هنا نقدم طريقة لقياس مباشرة فرض مستويات من المنقي الإشريكيّة القولونية الجيش الملكي النيبالي، فضلا عن طريقة لمقارنة المستويات النسبية لنقل الجيش الملكي النيبالي، أو أي أخرى قصيرة الجيش الملكي النيبالي، عبر عينات مختلفة على أساس الإضافة للمصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي نقل التعبير عن جين مرجع الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نقل الجيش الملكي النيبالي (الحمض الريبي النووي النقال) جزء أساسي من إليه متعدية الجنسيات في أي كائن حي. ترنس ربط ونقل الأحماض الأمينية إلى الريبوسوم ترجمة. المستويات النسبية لمختلف ترنس، ونسبة أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال إلى إجمالي الحمض الريبي النووي النقال، المعروفة باسم مستوى الشحن، عوامل هامة في تحديد الدقة والسرعة في الترجمة. ولذلك، بوفرة ومستويات الشحن ترناس هي المتغيرات الهامة لقياس عند دراسة تخليق البروتين، على سبيل المثال تحت ظروف الإجهاد المختلفة. هنا، يمكننا وصف أسلوب الحصاد الحمض الريبي النووي النقال ومباشرة قياس الوفرة النسبية ومستوى الشحن المطلق لأنواع محددة من الحمض الريبي النووي النقال في الإشريكيّة القولونية. هو المقطوع الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طريقة أن يتم الاحتفاظ بالسندات مجا بين الحمض الريبي النووي النقال وبه الأحماض الأمينية. ثم يتعرض الجيش الملكي النيبالي لجل التفريد والشمالية النشاف، مما يؤدي إلى فصل ترناس التهمة الموجهة إليه ودون توجيه تهم لهم. يمكن مقارنة مستويات محددة ترنس في عينات مختلفة بسبب إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للتطبيع. قبل تنقية الحمض النووي الريبي، يمكننا إضافة 5% خلايا كولاي التي أكثر الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك لكل عينة. ثم هو تطبيع مقدار الفائدة في عينة وأنواع الحمض الريبي النووي النقال بمقدار الحمض الريبي النووي النقالسيلك في نفس العينة. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا قبل تنقية الحمض النووي الريبي مزية على إضافة المنقي سبايك في الكشف بأنه يمثل أيضا أية فروق في كفاءة تحلل الخلية بين العينات.
المقدمة
في ما يلي، نقدم طريقة لتحديد كمية محددة ترناس وقياس فرض رسوم على المستويات من النشاف الشمالية. الأسلوب الذي يستند إلى تقنية وضعتها أولاً فارشنيي et al. 1-حصاد الخلايا إلى حمض التريكلوروسيتيك (TCA) وحفظ العينات في 0 درجة مئوية في جميع أنحاء تنقية الحمض النووي الريبي، هو السندات إستر بين الحمض الريبي النووي النقال والأحماض الأمينية المصانة2،،من34. ترنس أمينواسيلاتيد يمكن تمييز من نظرائهم نوناسيلاتيد هلام التفريد وشمال النشاف، يرجع إلى تنقل انخفض أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال في الهلام، الناجمة عن الأحماض الأمينية تساهمي ملزمة5. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نقدم بروتوكول لتطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال بالإضافة إلى المصطلحات الخاصة في الخلايا overexpressingسيلك الحمض الريبي النووي النقال نادراً ما تستخدم 4.
ترنس بعض من الجزيئات الأكثر وفرة في الخلية البكتيرية وجزء حيوي للغاية للترجمة الآلية. ترناس ربط الأحماض الأمينية ونقلها إلى ترجمة ريبوسوم. ربط الأحماض الأمينية ترنس (أمينواسيليشن أو شحن) يسر aminoacyl الحمض الريبي النووي النقال سينثيتاسيس. الوفرة النسبية لمختلف ترنس مشحونة مهم لضمان الدقة تخليق البروتين، لأنه اتهم التمثيل الناقص لقرابة الحمض الريبي النووي النقال كودون معين رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) يزيد من احتمال أن سيكون القرب من قرابة الحمض الريبي النووي النقال خطأ تسليم بالأحماض الأمينية في سلسلة ببتيد المتزايد في الريبوسوم6. وتتجلى الأهمية للحمض الريبي النووي النقال مشحونة باستجابة واسعة النطاق من الخلية كولاي إلى هبوط حاد في مستويات مشحون الحمض الريبي النووي النقال؛ استجابة صارمة. خلال الاستجابة الصارمة هو خفض التوليف ترنس والكشف الريباسي مرناس معظم صالح نسخ مرناس المحددة المرتبطة ببقاء الحمض الأميني الحيوي والإجهاد، وهو خفض معدل نمو الخلايا هائلة7 . وعلاوة على ذلك، أظهرت مؤخرا العمل لنا ولغيرنا أن كولاي يحط بنشاط غالبية الحمض الريبي النووي النقال ردا على تشدد على أن الحد من ترجمة4،8، مما يوحي بأن تعديل المستويات الحمض الريبي النووي النقال الهامة للتعامل مع هذه الضغوط. وهكذا، سوف تكون قياسات موثوقة من وفرة الحمض الريبي النووي النقال وفرض مستويات أداة هامة لفهم استجابات الضغط البكتيرية تماما.
