مقالة منهجية

البناء وتقييم نموذج عظام النهايات كالفاريال مورين بالتعرض للجسيمات كوكرمو في تخفيف العقيم

8.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56276

⸱

فبراير 17, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Jinling Hospital, School of Medicine, Nanjing University, 2Center for Translational Medicine, Nanjing University Medical School, 3Jiangsu Key Laboratory for Molecular Medicine, Nanjing University Medical School

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذه المخطوطة نموذج عظام النهايات كالفاريال مورين بالتعرض للجسيمات كوكرمو، الذي يشكل نموذجا حيوان مثالي لتقييم التفاعلات بين الجسيمات البلى وخلايا مختلفة في تخفيف العقيم.

الملخص

عظام النهايات الناجمة عن الجسيمات ارتداء سببا رئيسيا لتخفيف العقيم في تقويم مفاصل الفشل، ولكن الآلية الأساسية التي لا تزال غير واضحة. سبب طويلة المتابعات اللازمة للكشف وحدوث متفرقة، أنه يمثل تحديا لتقييم المرضية الناجمة عن أوفبارتيكلي عظام النهايات في الحالات السريرية. ومن ثم فالنماذج الحيوانية المثلى المطلوبة لإجراء المزيد من الدراسات. نموذج عظام النهايات كالفاريال المنشأة بالتعرض للجسيمات كوكرمو مورين أداة فعالة وصالحة لتقييم التفاعلات بين الجزيئات والخلايا المختلفة في تخفيف العقيم. في هذا النموذج، التي حصل عليها التيار المباشر ثلاث قطب كهربائي عالية الفراغ جسيمات كوكرمو أولاً وحراكه في مخزنة الفوسفات المحلول الملحي بتركيز 50 ملغ/مل. ثم طبقت منتصف كالفاريا موريني 50 ميليلتر من تعليق الناتجة بعد فصل السمحاق الجمجمة بحادة تسلخ. وبعد أسبوعين، كانت التضحية بالفئران، وكانت تحصد كالفاريا العينات؛ وأجريت التقييمات الكمية والنوعية التي توضع وتلطيخ ويوزين والجزئي المقطعي. وتشمل مواطن القوة في هذا النموذج البساطة الداخلي، والتقييم الكمي لفقدان العظام، وسرعة التنمية عظام النهايات والاستخدام المحتمل المحورة وراثيا أو نماذج بالضربة القاضية، وتكلفة منخفضة نسبيا. ومع ذلك، لا يمكن هذا النموذج التي ستستخدم لتقييم القوة الميكانيكية والآثار المزمنة للجسيمات في تخفيف العقيم. نموذج عظام النهايات كالفاريال مورين الناتجة عن التعرض للجسيمات كوكرمو أداة مثالية لتقييم التفاعلات بين الجسيمات ملابس ومختلف الخلايا، مثلاً، الضامة، الليفية، وخلايا الاوستيوبلاستس والأكلة، في تخفيف العقيم.

المقدمة

تخفيف العقيم هو السبب الأكثر شيوعاً لتقويم مفاصل الورك الكلي (ثا) والفشل (تكا) تقويم مفاصل الركبة، الأمر الذي يتطلب مراجعة الجراحة1. ومع ذلك، لا تزال إليه الكامنة غير واضح2. مطلوب متابعة طويلة لاكتشاف عظام النهايات الناجمة عن الجسيمات، التي حدوث أمر نادر الحدوث؛ ولذلك فإنه يمثل تحديا لاستكشاف ما المرضية في الحالات السريرية. ومن ثم تتطلب المزيد من الدراسات التي تركز على آليات معقدة من الخلايا والأنسجة وكل التجارب في فيفو في ارتداء نماذج عظام النهايات الناجمة عن الجسيمات وفحوصات في المختبر في الخلايا المتصلة بالعظام التوازن3. نموذج حيوانية صالحة المهم في الكشف عن آثار الجسيمات ملابس على فقدان العظام، تقديم أدلة للهاتف الخلوي فحوصات إضافية.

