Ca المتقدرية2 + الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca2 +--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

Wei Li; Chen Zhang; Xiulian Sun

doi:10.3791/56236

مقالة منهجية

Ca المتقدرية^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca^{2 +}--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

DOI:

10.3791/56236

⸱

مايو 1, 2018

Wei Li¹^,² , Chen Zhang¹ , Xiulian Sun³

¹Department of Neurology, Qilu Hospital of Shandong University, ²Department of Neurology, Qingdao Municipal Hospital, ³Brain Research Institute, Qilu Hospital of Shandong University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف طريقة لفحص Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}--أثارت الخلايا المتقدرية تورم في الميتوكوندريا المعزولة من ش SY5Y خطوة بخطوة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنتاج ATP من الفسفرة هي المهمة الرئيسية الميتوكوندريا. الميتوكوندريا في حقيقيات النوى أعلى أيضا المشاركة في سيتوسوليك Ca^{2 +}التخزين المؤقت، وإنتاج ATP في الميتوكوندريا يمكن أن توسط إينتراميتوتشوندريال Ca^{2 +} تركيز مجاناً. يمكن اعتبار Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة قدرة الميتوكوندريا على الاحتفاظ بالكالسيوم في مصفوفة المتقدرية. ووصف المتراكمة داخل الخلايا Ca^{2 +} يؤدي إلى نفاذية غشاء الميتوكوندريا الداخلية، افتتاح نفاذية المتقدرية الانتقال المسامية (mPTP)، مما يؤدي إلى تسرب جزيئات مع الجزيئية وزن أقل من 1.5 كاتشين. Ca^{2 +}--تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. هنا، يمكننا وصف فحوصات اثنين لدراسة Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة. بعد كميات معينة من Ca^{2 +} يتم إضافتها، يمكن الانتهاء في يوم واحد جميع الخطوات ومسجل من قبل قارئ ميكروسكوبية. وهكذا، يمكن اعتماد هذه اثنين من فحوصات بسيطة وفعالة لتقييم Ca^{2 +}-المتقدرية المهام ذات الصلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي الأجهزة الخلوية الرئيسية لإنتاج ما يقرب من 95 في المائة ATP تستخدمها الفسفرة في خلايا الثدييات. وأفيد أن يلتقيه micromolar تركيز Ca^{2 +} من الميتوكوندريا، ووجود ADP والفوسفات غير العضوية يمكن أن فوسفوريلاتي ADP إلى ATP توليف¹. عندما يذهب تركيز Ca سيتوسوليك^{2 +}عتبة، الميتوكوندريا يمكن امتصاص Ca^{2 +} سرعة وافلوكس ذلك ببطء. وهكذا، يمكن الميتوكوندريا الأداء تدفق زيادة سيتوسوليك Ca^{2 +}. لا صلة لها بالمشاركة في الفسفرة، كاليفورنيا المتقدرية^{2 +} أيضا المشاركة في إشارات الكالسيوم سيتوسوليك وتنشيط إليه apoptotic الميتوكوندريا بحمل فتح مبتب في الداخلية المتقدرية غشاء². وقد اعترف على نطاق واسع أن ارتفاع غير طبيعي في كاليفورنيا داخل الخلية^{2 +} يمكن أن تحدث تورم المتقدرية الضخمة عن طريق فتح مبتب³. وهكذا، وهذا البروتوكول يهدف إلى تقييم الوظيفة المتقدرية بقياس المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية.

Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات هو قياس قدرة الميتوكوندريا على امتصاص الكالسيوم سيتوسوليك. يمكن المخزن المؤقت الكالسيوم الحر سيتوسوليك الميتوكوندريا وتنظيم العمليات الخلوية المعتمدة على الكالسيوم عن طريق امتصاص الكالسيوم في شكل رواسب غير نشط. يحدث البصر Ca^{2 +} القدرة على الاحتفاظ في الإجهاد الظواهر المرتبطة بالحد من الطاقة والأعصاب حتى الأمراض⁴^،⁵. الميتوكوندريا المعزولة أو الخلايا بيرميبيليزيد ديجيتونين يمكن استخدامها لتحديد Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرة، وقدرة مرتفعة على تراكم Ca^{2 +}من الميتوكوندريا المعزولة مع غلوتامات الإضافي ومآلات لا يتم عزل المتقدرية الداخلي⁶. ينبغي استخدام كمية معاير من ديجيتونين بيرميبيليزي في الأغشية البلازمية من أنواع مختلفة من الخلايا. ملح هيكسابوتاسيوم Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء، Ca^{2 +}-خلية إيمبيرمينت الحساسة تظهر مؤشر الضوء منفعل، كانت تستخدم على نطاق واسع⁷. Ca^{2 +}-ملزمة الخضراء صبغة الفلورسنت هو مؤشر تقارب منخفضة وتستخدم لإظهار أن داخل الخلايا الحرة Ca^{2 +}تركيزات يواصل الارتفاع خلال فترات طويلة (5 دقائق) التحفيز⁸. هذا الأسلوب هو أقل حساسية من تقنية تصفية المشعة ولكن تم تبسيطها إلى حد كبير. Ca إضافية^{2 +}يرفع fluorescence الكالسيوم الأخضر وترجع Ca^{2 +}امتصاص الميتوكوندريا الأسفار لخط الأساس. وقدمت إضافات متتالية من Ca^{2 +} حتى الميتوكوندريا فشل في امتصاص اكستراميتوتشوندريال Ca^{2 +} ⁹. يمكن استخدام قارئ ميكروسكوبية الأسفار لتقرير الأسفار الكالسيوم الخضراء باستمرار.

بعد Ca^{2 +}تراكم، depolarized الميتوكوندريا، إصدار Ca^{2 +} في المتوسط، وبدأ الإنتفاخ. Ca^{2 +}--تسبب تورم يستخدم للإشارة إلى افتتاح mPTP الميتوكوندريا. المجهر الإلكتروني، والانخفاض في امتصاص الضوء في 540 نانومتر يمكن استخدامها لقياس Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية¹⁰^،¹¹. يمكن تحديد حجم الميتوكوندريا مباشرة بواسطة زاوية الأمام تشتت الضوء¹²، حيث تعكس انخفاض امتصاص سلبية تورم المتقدرية المصفوفة.

هنا، نحن توضيح المنهجية لدراسة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات و Ca^{2 +}-تسبب تورم المتقدرية في الميتوكوندريا المعزولة من الخلايا SH-SY5Y.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-عزل الميتوكوندريا

ملاحظة: جميع الحلول والمعدات ينبغي أن بريكوليد إلى 0-4 درجة مئوية وأبقى على الجليد.

البذور حوالي 3 × 10⁶ش-SY5Y الخلايا الواحدة 10 سم خلية الثقافة الطبق. تعديل الخلايا الثقافة في دولبيكو الجلوكوز عالية متوسطة النسر مع 10% مصل بقرى الجنين، البنسلين (100 U/mL)-ستربتوميسين (100 ميكروغرام/مل). الحفاظ على 37 درجة مئوية في حاضنة الذي يحتوي على 5% CO₂ بين عشية وضحاها.
ملاحظة: هناك حاجة على الأقل 1-2 × 10⁷ش-SY5Y الخلايا للمقايسة عزل كل.
إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع حوالي 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد في طبق ثقافة خلية 10 سم 3 مرات.
إضافة جديد 1 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في الطبق ثقافة الخلية 10 سم وكشط الخلايا ملتصقة في أنبوب 1.5 مل جديدة. أجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
أثناء الطرد المركزي، إعداد 5 مل العزلة المتقدرية المخزن المؤقت (250 ملم السكروز، 10 مم حبيس (حمض اثانيسولفونيك-(2-hydroxyethyl)-1-الببرازين 4)، 10 مم بوكل، 1.5 مم مجكل₂، يدتا 1 مم) وتستكمل مع 50 ميكروليتر من الأسهم مثبطات البروتياز الحل (100 x تركيز؛ 1 قرص خالية يدتا حله في 500 ميليلتر من ddH₂س).
إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه مع 1 مل من العزلة المتقدرية المخزن المؤقت. احتضان أنبوب 1.5 مل على الجليد لمدة 30 دقيقة.
الخلايا مع وقف التنفيذ مع الخالطون زجاج (15-25 السكتات الدماغية) صعودا وهبوطاً يدوياً على الجليد.
ملاحظة: تأكد من هناك لا فقاعات عندما يتم تجانس خلايا. حساب عدد الخلايا سليمة ونوى البارد بالمجهر بصريا، والتأكد من أن > حدث الكسر الخلية 90%.
نقل هوموجيناتي إلى أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية لإزالة الأنقاض (الأنوية والخلايا المتبقية سليمة).
نقل المادة طافية في أنبوب 1.5 مل الجديدة وأجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق 4 درجات مئوية.
نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد والطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 14,000 س ز 4 درجات مئوية.
إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه المحتوية على الميتوكوندريا مع 1 مل من العزلة المتقدرية المخزن المؤقت.
الطرد المركزي الحل لمدة 15 دقيقة في س 14,000 ز 4 درجة مئوية التعجيل في الميتوكوندريا.
بيليه الميتوكوندريا الناتجة عن ذلك يجب أن أبقى على الجليد وحراكه في 50-100 ميكروليتر بوكل الوسائط (125 ملم بوكل 2 مم ك₂هبو₄، 1 مم مجكل₂، 20 مم حبيس، غلوتامات 5 مم، مالات 5 مم، و 2 ميكرومتر والروتينون، درجة الحموضة 7.4) وفقا لحجم بيليه قبل أي الحمار المنعم يوسف.
استخدام 5 ميكروليتر من حل المتقدرية لقياس تركيز البروتين المتقدرية بمقايسة اتفاق التعاون الأساسي القياسية، قياس OD562 باستخدام قارئ لوحة¹³.