القولونية يستخدم عادة للتعبير عن البروتين المؤتلف، ونظرا للاختلافات في استخدام كودون بين الأنواع، هو التعبير الأمثل غالباً ما واجهت مشكلة9. وهذا يمكن التحايل عليها بالتعبير عن ترناس الإضافية اللازمة لترجمة مرناً المؤتلف10. قياسات للحمض الريبي النووي النقال فرض مستويات في هذه السلالات يمكن توجيه جهود استكشاف الأخطاء وإصلاحها والمساعدة في تحسين التعبير البروتين.
هذا الأسلوب يمكن أيضا الكشف عن "ميشارجينج"؛ أمينواسيلاتيد جزيء الحمض الريبي النووي النقال مع من الأحماض الأمينية غير قرابة. قد يسبب أمينواسيليشن بالأحماض الأمينية مختلفة من الحمض الريبي النووي النقال لترحيل مع سرعات مختلفة قليلاً عن طريق الجل بولياكريلاميدي1،11. وفي بعض الحالات، يمكن أيضا استخدام الأسلوب التمييز بين أنماط مختلفة التعديل على خلاف ذلك مماثلة ترنس3.
آخر أنشأ الإجراء البيوكيميائية للتحقيق في فرض مستويات الحمض الريبي النووي النقال هو فوق يودات الأكسدة. الأسلوب يعتمد على ملاحظة مفادها أن أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال محمي من فوق يودات الأكسدة وليس من دون توجيه تهمة إليه الحمض الريبي النووي النقال. بعد فوق يودات علاج الأكسدة تغذيتها الحمض الريبي النووي النقال يستخدم لتقدير مستويات الشحن من الجيش الملكي النيبالي المقطوع. ومع ذلك، قد تبين تغذيتها ترنس عدة تتأثر بالعلاج وبالتالي توفير بعض عدم الدقة12. الطريقة المعروضة هنا تدابير الشحن مباشرة من تنقية الجيش الملكي النيبالي، وتستبعد بالتالي أي تحيز من التفاعلات الكيميائية أو الانزيمية. واحد الحد من هذا الأسلوب الكشف عن تلك الأنواع الحمض الريبي النووي النقال واحد فقط في كل مرة، حتى على الرغم من أن لطخة الشمالية نفسها يمكن تجريده وريبروبيد ترناس متعددة، أنها مضيعة للوقت وشاقة إلى حد ما جمع البيانات بشأن العديد من ترناس.
طريقة يمكن الاعتماد عليها لتطبيع عينات لبعضها البعض أمر حيوي في الدراسات حيث أن الهدف مقارنة المستويات النسبية لجزيء عبر عينات مختلفة. نقدم لك هنا إجراء تطبيع للجيش الملكي النيبالي حيث يتم إضافة قاسمة صغيرة كولاي الخلايا overexpressing الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك كالمصطلحات خاصة في لجميع العينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي. يعد هذا الأسلوب مفيداً عندما يكون الإعداد التجريبية مثل لا الحمض النووي الريبي الذاتية التي يمكن أن تكون موثوق بها أن يقدم ليس فقط عند دراسة ترنس لكن للتحديد الكمي النسبي لأي أنواع من الحمض النووي الريبي في نفس تركيز الخلوية في جميع العينات. على سبيل المثال، غالباً ما يستخدم مستوى "التدبير المنزلي" مثل الحمض النووي الريبي الريباسي الرنا كمرجع ذاتية لمقارنة الكميات النسبية للجيش الملكي النيبالي آخر بين مختلف عينات13. ولكن هذا الاستخدام القليل إذا كان تركيز الجيش الملكي النيبالي الإشارة الخلوية يتراوح بين العينات، كما يمكن أن يكون الحال بالنسبة للحمض النووي الريبي الريباسي إذا أخذ العينات يحدث أثناء إجهاد استجابة15،،من1617 أو الدخول إلى مرحلة ثابتة17. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للعينات التجريبية قبل تنقية الحمض النووي الريبي يوفر طريقة متينة ودقيقة لتطبيع المستقلة لإعداد العينات. وهناك طريقة أخرى للتوحيد القياسي هو إضافة واحد أو أكثر المصطلحات الخاصة في الكشف على العينات التجريبية بعد تنقية الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا تراعي أي اختلافات في الحمض النووي الريبي الانتعاش بين العينات.
استخدام خلايا كولاي أوفيريكسبريس هذا عيب الإشارة الجيش الملكي النيبالي كمسمار في الخلايا (انظر الشكل 1) في تجربة على كولاي التي يترتب عليها بالإضافة إلى ذلك كمية صغيرة من خارجية كولاي مجموع الجيش الملكي النيبالي عينات. علينا أن نصحح لهذه الإضافة عن طريق تحليل عينة تحتوي على إلا سبايك في الخلايا بالتوازي مع العينات التجريبية (انظر الشمالية لطخة في الشكل 2، لين المسمى "سيلك"). البروتوكول عرضت وضع من أجل K-12 كولاي ، لكن من المرجح أن تكون قابلة للتطبيق لمعظم الأنواع البكتيرية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-التحضير للثقافات البكتيرية.
- تنمو جميع الثقافات في قوارير Erlenmeyer مع نسبة حجم ثقافة/قارورة من 1/6 على الأكثر. في إعداد نموذجي تجريبي، تنمو الثقافات في 37.0 درجة مئوية وتهز 160 لفة في الدقيقة في مورفولينيبروبانيسولفونيك الحمضية (والمماسح) الحد الأدنى المتوسط 18 تستكمل مع مصدر الكربون المفضل، على سبيل المثال الجلوكوز 0.2%، على الأقل من 10 أجيال متعاقبة قبل الحصاد الرنا.
- اليوم قبل موسم الحصاد في الجيش الملكي النيبالي، تضعف ثقافة المتضخمة من السلالة المرغوبة في الممسحات المتوسطة الدنيا في مثل هذه طريقة أنها ستصل إلى التطوير التنظيمي المطلوب 436 في الوقت المطلوب وفي اليوم التالي. حساب حجم الثقافة المتضخمة ﻻستخدام التطعيم بالصيغة:
ملاحظة: هنا، التطوير التنظيمي الجديد يدل على التطوير التنظيمي المطلوب 436 بعد الحضانة، الخامس الجديد يشير إلى حجم ثقافة المخفف، OD القديم يدل على التطوير التنظيمي 436 ثقافة المتضخمة المخفف من، ز ترمز إلى عدد الأجيال التي سوف تنمو الثقافة، من الوقت لتمييع (تي 1) في الوقت الذي هناك حاجة اليوم بعد (تي 2) ويمكن أن تحسب ك: الوقت الفرق (في دقيقة) بين تي 1 وتي 2 مقسوماً على وقت جيل (في دقيقة). لضمان نمو الحالة المستقرة في وقت أخذ العينات، ينبغي ز ≥ 10؛ V القديم يدل على حجم نمت خارج الثقافة التي ينبغي أن تنقل إلى وسيلة جديدة. هذه المعادلة هي تقريب التي لا تراعي أي مرحلة انتقالية؛ ظاهرة كثيرا ما لوحظ بعد تمييع ثقافة الخارج نمت في وسائط الإعلام الجديدة.- ظروف النمو سوف تختلف تبعاً للغرض من هذه التجربة، ولكن للحد من خلية إلى الاختلاف في مستويات الحمض الريبي النووي النقال، وزيادة إمكانية تكرار نتائج النتائج، (مستحسن) تنمو الثقافات ثابت الدولة قبل أخذ العينات 19-
2. إعداد المصطلحات الخاصة في الخلايا
ملاحظة: كولاي سلالة MAS1074، الذي يعبر عن الجينات سيلك ترميز الحمض الريبي النووي النقال سيلك تحت سيطرة الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج)- مروج إيندوسيبلي كارتفاع في الضغط.
- ديلوت ثقافة المتضخمة من MAS1074 إلى التطوير التنظيمي 436 0.05 في الممسحات المتوسطة الأدنى تستكمل مع 100 ميكروغرام/مل الأمبيسلّين والجلوكوز 0.2%. تنمو ثقافة عند 37 درجة مئوية تهز 160 لفة في الدقيقة-
ملاحظة: انظر المناقشة لاستخدام السلالة المرجعية البديلة. - "في التطوير التنظيمي" 436 ~ 0.1، إضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 ملم للحث على التعبير عن الحمض الريبي النووي النقال سيلك. تنمو الثقافة للتطوير التنظيمي 436 ~0.5 (~ 3-4 ح النمو) ونقل قارورة الثقافة إلى حمام الثلج. الحفاظ على ثقافة المصطلحات الخاصة في الخلية على الجليد حتى جميع العينات لتنقية الحمض النووي الريبي قد تم حصادها.
3. حصاد عينات التجريبية.
توج- الحارة قبل (37 درجة مئوية) واحد 100 مل قارورة Erlenmeyer (أو ما شابه ذلك) التي تحتوي على 4 مل 10% (w/v) التريكلوروسيتيك حامض (TCA) لكل عينة بوضعه في حمام مائي ساخن.
ملاحظة: الحذر، TCA تتحلل عند التسخين، المنتجة للأبخرة السامة والمسببة للتآكل، بما في ذلك كلوريد الهيدروجين وكلوروفورم. الحل في الماء حمض قوي؛ أنه رد فعل عنيف مع القواعد واكاله لكثير من المعادن. وينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند استخدام هذا السائل- - فورا قبل الحصاد الخلية، قياس وتسجيل التطوير التنظيمي 436 الثقافة-
- حصاد الخلايا، نقل 4 مل ثقافة قارورة المعالجون مسبقاً تتضمن TCA.
- ميكس العينة التي يحوم في قارورة باليد لتعطيل الأنشطة الانزيمية كل خلط س. 5 مع TCA فورا ومما يحافظ على مستويات الشحن ترنس.
ملاحظة: إذا جمع عينات متعددة، الاحتفاظ بحصادها عينات في كلورفورم الميثيل على الجليد حتى جميع العينات التي تم جمعها-
4. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا
ملاحظة: إعداد خلايا سبايك هو الموصوفة في الخطوة 2-
- عند جميع العينات لإعداد الجيش الملكي النيبالي قد جمعت، وإضافة 5% ارتفاع في خلايا (استناداً إلى OD) لكل عينة.