نموذج عظام النهايات كالفاريال موريني شيدت قبل التعرض للجسيمات كوكرمو طريقة فعالة وصالحة لتقييم التفاعلات بين الجزيئات والخلايا المختلفة في تخفيف العقيم. في هذا النموذج، تسبب الجسيمات كوكرمو كالفاريال عظام النهايات بتحريض السيتوكينات الالتهابية في الضامة وتفعيل الآكلة، ويحول دون انتشار osteoblast وتعزيز osteoblast المبرمج.

إلا أنها تستغرق أسبوعين لإقامة هذا النموذج. يمكن تصور عظام النهايات والكمية التي توضع وتلطيخ (H & E) ويوزين والصغير يحسب التصوير المقطعي (الصغرى-CT)2. وبالإضافة إلى ذلك، أن هذا النموذج قد ماوس نسبيا منخفضة التكلفة، ومحوره وراثيا والضربة القاضية نماذج يمكن استخدامها لفحص عدد كبير من المركبات في مختلف الجرعات3.

إجراءات إنشاء وتقييم هذا النموذج بسيط. أولاً، كانت الجسيمات كوكرمو التي حصل عليها التيار المباشر ثلاث قطب كهربائي عالية-الفراغ وحراكه في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بتركيز 50 ملغ/مل. ثم طبقت منتصف كالفاريا مورين 50 ميليلتر من تعليق الناتجة بعد فصل السمحاق الجمجمة بحادة تسلخ. كانت التضحية الفئران بعد أسبوعين، وكانت تحصد كالفاريا العينات؛ أجريت التحاليل النوعية والكمية التي ح & ه تلطيخ أندميكرو-قيراط

نموذج عظام النهايات كالفاريال مورين التي شيدت قبل التعرض للجسيمات كوكرمو أداة مثالية لتقييم التفاعلات بين الجسيمات كوكرمو وخلايا مختلفة، مثل الضامة والخلايا الليفية، وخلايا الاوستيوبلاستس والأكلة، في تخفيف العقيم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة نانجينغ.

1. إعداد الجسيمات كوكرمو

  1. الحصول على جسيمات كوكرمو باستخدام تيار المباشر ثلاث قطب كهربائي عالية-فراغ ملفقة4. سبيكة "كوكرمو مكان" في الصك تحت فراغ السلطة الفلسطينية-3 10، 0.04 الأرجون الآلام والكروب الذهنية والهيدروجين 3:2 (v/v)، و 650 ألف الكاثود الحالية.
  2. قياس أقطار جسيمات كوكرمو.
    1. أضف 1 مغ جسيمات كوكرمو إلى 1.5 مل إيثانول اللامائى.
    2. ريسوسبيند جسيمات كوكرمو في الإيثانول اللامائى اهتزاز الموجات فوق الصوتية في 28 كيلو هرتز و 600 واط لمدة 5 دقائق.
    3. تطبيق قطره واحدة (حوالي 20 ميليلتر) تعليق الناتجة في الجدول الهدف من انتقال الإلكترون المجهر (TEM). التقاط سلسلة من الصور ال 200 كيلو فولت تسريع الجهد و 0.24 نانومتر القرار.
    4. استخدام البرامج المتوفرة لحساب توزيع حجم الجسيمات وقطرها يعني في تيم ميكروجرافس.
  3. تطهير اندوتوكسينس
    1. اﻷوتوكﻻف 50 جرام جسيمات لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية و 15 رطل/بوصة مربعة.
    2. الكشف عن اندوتوكسينس قبل مقايسة ليمولوس أميبوسيتي ليستي (ال) كمية (< 0.25% واعتبر الاتحاد الأوروبي/مل للإشارة إلى غياب الذيفان)5.
  4. ريسوسبيند الجسيمات في مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) بتركيز 50 ملغ/مل كحل الأسهم6.