2. تحديد قدرة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ

تحضير الوسائط بوكل وإضافة Ca^{2 +}-ربط صبغة الفلورسنت الخضراء إلى تركيز 0.5 ميكرومتر قبل التجربة الأخيرة.
نقل 1 مل الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ/مل) في بوكل الوسائط التي تحتوي على 0.5 ميكرومتر Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء في كل لوحة 6-جيدا جيدا.
احتضان الميتوكوندريا و Ca^{2 +}-ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء في لوحة 6-جيدا في درجة حرارة الغرفة محمية من الضوء المحيط لمختبرين ميكروليتر 4 إضافة 1 كحد أدنى من 20 مم كاكل₂ الحل (20 مم كاكل₂، 127 مم بوكل، 1 مم مجكل₂ ، 20 مم حبيس، غلوتامات 5 مم، ومآلات 5 ملم، ودرجة الحموضة 7.4) لكل لوحة 6-جيدا جيدا باستخدام التلقائي الاستغناء عن الإعداد لإدخال 200 نمول Ca^{2 +}المتقدرية/mg بروتين.
استخدم مطياف الأسفار رصد التغيرات الأسفار كل 3 ثانية لمدة 2 دقيقة مع الطول موجي إثارة من 506 شمال البحر الأبيض المتوسط وطول موجي انبعاثات من 531 شمال البحر الأبيض المتوسط. اللوحة مجهز بالهز 600 لفة في الدقيقة ل 3 s بين القراءات التي تسيطر عليها البرمجيات (الشكل 1).
إضافة قاسمة ميكروليتر 4 إضافية من عيار 20 ملم كاكل₂ الحل لكل بئر ورصد التغييرات الأسفار كل 3 s للحد الأدنى 2 كرر هذه الخطوة حتى الأسفار يزداد مع الوقت.
ملاحظة: يتم تحدي الميتوكوندريا مع إضافة Ca^{2 +}المؤشرة fluorescence تسجيل زيادة. عندما يفتح مبتب، يزيد الأسفار مع مرور الوقت.
تفسير المبلغ الإجمالي من Ca^{2 +} إضافة حتى يفتح مبتب ك Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة.