ملاحظة: يحسب حجم الثقافة سبايك في الخلية المطلوبة بالصيغة:
حيث V سبايك يدل على حجم الخلية سبايك في الثقافة اللازمة، الخامس أكسب يشير إلى الحجم الخلية التجريبية المقطوع الثقافة (دون TCA)، يدل OD أكسب التطوير التنظيمي 436 ثقافة الخلية التجريبية في وقت الحصاد في TCA. OD سبايك يدل على التطوير التنظيمي 436 ثقافة سبايك في الخلية. إذا كان يتم حصاد عينات متعددة في مختلف المواد المستنفدة للأوزون، ينبغي تعديل حجم الخلايا سبايك أضيف وفقا للصيغة الواردة أعلاه لكل عينة. - لقياس المساهمة من الخلايا سبايك في الجيش الملكي النيبالي وأنواع الفائدة، تعد عينة فقط تحتوي على المصطلحات الخاصة في الخلايا بخلط 4 مل سبايك في الخلايا مع 4 مل TCA. إعداد الجيش الملكي النيبالي من هذه العينة بنفس الطريقة أما بالنسبة للعينات الأخرى.
- اختيارياً، تأخذ قارورة أخرى تتضمن فقط العينة التجريبية، دون ارتفاع في الخلايا، وله بتحديد مقدار مساهمة العينة التجريبية للحمض الريبي النووي النقال وتشمل مستويات سيلك؛ مستويات الحمض الريبي النووي النقال سيلك في الذاتية كولاي K-12 منخفضة لماما-
5. إعداد الجيش الملكي النيبالي
ملاحظة: "الجيش الملكي النيبالي" إعداد بروتوكول الموصوفة هنا أساسا التي وصفها فارشنيي et al. 1؛ لتجنب ديسيليشن ترنس أمينواسيلاتيد أثناء تنقية من المهم أن تبقى العينات في درجة الحموضة الحمضية وفي 0 درجة مئوية طوال فترة تنقية. استخدام أنابيب/قوارير نظيفة معقمة للاحتفاظ بعينات والحلول، وإعداد جميع الحلول مع عالي النقاوة (18.2 MΩ·cm المقاومة) الماء-
- مل 8 من أجل كل عينة في أنبوب الطرد مركزي برود الثلج. الطرد المركزي عينات لمدة 10 دقيقة في 9,500 س ز في 4 ° "جيم تماما" إزالة المادة طافية وريسوسبيند في 0.3 مل الباردة 0.3 M خلات الصوديوم، الأس الهيدروجيني 4.5 و 10 مم يدتا. نقل كل عينة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي باردة 1.5 مل
- وإضافة الفينول 0.3 مل اكويليبراتيد مع المخزن المؤقت نفسه.
ملاحظة: الحذر، الفينول تنتج أبخرة سامة وهو الغاية أكالة للجلد. - دوامة كل عينة x 10 ل 15 ثانية مع على الأقل 1 دقيقة بين كل دوامة. ما بين فورتيكسينج تبقى العينات في 0 ° C. استخدم توقفات متكررة لضمان أن تظل العينات الباردة. °
- عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 20,000 g x 4 جيم-نقل أنابيب المرحلة المائية (المرحلة العليا) إلى الجديدة 1.5 مل ميكروسينتريفوجي. إضافة الفينول 0.3 مل الباردة ودوامه 4 × 15 ثانية كما كان من قبل. °
- الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20,000 g x 4 جيم-نقل المرحلة المائية إلى ميكروسينتريفوجي مل 1.5 الجديد، الباردة أنابيب تحتوي على 2.5 ضعف حجم 96 ٪ الإيثانول (~ 750 ميليلتر). يعجل بالجيش الملكي النيبالي بحضانة أنابيب لح 1-20 درجة مئوية أو بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية.
- عينات أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 20,000 g x 4 درجة مئوية. تجاهل المادة طافية وإضافة 1 مل إيثانول 70% الباردة بعناية دون إزعاج بيليه الجيش الملكي النيبالي. عكس بلطف مرة واحدة لغسل الدواخل الأنابيب مع الإيثانول.
ملاحظة: يمكن أن يكون بيليه من الصعب أن نرى في هذه الخطوة.
° - الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 20,000 g x 4 "جيم تماما" إزالة المادة طافية وأيردري بيليه حتى يتم ترك لا الإيثانول. ريسوسبيند بيليه بشدة فورتيكسينج في 20 ميليلتر الباردة 10 صوديوم اسيتات الأس الهيدروجيني 4.5 و 1 مم يدتا.
ملاحظة: عدم الإفراط الجاف بيليه كما أنه سوف يصبح من الصعب على ريسوسبيند- - اختيارياً، تقييم تركيز الحمض النووي الريبي عن طريق قياس امتصاص في 260 nm-
- اختيارياً، تقييم الجودة للجيش الملكي النيبالي المنقي [اغروس] هلام التفريد 20-
- تخزين العينات في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول هنا.
ملاحظة: لتمييز فرقة أمينواسيلاتيد لطخة الحمض الريبي النووي النقال من نظيرتها ديسيلاتيد على الشمالي، كيميائيا على استعداد ديسيلاتيد الكوة بالمعالجة القلوية. لمعظم الأغراض، أنها كافية ديسيلاتي عينة واحدة لكل اسطوانة الشمالية-
نموذج- ذوبان الجليد الجيش الملكي النيبالي على الجليد. نقل من قاسمة 4 ميليلتر من عينات الحمض النووي الريبي لأنبوب جديد. إضافة 46 درجة الحموضة من HCl تريس ميليلتر 9.0. احتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية إضافة 15 ميليلتر من خلات الصوديوم 0.3 م في الأس الهيدروجيني 4.5
- وبعد ذلك إضافة 125 ميليلتر من الإيثانول 96%. يعجل بالجيش الملكي النيبالي في-20 درجة مئوية حاء 1 °
- الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 20,000 g x 4 "جيم تماما" إزالة المادة طافية وريسوسبيند في 4 ميليلتر الباردة 10 ملم صوديوم اسيتات الأس الهيدروجيني 4.5 و 1 مم يدتا.
ملاحظة: البروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا، إذا كان يتم تخزين العينة في-80 درجة مئوية.
7. هلام التفريد والنشاف شمال
عينة- ميكس 4 ميليلتر (غير المعالجة أو كيميائيا ديسيلاتيد) مع 6 ميليلتر تحميل المخزن المؤقت (0.1 M خلات الصوديوم (pH 5.0)، م 8 اليوريا، والأزرق بروموفينول 0.05%، وزايلين زيلين نفط 0.05%).
ملاحظة: تذكر لتشمل العينة التي تحتوي على المصطلحات الخاصة في الخلايا فقط، عينة ديسيلاتيد كيميائيا (والعينة دون ارتفاع في الخلايا، وإذا كان أحد قد أعد). - تحميل العينات إلى 0.4 مم سميكة 6.5% polyacrylamide هلام (19:1-أكريلام ide:bisacrylamide) التي تحتوي على اليوريا 8 أمتار في المخزن المؤقت خلات الصوديوم 0.1 M (pH 5.0). استخدم 60 سم طويلة الجل للفصل السليم بين الأنواع الحمض الريبي النووي النقال.
- منفصلة الجيش الملكي النيبالي بالتفريد في جل الخامس/سم 10 عند 4 درجة مئوية، حتى بروموفينول الأزرق يصل إلى أسفل الجل (ح ~ 20)- يستخدم صبغ
- المنطقة من الصبغة زايلين زيلين نفط و 20 سم أسفل نحو الأزرق bromophenol النشاف (ينبغي أن تكون المسافة بين الأصباغ اثنين 25-30 سم). عناية منفصلة ألواح الزجاج اثنين، حتى يظل الجل على واحد منهم. قطعة رقيقة من ورق الترشيح هو خفض لحجم منطقة blotting المطلوب ووضعت على رأس الجزء من جل الذي سيتم استخدامه النشاف. قطع الأجزاء من الهلام التي لا تغطيها أوراق الترشيح وتجاهل. استخدام ورق الترشيح لرفع بعناية قطعة جل بعيداً عن لوحة زجاج.
ملاحظة: جل كبيرة هشة للغاية حتى التعامل مع الرعاية- - غشاء نايلون مشحونة بشكل إيجابي (مثلاً غشاء هيبوند ن +) يوضع على رأس الجل وهو اليكتروبلوتيد في 20 الخامس لمدة 90 دقيقة باستخدام 40 مم تريس-خلات (الرقم الهيدروجيني 8.1)، 2 مم يدتا كنقل المخزن المؤقت-
- التشعب الجيش الملكي النيبالي للغشاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية-الضوء (0.12 ي/سم 2)-
ملاحظة: يمكن تخزين الغشاء الآن في درجة حرارة الغرفة والبروتوكول يمكن أن يكون مؤقتاً هنا.
8. التصميم والتحقق من المسابر
ملاحظة: دقيق التصميم والتحقق من المسابر وصمة عار الشمالية أمر حاسم للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها وتجنب غير المرغوب فيها عبر-التهجين مع الأنواع الأخرى من الحمض النووي الريبي.
- استخدام النوكليوتيد الاصطناعية قصيرة كتحقيقات. تصميم التسلسل المسبار في طريقة أن أنها مكملة للجزء الأكثر فريدة من نوعها من تسلسل الحمض الريبي النووي النقال للفائدة-هذا هو غالباً حلقة أنتيكودون.
ملاحظة: قائمة بتسلسل الحمض الريبي النووي النقال المتوقعة من الكائنات المختلفة يمكن الاطلاع على في الحمض الريبي النووي النقال الجينوم قاعدة البيانات (جترنادب) 21- - ضبط طول التسلسل للحصول على توقع ذوبان درجة حرارة 55-65 درجة مئوية.
- الانفجار (الأساسية المحلية محاذاة أداة البحث) تسلسل المختار ضد تسلسل الجينوم من السلالة البكتيرية المستخدمة في التجربة، للتحقق من أن التسلسل فريدة من نوعها للحمض الريبي النووي النقال المحدد، كما هو موضح في 22-
ملاحظة: الجدول 1 قوائم تسلسل التحقيق المقترح لعدة ترنس مختلفة من K12 كولاي. في حالة محددة للحمض الريبي النووي النقال لمصلحة التحقيق، شريطين فقط مرئية على وصمة عار شمال (التهمة الموجهة إليه ودون توجيه تهم لهم من الحمض الريبي النووي النقال) وفرقة واحدة فقط مرئياً في حارة مع نموذج ديسيلاتيد (دون توجيه تهمة إليه الحمض الريبي النووي النقال). في حالة وجود اثنين أو أكثر من نطاقات أو إذا كان كذلك هو المطلوب التحقق من الصحة لخصوصية التحقيق، انظر المناقشة.
9. التهجين من وصمة عار شمال
ملاحظة: في الخطوات التالية، هو تهجين الغشاء تسلسلياً مع تحقيقات تكميلية إلى ترناس المحددة المطلوبة، بما في ذلك محدد مسبار للإشارة الحمض الريبي النووي النقال سيلك.
- وضع الغشاء في أنبوب تهجين وإضافة 6 مل التهجين الحل (0.9 كلوريد م الصوديوم، 0.05 متر مكعب NaH 2 بو 4 (7.7 درجة الحموضة)، 5 ملم يدتا، 0.5% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، 100 ملغ/مل من المنفصمة والتشويه والتحريف الحمض النووي في الحيوانات المنوية الرنجة و 5 x Denhardt ' s الحل (100 x دينهارت ' حل s = ألبومين المصل البقري 2% و 2% بوفيدون 40 2% فيكل)).
- هجن قبل الغشاء في المخزن المؤقت ح 1 بالتناوب في 42 ° 30 إضافة جيم pmol المشعة اليغو الحمض النووي المسبار 5 '-نهاية-المسمى مع 32 ف (أعد كما وصفها سامبروك et al. 23)
ملاحظة: الحذر، يمكن تقديم انبعاثات الجسيمات ذات الطاقة العالية بيتا من 32 ف الجلد كبيرة وخطر الجرعة العين. وينبغي اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند استخدام 32 النفايات المشعة ص ينبغي التخلص من وفقا لبروتوكولات السلامة المؤسسية المناسبة. - احتضان التحقيق مع الدورية غشاء بين عشية وضحاها في 42 ° جيم إزالة المسبار باستخدام ماصة المتاح 10 مل.
ملاحظة: إذا كانت مخزنة في ثلاجة المسبار يمكن إعادة استخدامها- - في الأنبوب التهجين، يغسل الغشاء قريبا في 50 مل من 0.3 M كلوريد الصوديوم، سترات الصوديوم 30 ملم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v) في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: هذا الغسيل الأول يحتوي على مسبار كثير غير منضم ويجب التعامل معها كعاليه الإشعاع. - كرر الخطوة 9.4 مرة واحدة، ثم نقل الغشاء إلى حاوية بلاستيكية مسطح أو صينية بما في ذلك غطاء. تغطي الغشاء بمحلول الغسيل (0.3 م NaCl، سترات الصوديوم 30 ملم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v)) وتبني عليه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- تغيير الحل الغسيل ويستمر الغسيل حتى تم الحصول على إشارة مرضية لنسبة الضوضاء (غالباً 3-4 التغيرات الغسيل الحل). استخدام أنبوب جايجر-مولر لاكتشاف كيفية تغيير نسبة الإشارة إلى الضوضاء بقياس الإشعاع من ناحية فارغة من الغشاء ومقارنتها بالمنطقة حيث قد تهجين التحقيق على وجه التحديد للحمض الريبي النووي النقال.
- لكي تتمكن من قطاع التحقيق من الغشاء بعد التعرض، وضمان أن (مهم) الغشاء لم تجف قبل إجراء تجريد. وضع الغشاء في حقيبة بلاستيكية رقيقة أو التفاف محكم باستخدام البلاستيك التفاف وختم أن يكون الغلق بالشريط أو لحام. ضع الغشاء مختوم على شاشة فوسفوريماجينج.
ملاحظة: التعرض المطلوبة على الشاشة فوسفوريماجينج يتم تحديد الوقت بنشاط محدد للتحقيق، كمية الحمض النووي الريبي سبر foالبحث والتطوير، وكفاءة التهجين للتحقيق، ويمكن أن تختلف إلى حد كبير؛ من بضع دقائق إلى عدة أيام. مع التجربة، كثافة الإشعاع الكشف على الغشاء مع أنبوب جايجر-مولر يعطي مؤشرا جيدا لوقت التعرض المطلوبة. للقياس الكمي موثوقة، المهم أن لا يتم تعريض الشاشة.
مسح الشاشة فوسفوريماجينج باستخدام ماسح ضوئي ليزر - وحفظ الملف في ".gel " الشكل.
ملاحظة: إشارة عالية لنسبة الضوضاء ضروري لتقدير موثوق بها. التدقيق الحمض الريبي النووي النقال ينبغي أن يسفر عن شريطين؛ واحد أمينواسيلاتيد التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال (الهجرة أبطأ) وواحد من ديسيلاتيد التي تحتوي على الحمض الريبي النووي النقال (الهجرة أسرع). انظر الشكل 2-
10. تجريد الغشاء
ملاحظة: قبل يمكن سبر الغشاء للحمض الريبي النووي النقال آخر، يجب أولاً إزالة التحقيق السابقة بتجريد الغشاء.
- الحرارة ما يكفي تجريد المخزن المؤقت (15 ملم كلوريد الصوديوم، سترات الصوديوم 1.5 مم، الحزب الديمقراطي الصربي 0.1% (w/v)) لتغطية الغشاء ومن أجل ذلك عبر الغشاء. تبني عليه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- ويمكن الكشف عن تكرار الخطوة 10.1 حتى لا الإشعاع مع أنبوب جايجر-مولر؛ والغشاء يمكن الآن إعادة المهجن اتباع الخطوات الموضحة في القسم 9-
11. التحديد الكمي للحمض الريبي النووي النقال وفرض مستويات
- تحميل الملف.gel إلى التصوير البرنامج (انظر الجدول للمواد). رسم خط عمودي على طول كل واحد من الممرات عينة في مثل هذه طريقة أنه يمتد أكثر من عرض حارة ولكن يستبعد حواف العصابات حيث يمكن الإشارة متفاوتة، كما هو مبين في الشكل 3 ألف-
- تصور التهم من كل حارة بالنقر فوق " التحليل "-> " "إنشاء الرسم البياني" ". تعريف يدوياً على قمم اثنين يمثلون التهمة الموجهة إليه والحمض الريبي النووي النقال دون توجيه تهم لهم من كل حارة، كما هو مبين في الشكل 3.
- الحصول على التهم من كل ذروة بالنقر فوق " التحليل "-> " "تقرير منطقة" "، وسجل المنطقة الخاضعة لكل منهما من قمم اثنين.
- عند قد تم سبر وصمة عار للحمض الريبي النووي النقال سيلك والحمض الريبي النووي النقال واحد على الأقل من الاهتمام، تطبيع مستويات الحمض الريبي النووي النقال الفائدة للحمض الريبي النووي النقال سيلك.
حساب نسبة الحمض الريبي النووي النقال التي تنشأ من الخلايا في ارتفاع في كل حارة
- واطرح من إشارة المجموع في هذا الممر باستخدام المعادلة:
ملاحظة: هنا، عينة من الحمض الريبي النووي النقال = الإشارات التي تم الحصول عليها من ممر واحد من غشاء سبر للحمض الريبي النووي النقال المطلوب؛ عينة سيلك = الإشارات التي تم الحصول عليها من لين نفس الغشاء نفسه سبر للحمض الريبي النووي النقال سيلك؛ Ref الحمض الريبي النووي النقال = الإشارات التي تم الحصول عليها من لين التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلا سبايك في الخلية من الغشاء نفسه سبر للحمض الريبي النووي النقال المطلوب؛ Ref سيلك = الإشارات التي تم الحصول عليها من الممر الذي يحتوي على الخلية فقط المصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي الغشاء نفسه سبر للحمض الريبي النووي النقال سيلك. - إلى تطبيع، قيمة الحمض الريبي النووي النقال تصحيحها من كل حارة القسمة إشارة سيلك الحمض الريبي النووي النقال من الممر نفسه.
ملاحظة: لا يكاد مساهمة إلى إشارة سيلك الحمض الريبي النووي النقال من الخلايا المنسوخة (انظر الشكل 2، لين المسمى "-سيلك ").
- واطرح من إشارة المجموع في هذا الممر باستخدام المعادلة:
- حساب الحمض الريبي النووي النقال فرض مستوى كل حارة بتقسيم الإشارة الواردة من ذروة يمثلون مشحونة بالحمض الريبي النووي النقال مع مجموع الإشارات من كلا قمم (مشحونة + بدون تهمة).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام الإجراء الموصوفة هنا، الوفرة والشحن وقيست مستويات ترنس الثلاثة في K-12 كولاي قبل وأثناء المجاعة من الأحماض الأمينية.
سلالة أوكسوتروف ارجينين NF9154 (لوي thr supE44 mtl ثي argH له) كان نمت على الأقل عشرة أجيال والمماسح الحد الأدنى تستكمل مع والغليسيرول 0.4 في المائة، 50 ميكروغرام/مل ثريونين، لوسين، ارجينين، والحامض الأميني 5 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية تهتز في المديين المتوسط 1...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول ويصف كيفية قياس مستوى شحن محددة كولاي في نفس الوقت ترنس ومقارنة مستويات نسبية من ترنس في عينات مختلفة. النقاط الحرجة للبروتوكول 1) للتعامل مع العينات بطريقة أن تبقى مستويات الحمض الريبي النووي النقال مشحون الخلوية، 2) تطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طريقة أنه يمكن مقارنة مستويات الحمض الريبي النووي النقال النسبي في عينات مختلفة موثوق، و 3) ضمان sp اسيفيسيتي تحقيقات مختارة ترناس الفائدة. يتم تناول هذه النقاط على حدة أدناه.
تنقية الحمض الريبي النووي النقال<...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون ماريت وارير للمساعدة التقنية الممتازة. هذا العمل كان يدعمها "المجلس الدانمركي" "البحوث المستقلة" | العلوم الطبيعية [1323-00343B]، ومؤسسة البحوث الوطنية الدانمركية [DNRF120].
