يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران

17.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56301

⸱

نوفمبر 22, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Gerontology, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology - Hellas, 3Center for Molecular Medicine, National Heart Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 4Laboratory of Neurosciences, National Institute on Aging, National Institutes of Health, 5Nuffield Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Oxford, 6Department of Clinical Molecular Biology, University of Oslo and Akershus University Hospital, 7Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 8Danish Center for Healthy Aging, University of Copenhagen

في هذه المقالة

ملخص

ميتوفاجي، عملية إزالة تلف الميتوكوندريا، أمر ضروري لصيانة التوازن والصحة المتقدرية. تقدم هذه المقالة بعض ميتوفاجي أحدث أساليب الكشف في الخلايا البشرية، ايليجانس كاينورهابديتيسوالفئران.

الملخص

الميتوكوندريا هي القوى للخلايا وإنتاج الطاقة الخلوية على شكل ATP. ويسهم خلل mitochondrial الشيخوخة البيولوجية ومجموعة متنوعة من الاضطرابات بما في ذلك الأمراض الأيضية ومتلازمات الشيخوخة المبكرة وأمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD). المحافظة على الصحة المتقدرية يتوقف على نشوء حيوي mitochondrial وتطهير كفاءة الميتوكوندريا المختلة وظيفيا من خلال ميتوفاجي. وقد تم تحدي الأساليب التجريبية لدقة الكشف عن أوتوفاجي/ميتوفاجي، لا سيما في نماذج حيوانية، لتطوير. وقد مكن التقدم المحرز مؤخرا نحو فهم الآليات الجزيئية ميتوفاجي تطوير تقنيات الكشف عن ميتوفاجي الرواية. وهنا، نحن نقدم عدة تقنيات متعددة لرصد ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس كاينورهابديتيس (مثلاً، روزيللا وسلالات DCT-1/1 لج)، والفئران (طن متري-كيما). سيتم تحسين دقة القياسات ميتوفاجي توليفة من هذه التقنيات الكشف عن ميتوفاجي، بما في ذلك تقييم الأنواع الصليب، ويؤدي إلى فهم أفضل لدور ميتوفاجي في الصحة والمرض.

المقدمة

ميتوفاجي ضروري لصيانة المتقدرية. الميتوكوندريا تتقاطع مع خلية متعددة مما يشير إلى مسارات وهي العضيات الخلوية الفرعية العالمية المسؤولة عن إنتاج الطاقة الخلوية واستقلاب الخلية، والكالسيوم التوازن1،2،3، 4-الميتوكوندريا باستمرار تجربة التحديات من مصادر داخلية وخارجية، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) وسميات المتقدرية، على التوالي، مما يؤدي إلى توليد الميتوكوندريا "المسنين" والمختلة وظيفيا. تراكم من الميتوكوندريا التالفة يقلل من كفاءة إنتاج ATP مع زيادة مقدار روس الضارة، وارتبط بالأمراض المرتبطة بالسن مثل الأمراض الأيضية، والإعلانات، وشعبة المشتريات1،5،6 . لمنع حدوث خلل الميتوكوندريا التي يسببها الخلوي، وصف الخلايا ضرورة الاعتراف على وجه التحديد تلف الميتوكوندريا وكفاءة إزالتها من خلال عملية خلوية أوتوفاجي الميتوكوندريا (ميتوفاجي). وهذا يدل على أهمية ميتوفاجي في الصحة والمرض يوضح الحاجة إلى أساليب دقيقة وفعالة للكشف عن ميتوفاجي في المختبر و في فيفوعلى حد سواء.