2-بناء نموذج عظام النهايات كالفاريال

  1. تخدير 6 الأسبوع القديمة C57BL/j6 إلى الفئران (ستة الفئران في كل مجموعة) ويثبينتوباربيتال (50 مغ/كغ). استخدم اختبار قرصه لتقييم مستوى التخدير. منع جفاف العينين مع المحلول الملحي العادي.
  2. وضع الفئران في موقف المعرضة. إزالة الفراء على الجمجمة مع آلة حلاقة وتطهير الجلد باستخدام كرات القطن الطبي الذي يحتوي على الإيثانول 75%.
  3. للتعريب نقطة، تحديد نقطتين، بما في ذلك نقاط في المنتصف بين اثنين من عيون وآذان، على التوالي. تحديد الخط الفاصل بين اثنين النقاط المذكورة أعلاه، ثم جداً الجلد على طول الخط المذكور أعلاه مع المقص (الشكل 1A).
  4. إزالة سمحاق الجمجمة من كالفاريا مع مشرط (الشكل 1B)6.
  5. خياطة الجلد في كلا طرفي مع خياطة توقف بسيطة.
  6. جعل خط خياطة خلال منتصف الشق دون الغزل. أمسك طرفي خط خياطة الجروح.
  7. تضمين 50 ميليلتر من تعليق الجسيمات كوكرمو (50 ملغ/مل، في برنامج تلفزيوني) في وسط كالفارياس (الشكل 1)2.
  8. عقده غرزة الماضي داخل خياطة توقف بسيطة (الشكل 1).
  9. الحفاظ على الفئران لمدة أسبوعين 2.

3-التقييم النموذجي كالفاريال عظام النهايات الصغرى-ط م المسح الضوئي

  1. التضحية الفئران مع ثاني أكسيد الكربون. قطع رأس الفئران في الطائرة الأفقي. إزالة أنسجة المخ داخل، والجلد والفراء خارج. حصاد كالفارياس لإجراء مزيد من التجارب.
  2. بلطف تطهير جميع الأنسجة اللينة في كالفاريا مع ملاقط. إصلاح كالفارياس تم مسحها في بارافورمالدهيد 4% في 4 درجات مئوية عن 24 h. تزج كالفارياس في برنامج تلفزيوني 24 ح قبل الصغرى-ط م المسح الضوئي.
  3. تحليل كالفارياس الفئران المقطعية الصغرى ذات الدقة العالية في حل متساوي القياس من 18 ميكرون وإعدادات الطاقة الأشعة السينية من 45 كيلو فولت و 550 اماه.
  4. القيام بالتعمير ثلاثية الأبعاد للبيانات المقطعية الصغرى مع البرنامج.
  5. التحليل الكمي والنوعي.
    1. أولاً، حدد منطقة مربعة حول خياطة خط الوسط كالمنطقة للفائدة.
    2. وثانيا، قياس كثافة المعادن في العظام (BMD)، والعظام إلى مجموع حجم وحدة التخزين (BV والتلفزيون) وعدد ترابيكولار (Tb.N) وسمك ترابيكولار (Tb.Th)، ترابيكولار الفصل/التباعد (Tb.Sp) والنسبة المئوية لمجموع المسامية مع البرامج المقدمة للصغير-قيراط
    3. وثالثاً، مقارنة ثلاث مجموعات لقياسات مختلفة بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه. بالنسبة المخصصة بعد تحليل التباين، تطبيق الأسلوب بونفيروني2.

4-تقييم نموذج عظام النهايات كالفاريال تلطيخ ح & ه

  1. ديكالسيفي كالفاريا عينات في 15% الإثيلين diamine حمض tetraacetic (يدتا)-برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. تغيير الحل ديكالسيفيكيشن كل يوم لمدة 3 أسابيع.
  2. تضمين نماذج ديكالسيفيد في البارافين 2 سم × 1 سم × 1 سم مكعب، وشريحة منهم إلى 2 ميكرومتر مقاطع في المنطقة ترسب الجسيمات.
  3. وصمة عار الأقسام مع توضع وكما سبق ذكره ثم7.
  4. التقاط ميكروجرافس باثومورفيسم عموما بالفحص المجهري الخفيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كانت الجسيمات كوكرمو النانو المنتجة داخليا حوالي 50 نانومتر (الخطأ المعياري ل 3.56) في القطر، كما كمياً بال (الشكل 2). بعد التعرض للماوس كالفارياس للجسيمات كوكرمو، الحيوانات (n = 6 كل مجموعة) واستمرت لمدة أسبوعين. خلال الأسبوعين الماضيين، شق كالفاريال وقد شفيت تماما، وقد تقع خياطة الجروح. أي عدوى محلية أو نقابية أيار يؤثر على تقييم فقدان العظام. بعد التضحية بالماوس، كانت تحصد عينات كالفاريا. ثم بلطف تطهير جميع الأنسجة اللينة، واستخدمت الأشعة المقطعية الصغرى ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هناك طريقتان الرئيسي لارتداء الناجمة عن الجسيمات عظام النهايات في الفئران: عظام النهايات كالفاريال ونموذج الهواء-الحقيبة. في طراز إير-الحقيبة، المنشأة جوية-حقيبة التي تم إنشاؤها تحت الجلد هو أولاً، متبوعاً بارتداء الجسيمات مقدمة وغرس في أنسجة العظام8. يحاكي الجدار الحقيبة السمحاق في تخفيف العقيم. ومع ذلك، غرس العظام نونفاسكولار مع لا النشاط البيولوجي، مما يجعل من الصعب تقييم التفاعل المباشر بين الجسيمات ونسيج العظام. نموذج عظام النهايات كالفاريال مزايا عديدة على نظيره الجوية-الحقيبة. أولاً، والجسي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

هذه الدراسة كانت تدعمها مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (81572111) والعلوم الطبية والتكنولوجيا مشروع مؤسسة من مقاطعة جيانغسو (BL2012002)، مشروع البحوث العلمية نانجينغ (201402007)، العلوم الطبيعية مؤسسة من مقاطعة جيانغسو (BK20161385)، ومؤسسة خاصة من الرابطة الصينية طبيب (2015COS0810).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
سبيكة CoCrMo من الطرف الاصطناعيWaldemar Link GmbH & CoGEMINI MK IIالمواد الخام للحصول على الجسيمات النانوية CoCrMo
المصنعة عالية الفراغ ثلاثية الأقطاب الكهربائية التيار المباشركلية علوم المواد & الهندسة ، جامعة نانجينغ للتكنولوجياآلة مصممة ذاتيا
6 أسابيع ذكر C57BL / 6J الفئراننموذج مركز أبحاث بجامعة نانجينغN000013
100 ٪ الإيثانولنانجينغ كاشفC0691514023مذيب الجسيمات النانوية CoCrMo لمسح المجهر الإلكتروني
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةTaizhou Weierkang Medical Supplies Co.، LTDW603
الميزان التحليلي الجزئيشنتشن تشون طويلة أداة المعدات المحدودة،. LTDEX125DZH
شاكر بالموجات فوق الصوتيةشنغهاي Yuhao الصك العلمي المحدودةYH-200DHلتعليق الجسيمات النانوية CoCrMo
نقل المجهر الإلكترونيFEITecnai G20
SimplePCI softwareCompix Inc.6.6 الإصدارلحساب متوسط القطر وتوزيع حجم الجسيمات.
عموم التعقيماليد QIULONGYIQIKYQL-100DSلتطهير السموم الداخلية
Limulus Amebocyte Lysate (LAL) فحصنهر تشارلزR13025للكشف عن السموم الداخلية   ؛
15 مل أنابيب الطرد المركزيTaizhou Suyi MedicalB122
محلول ملحي مخزن بالفوسفاتBoster التكنولوجيا البيولوجيةAR0030مذيب من محلول مخزون الجسيمات النانوية CoCrMo
Pentobarbital SodiumSigmaP3761لتخدير الفئران
محلول ملحي عاديساكلرSR8572EP-15لمنع جفاف عيون الفئران
75٪ إيثانولكاشف نانجينغC0691560275تطهير
كرة قطنيةطبية Shuitao1278298933تطهير
ماكينة حلاقةKemeiKM-3018لحلاقة الفراء
مقصRWD LIFE SCIENCES12005-10لشق الجلد
خياطةRWD LIFE SCIENCEF34001-01لخياطة الجلد
حامل إبرةRWD LIFE SCIENCEF33001-01لخياطة
إبرةRWD LIFE SCIENCER14003-12لخياطة الجلد
ملقط الوعاءRWD LIFE SCIENCEF22003-09لخياطة الجلد
مشرطRWD LIFE SCIENCES31010-01لحصاد ملاقط كالفاريا
RWD LIFE SCIENCEF12006-10لحصاد كالفاريا
100 & micro ؛ L الماصاتEppendorf3120000240لتضمين تعليق الجسيمات في calvatias
100 & micro; L نصائح الماصةAXYGENT-200-Yلتضمين تعليق الجسيمات في calvatias
5 مل MicrotubesTaizhou Weierkang Medical Supplies co.، LTDW621
4٪ ParaformaldehydeServicebioG1101تثبيت
التصوير المقطعي المحوسب الجزئي   ؛SkyScanSkyScan1176
خدمة حمض رباعي الأسيتيك ثنائي الإيثيلينBioG1105إزالة الكلس
البارافينbio# 0001
آلة تقطيع البارافينLeicaRM2125RTS
شريحة زجاجيةServicebioG6004
غطاء زجاجيServicebio200
طقم تلطيخ HEServicebio# 1-5HE تلطيخ
مجهر خفيفنيكونE200
عالي الدقيقة الجلد خدمة

المراجع

  1. Dong, L., et al. Antisense oligonucleotide targeting TNF-alpha can suppress Co-Cr-Mo particle-induced osteolysis. J Orthop Res. 26 (8), 1114-1120 (2008).
  2. Deng, Z., et al. SIRT1 protects osteoblasts against particle-induced inflammatory responses and apoptosis in aseptic prosthesis loosening. Acta Biomater. 49, 541-554 (2017).
  3. Langlois, J., Hamadouche, M. New animal models of wear-particle osteolysis. Int Orthop. 35 (2), 245-251 (2011).
  4. Wang, P., Zhao, F. X., Zhang, Z. Z. Preparation of ultrafine zinc powders by DC arc plasma evaporation method. Chinese Journal of Nonferrous Metals. 21 (9), 2236-2241 (2011).
  5. Wang, Z., et al. The fibroblast expression of RANKL in CoCrMo-particle-induced osteolysis is mediated by ER stress and XBP1s. Acta Biomater. 24, 352-360 (2015).
  6. Wang, Z., et al. Autophagy mediated CoCrMo particle-induced peri-implant osteolysis by promoting osteoblast apoptosis. Autophagy. 11 (12), 2358-2369 (2015).
  7. Wang, R., et al. Particle-induced osteolysis mediated by endoplasmic reticulum stress in prosthesis loosening. Biomaterials. 34 (11), 2611-2623 (2013).
  8. Yang, S. Y., et al. Adeno-associated virus-mediated osteoprotegerin gene transfer protects against particulate polyethylene-induced osteolysis in a murine model. Arthritis Rheum. 46 (9), 2514-2523 (2002).
  9. Liu, N., et al. Autophagy mediated TiAl(6)V(4) particle-induced peri-implant osteolysis by promoting expression of TNF-alpha. Biochem Biophys Res Commun. 473 (1), 133-139 (2016).
  10. Wang, Z., et al. ER Stress Mediates TiAl6V4 Particle-Induced Peri-Implant Osteolysis by Promoting RANKL Expression in Fibroblasts. PLoS One. 10 (9), e0137774(2015).
  11. Wang, Z., et al. TiAl6V4 particles promote osteoclast formation via autophagy-mediated downregulation of interferon-beta in osteocytes. Acta Biomater. 48, 489-498 (2017).
  12. Chen, S., et al. Lycorine suppresses RANKL-induced osteoclastogenesis in vitro and prevents ovariectomy-induced osteoporosis and titanium particle-induced osteolysis in vivo. Sci Rep. 5, 12853(2015).
  13. Neuerburg, C., et al. The role of calcitonin receptor signalling in polyethylene particle-induced osteolysis. Acta Biomater. 14, 125-132 (2015).
  14. Catelas, I., Jacobs, J. J. Biologic activity of wear particles. Instr Course Lect. 59, 3-16 (2010).
  15. Liu, A., et al. The biological response to nanometre-sized polymer particles. Acta Biomater. 23, 38-51 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة