هنا نقدم طريقة لقياس مباشرة فرض مستويات من المنقي الإشريكيّة القولونية الجيش الملكي النيبالي، فضلا عن طريقة لمقارنة المستويات النسبية لنقل الجيش الملكي النيبالي، أو أي أخرى قصيرة الجيش الملكي النيبالي، عبر عينات مختلفة على أساس الإضافة للمصطلحات الخاصة في الجيش الملكي النيبالي نقل التعبير عن جين مرجع الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحديد الكمي للوفرة وفرض مستويات نقل الكشف في الإشريكيّة القولونية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نقل الجيش الملكي النيبالي (الحمض الريبي النووي النقال) جزء أساسي من إليه متعدية الجنسيات في أي كائن حي. ترنس ربط ونقل الأحماض الأمينية إلى الريبوسوم ترجمة. المستويات النسبية لمختلف ترنس، ونسبة أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال إلى إجمالي الحمض الريبي النووي النقال، المعروفة باسم مستوى الشحن، عوامل هامة في تحديد الدقة والسرعة في الترجمة. ولذلك، بوفرة ومستويات الشحن ترناس هي المتغيرات الهامة لقياس عند دراسة تخليق البروتين، على سبيل المثال تحت ظروف الإجهاد المختلفة. هنا، يمكننا وصف أسلوب الحصاد الحمض الريبي النووي النقال ومباشرة قياس الوفرة النسبية ومستوى الشحن المطلق لأنواع محددة من الحمض الريبي النووي النقال في الإشريكيّة القولونية. هو المقطوع الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طريقة أن يتم الاحتفاظ بالسندات مجا بين الحمض الريبي النووي النقال وبه الأحماض الأمينية. ثم يتعرض الجيش الملكي النيبالي لجل التفريد والشمالية النشاف، مما يؤدي إلى فصل ترناس التهمة الموجهة إليه ودون توجيه تهم لهم. يمكن مقارنة مستويات محددة ترنس في عينات مختلفة بسبب إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا للتطبيع. قبل تنقية الحمض النووي الريبي، يمكننا إضافة 5% خلايا كولاي التي أكثر الحمض الريبي النووي النقال نادرةسيلك لكل عينة. ثم هو تطبيع مقدار الفائدة في عينة وأنواع الحمض الريبي النووي النقال بمقدار الحمض الريبي النووي النقالسيلك في نفس العينة. إضافة المصطلحات الخاصة في الخلايا قبل تنقية الحمض النووي الريبي مزية على إضافة المنقي سبايك في الكشف بأنه يمثل أيضا أية فروق في كفاءة تحلل الخلية بين العينات.
المقدمة
في ما يلي، نقدم طريقة لتحديد كمية محددة ترناس وقياس فرض رسوم على المستويات من النشاف الشمالية. الأسلوب الذي يستند إلى تقنية وضعتها أولاً فارشنيي et al. 1-حصاد الخلايا إلى حمض التريكلوروسيتيك (TCA) وحفظ العينات في 0 درجة مئوية في جميع أنحاء تنقية الحمض النووي الريبي، هو السندات إستر بين الحمض الريبي النووي النقال والأحماض الأمينية المصانة2،،من34. ترنس أمينواسيلاتيد يمكن تمييز من نظرائهم نوناسيلاتيد هلام التفريد وشمال النشاف، يرجع إلى تنقل انخفض أمينواسيلاتيد الحمض الريبي النووي النقال في الهلام، الناجمة عن الأحماض الأمينية تساهمي ملزمة
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-التحضير للثقافات البكتيرية.
- تنمو جميع الثقافات في قوارير Erlenmeyer مع نسبة حجم ثقافة/قارورة من 1/6 على الأكثر. في إعداد نموذجي تجريبي، تنمو الثقافات في 37.0 درجة مئوية وتهز 160 لفة في الدقيقة في مورفولينيبروبانيسولفونيك الحمضية (والمماسح) الحد الأدنى المتوسط 18 تستكمل مع مصدر الكربون المفضل، على سبيل المثال الجلوكوز 0.2%، على الأقل من 10 أجيال متعاقبة قبل الحصاد الرنا.
- اليوم قبل موسم الحصاد في الجيش الملكي النيبالي، تضعف ثقافة المتضخمة من السلالة المرغوبة في الممسحات المتوسطة الدنيا في مثل هذه طريقة أنها ستصل إلى التطوير التنظيمي المطلوب 436 في الوقت المطلوب وفي اليوم التالي. حساب حجم الثقافة المتضخمة ﻻستخدام....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استخدام الإجراء الموصوفة هنا، الوفرة والشحن وقيست مستويات ترنس الثلاثة في K-12 كولاي قبل وأثناء المجاعة من الأحماض الأمينية.
سلالة أوكسوتروف ارجينين NF9154 (لوي thr supE44 mtl ثي argH له) كان نمت على الأقل عشرة أجيال والمماسح الحد الأدنى تستكمل مع والغليسيرول 0.4 في المائة، 50 ميكروغرام/مل ثريونين، لوسين، ارجينين، والحامض الأميني 5 ميكروغرام/مل عند 37 درجة مئوية تهتز في المديين المتوسط 1.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هذا البروتوكول ويصف كيفية قياس مستوى شحن محددة كولاي في نفس الوقت ترنس ومقارنة مستويات نسبية من ترنس في عينات مختلفة. النقاط الحرجة للبروتوكول 1) للتعامل مع العينات بطريقة أن تبقى مستويات الحمض الريبي النووي النقال مشحون الخلوية، 2) تطبيع كميات الحمض الريبي النووي النقال في مثل هذه طريقة أنه يمكن مقارنة مستويات الحمض الريبي النووي النقال النسبي في عينات مختلفة موثوق، و 3) ضمان sp اسيفيسيتي تحقيقات مختارة ترناس الفائدة. يتم تناول هذه النقاط على حدة أدناه.
تنقية الحمض الريبي النووي النقال<.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون ماريت وارير للمساعدة التقنية الممتازة. هذا العمل كان يدعمها "المجلس الدانمركي" "البحوث المستقلة" | العلوم الطبيعية [1323-00343B]، ومؤسسة البحوث الوطنية الدانمركية [DNRF120].
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اليوريا | ميرك | 57-13-6 | نقاء >99٪ |
| بولي أكريلاميد | سيرفا | 79-06-7 | |
| مكرر (N ، N'-Methylene-bis-acrylamide) | BIO-RAD | 161-0201 | |
| حمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) | سيجما | 76-03-9 | |
| فينول | ميرك | 108-95-2 | |
| IPTG | |||
| جلوكوز | |||
| أسيتات | |||
| EDTA | |||
| الإيثانول | |||
| تريس | |||
| حمض | |||
| كلوريد | |||
| NaH2PO4 | |||
| سترات | |||
| SDS | |||
| الرنجة المنوية الحمض النووي | Sigma | 100403-24-5 | |
| BSA | |||
| Polivinylpyrrolidone | |||
| Ficoll | |||
| P32 & gamma ؛ ATP | Perkin Elmer | ||
| DNA oligos (مجسات) | TAG كوبنهاغن | ||
| هايبوند N+< / sup> غشاء | GE Healthcare | RPN203B | |
| Crosslinker | |||
| Electroblotter | BIO-RAD | ||
| Typhoon FLA 7000 Scanner | GE Healthcare | 28955809 | |
| مقياس الطيف | |||
| الضوئي فرن | |||
| Geiger-M & uuml; ller أنبوب | |||
| الفوسفور شاشة | GE الرعاية الصحية | ||
| أنبوب التهجين | |||
| قوارير ثقافة قوارير | |||
| 1.5 مل أنابيب | |||
| الدقيقة 20 مل أنابيب | |||
| <قوية>الاسم< قوي> | <قوي>الشركة< / strong> | رقم الكتالوج < / strong > | التعليقات < / strong > |
| Software < / strong> | |||
| ImageQuant | GE الرعاية الصحية | ||
| Excel | Microsoft |
المراجع
- Varshney, U., Lee, C. -P., RajBhandary, U. L. Direct analysis of aminoacylation levels of tRNAs in vivo. Application to studying recognition of Escherichia coli initiator tRNA mutants by glutaminyl-tRNA synthetase. J Biol Chem. 266 (36), 24712-24718 (1991).
- Sorensen, M. A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