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اليوريا | ميرك | 57-13-6 | نقاء >99٪ |
| بولي أكريلاميد | سيرفا | 79-06-7 | |
| مكرر (N ، N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) | سيجما | 76-03-9 | |
| فينول | ميرك | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| جلوكوز | |||
| أسيتات | |||
| EDTA | |||
| الإيثانول | |||
| تريس | |||
| حمض | |||
| كلوريد | |||
| NaH2PO4 | |||
| سترات | |||
| SDS | |||
| الرنجة المنوية الحمض النووي | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 & gamma ؛ ATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (مجسات) | TAG كوبنهاغن | ||
| هايبوند N+< / sup> غشاء | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| مقياس الطيف | |||
| الضوئي فرن | |||
| Geiger-M & uuml; ller أنبوب | |||
| الفوسفور شاشة | GE الرعاية الصحية | ||
| أنبوب التهجين | |||
| قوارير ثقافة قوارير | |||
| 1.5 مل أنابيب | |||
| الدقيقة 20 مل أنابيب | |||
| <قوية>الاسم< قوي> | <قوي>الشركة< / strong> | رقم الكتالوج < / strong > | التعليقات < / strong > |
| Software < / strong> | |||
| ImageQuant | GE الرعاية الصحية | ||
| Excel | Microsoft |
المراجع
- Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
- Sorensen, M. A. Charging levels of four tRNA species in Escherichia coli Rel(+) and Rel(-) strains during amino acid starvation: a simple model for the effect of ppGpp on translational accuracy. J Mol Biol. 307 (3), 785-798 (2001).
- Krüger, M. K., Sørensen, M. A. Aminoacylation of hypomodified tRNAGlu in vivo. J. Mol. Biol. 284 (3), 609-620 (1998).
- Svenningsen, S. L., Kongstad, M., Stenum, T. S., Muñoz-Gómez, A. J., Sørensen, M. A. Transfer RNA is highly unstable during early amino acid starvation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 45 (2), 793-804 (2017).
- Enriquez, J. A., Attardi, G. Evidence for aminoacylation-induced conformational changes in human mitochondrial tRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (16), 8300-8305 (1996).
- Parker, J. Errors and alternatives in reading the universal genetic code. Microbiol Rev. 53 (3), 273-298 (1989).
- Traxler, M. F., et al. The global, ppGpp-mediated stringent response to amino acid starvation in Escherichia coli. Mol Microbiol. 68 (5), 1128-1148 (2008).
- Zhong, J., et al. Transfer RNAs Mediate the Rapid Adaptation of Escherichia coli to Oxidative Stress. PLoS Genet. 11 (6), e1005302(2015).
- Kane, J. F. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli. Curr Opin Biotechnol. 6 (5), 494-500 (1995).
- Baca, A. M., Hol, W. G. Overcoming codon bias: a method for high-level overexpression of Plasmodium and other AT-rich parasite genes in Escherichia coli. Int J Parasitol. 30 (2), 113-118 (2000).
- Li, S., Pelka, H., Schulman, L. The anticodon and discriminator base are important for aminoacylation of Escherichia coli tRNA (Asn). J Biol Chem. 268 (24), 18335-18339 (1993).
- Rizzino, A. A., Freundlich, M. Estimation of in vivo aminoacylation by periodate oxidation: tRNA alterations and iodate inhibition. Anal Biochem. 66 (2), 446-449 (1975).
- Dittmar, K. A., Sorensen, M. A., Elf, J., Ehrenberg, M., Pan, T. Selective charging of tRNA isoacceptors induced by amino-acid starvation. EMBO Rep. 6 (2), 151-157 (2005).
- Zhou, K., et al. Novel reference genes for quantifying transcriptional responses of Escherichia coli to protein overexpression by quantitative PCR. BMC Mol Biol. 12 (1), 18(2011).
- Jacobson, A., Gillespie, D. Metabolic events occurring during recovery from prolonged glucose starvation in Escherichia coli. J Bacteriol. 95 (3), 1030-1039 (1968).
- McCarthy, B. The effects of magnesium starvation on the ribosome content of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta (BBA)-Specialized Section on Nucleic Acids and Related Subjects. 55 (6), 880-889 (1962).
- Zundel, M. A., Basturea, G. N., Deutscher, M. P. Initiation of ribosome degradation during starvation in Escherichia coli. Rna. 15 (5), 977-983 (2009).
- Piir, K., Paier, A., Liiv, A., Tenson, T., Maivali, U. Ribosome degradation in growing bacteria. EMBO Rep. 12 (5), 458-462 (2011).
- Schaechter, M., Maaloe, O., Kjeldgaard, N. O. Dependency on medium and temperature of cell size and chemical composition during balanced grown of Salmonella typhimurium. J Gen Microbiol. 19 (3), 592-606 (1958).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. J Bacteriol. 119 (3), 736-747 (1974).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold spring harbor laboratory press. (1989).
- Sorensen, M. A., Jensen, K. F., Pedersen, S. High concentrations of ppGpp decrease the RNA chain growth rate. Implications for protein synthesis and translational fidelity during amino acid starvation in Escherichia coli. J Mol Biol. 236 (2), 441-454 (1994).
- Tian, C., et al. Rapid Curtailing of the Stringent Response by Toxin-Antitoxin Module-Encoded mRNases. J Bacteriol. 198 (14), 1918-1926 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