3-تحديد Ca ^{2 +}-الناجم عن تورم المتقدرية

تعد وسائل الإعلام بوكل قبل التجربة.
1. نقل 1 مل الميتوكوندريا المعزولة (0.4 ملغ/مل) في وسائل الإعلام بوكل في كل لوحة 6-جيدا جيدا.
إضافة 10 ميكروليتر من عيار 20 ملم كاكل₂ محلول مائي (500 مغ/نمول المتقدرية بروتين) في البروتين تؤدي إلى تورم المتقدرية mitochondrial.
تسجيل الانخفاض في امتصاص في 540 نانومتر كل 3 s على قارئ ميكروسكوبية التي تسيطر عليها برامج لمدة 10 دقائق (الشكل 2). بسبب التغييرات fluorescence تدفق الذوائب عبر الغشاء الداخلي المتقدرية.
ملاحظة: انخفاض امتصاص في 540 نانومتر يناظر الميتوكوندريا منتفخة. إذا كان القارئ لا نلاحظ انخفاض في امتصاص، يمكن اعتماد القراءة فاصل زمني أطول أو وقت القراءة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النتائج ممثلة Ca^{2 +} الاحتفاظ بالقدرة على:
وأعرب عن النتائج كقيم الأسفار. مع البقول إضافية من Ca^{2 +} (بروتين نمولس/mg 200 mitochondrial) الأسفار زيادة مزدوجة فوق خط الأساس مع افتتاح مبتب. 5 ميكرومترات بونجكريكاتي (BKA)، المانع من Ca^{2 +}-الناجم عن فتح مبتب، أو أتراكتيلوسيدي 1 ميكرومتر (ATR)، منشط من Ca^{2 +}-الناجم عن فتح مبتب، وأضيفت في الميتوكوندريا المعزولة. المبلغ الإجمالي المضافة Ca^{2 +} حتى افتتاح mPTP أشارت إلى زيادة مزدوجة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة المتقدرية Ca^{2 +} الاحتفاظ بقدرة التحليل و Ca^{2 +}-أثارت المقايسة تورم المتقدرية.

لعزل المتقدرية، تأكد من أن جميع المواد وأنابيب يتم على الجليد، لا سيما عند المجانسة الخلايا. 0.25% التربسين-يدتا يمكن أن تستخدم أيضا لفصل الخلايا من الطبق لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد 15-25 من السكتات الدماغية، من الضروري مراقبة سليمة غشاء الخلية تحت المجهر، وتجنب الكسر للغشاء الميتوكوندريا. ولكن الميتوكوندريا المعزولة التي حصلنا عليها الميتوكوندريا ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عاشرا – الشمس الإشراف على التجارب. لي وي إجراء التجارب. تشانغ تشن وعاشرا الشمس كتب الورق.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة المنح من المنح "المعلقة من عالم شاندونغ" (JQ201421) ومنحة من تشرف (81371226).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
خط الخلية SH-SY5Y	ATCC (المركز العالمي للموارد الحيوية)	رقم ATCC: CRL-2266
الكالسيوم الأخضر -5N	Life Technologies	c-3737	Ca^{2 + < / sup> ملزمة صبغة الفلورسنت الخضراء}
مثبطات البروتياز الكاملة	Roche Molecular Biochemicals	4693116001
الخالط الزجاجي	Kimble Chase	9885303002
الغلوتامات	سيجما ألدريتش	RES5063G-A7
مالات	سيجما ألدريتش	46940-U
روتينون	سيجما ألدريتش	R8875
هيبس	سيجما ألدريتش	H3375
MgCl _{2< / sub>}	Sigma-Aldrich	00457
K_{2< / sub>HPO_{4< / sub>}}	Sigma-Aldrich	V900050
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
CaCl₂	Sigma-Aldrich	V900266
Varioskan أدوات فلاش	Thermo Scientific	IC100E
Bongkrekate	Biovision	1820-100
atractyloside	Sigma-Aldrich	C4992
Dulbecco عالي الجلوكوز s النسر المتوسط المعدل	Hyclone	SH30022	4.5 جم / لتر جلوكوز ، L-الجلوتامين ، بدون مصل الأبقار الجنيني بيروفات الصوديوم
	Hyclone	SV30087
البنسلين	Sigma-Aldrich	P3032
Streptomycin	Invitrogen	11860-038
مجموعة فحص BCA	Thermo Scientific	NCI3225CH
PBS	Hyclone	SH30256.01
طبق زراعة الخلايا 10 سم	NEST	704001

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rossi, C. S., Lehninger, A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).
Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).
Crofts, A. R., Chappell, J. B. Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling. Biochem J. 95, 387-392 (1965).
Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. Calcium ions in neuronal degeneration. IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).
Celsi, F., et al. Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration. Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).
Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).
Rajdev, S., Reynolds, I. J. Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons. Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).
Stout, A. K., Reynolds, I. J. High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations. Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).
Bambrick, L. L., et al. Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons. J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).
Zhao, K., et al. Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury. J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).
Muriel, M. P., et al. Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death. J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).
Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure. Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).
Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).
Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A. Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).
Pastorino, J. G., et al. Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore. J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).
Gunter, T. E., Sheu, S. S. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

Ca المتقدرية^{2 +} الاحتفاظ بالقدرات المقايسة و Ca^{2 +}--تسبب تورم المتقدرية الإنزيم

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة