROX | LGC | KBS-1016-022 | |
| https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk KASP حسب التصميم Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| تريس حمض الهيدروكلوريك ، فيشر الصلب | BP153 500 | ||
| كلوريد البوتاسيوم ، صلب | فيشر | BP366 500 | |
| توين -20 ، سائل | فيشر | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Drop Pasteur Pipets Fisher | 13-678-30 | ||
| Nanodrop | ThermoFisher | لقياس كمية الحمض النووي |
المراجع
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