ميتوفاجي عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على كثير من البروتينات والبروتين المجمعات5،،من78. باختصار، أولاً ميتوكندريا تالفة معترف به وغارقة فاجوفوري ميمبرانيد مزدوجة، التي يمكن أن تنشأ من غشاء البلازما أو هيولى، مجمع غولجي، نواة، أو ميتوكندريا نفسها9،10. فاجوفوري كروية الغضروفي والأختام في نهاية المطاف الميتوكوندريا الداخل، التي تشكل أوتوفاجوسومي الميتوكوندريا (ميتوفاجوسومي). ثم الصمامات ميتوفاجوسومي مع يحلول للتدهور، تشكل أوتوليسوسومي التي يكون فيها ميتوكندريا التالفة المتدهورة وإعادة تدويرها7،8. تشمل البروتينات أوتوفاجيك الرئيسية أيضا المشاركة في ميتوفاجي: أوتوفاجي 7 ذات الصلة (ATG7) و Beclin1 (بدء)، "البروتين ميكروتوبولياسوسياتيد" 1A/1B-الضوء سلسلة 3 (LC3 II) (1 لج في العجان جيم-s) و p62 (مكونات فاجوفوري)، و غشاء الليزوزومية المرتبطة بروتين سكري 2 (LAMP2)6،7. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدة بروتينات أساسية فريدة من نوعها إلى ميتوفاجي، بما في ذلك 1 كيناز المفترضة التي يسببها فتن (الوردي-1)، Parkin1، كاتشين النووية دوت البروتين 52 (NDP52)، أوبتينيورين، BCL2 التفاعل البروتين 3 مثل (نيكس/BNIP3L) (DCT-1 في C. ايليجانس)، بينها5،،من611.

أسلوب شائع لكشف التغيرات في مستويات أوتوفاجي بنسبة LC3-ثانيا/LC3-أنا أو LC3-ثانيا/أكتين. ومع ذلك، هذا الأسلوب غير محدد، كما قد تعكس زيادة في نسبة هذا التكريس زيادة أو انصهار البصر من ميتوفاجوسومي إلى يحلول12. هو أسلوب آخر لتقييم كولوكاليزيشن بين علامة أوتوفاجي (مثلاً، LC3) وبروتين المتقدرية (مثلاً، ترانسلوكاسي من الخارجي Mitochondrial غشاء 20 (TOMM20، التي يمكن أن تكون قد أفسدتها proteasomes)). ومع ذلك، هذا يمكن أن تشير فقط إلى التغيرات في مستويات إجمالي ميتوفاجي ولا يمكن التمييز درجات في الانسداد الذي يحدث. ويمكن توضيح ذلك باستخدام مثبطات الليزوزومية (مثلاً، E64d + بيبستاتين أ، يطلق عليها الجيش الشعبي) بالتوازي ليسبب تراكم ميتوفاجوسوميس. يمكن الإشارة إلى الفرق بين عدد ميتوفاجوسوميس في الأساس وعدد ميتوفاجوسوميس بعد العلاج مع الجيش الشعبي ميتوفاجي. وأدت هذه القيود على تطوير تقنيات الكشف عن ميتوفاجي الرواية. ونظرا للأهمية المتزايدة ميتوفاجي في طائفة واسعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، فإننا نقدم عدة تقنيات الكشف ميتوفاجي القوية التي قد تكون مفيدة للباحثين. تشمل التقنيات على حد سواء في المختبر و في فيفو ونوصي بالجمع بين عدة تقنيات للتحقق من التغييرات في ميتوفاجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الحيوانات (الفئران الذكور والإناث) قد ولدوا وتربوا في منشأة حيوان المعتمدين، وفقا وموافقة "لجنة الاستخدام" و "المعاهد الوطنية للصحة الحيوانية العناية". أساليب القتل الرحيم يجب أن تكون متسقة مع جميع الأنظمة الوطنية والمؤسسية.

1-الكشف عن ميتوفاجي في الخلايا البشرية

  1. الكشف عن ميتوفاجي باستخدام بلازميد كيما طن متري
    ملاحظة: البروتين كيما، تنصهر فيها إشارة هدف الميتوكوندريا، والمبسطة طن متري-كيما، أثبت جدواه في فيفو الكشف ميتوفاجي. mt-كيما هو بروتين فلوري راتيوميتريك حساسة لدرجة حموضة الذي يسلك الفلورية الخضراء (الإثارة 458 نانومتر) في الشروط الأساسية أو محايدة والأسفار أحمر (الإثارة 561 nm) في الظروف الحمضية. الميتوكوندريا صحية تزدهر في الظروف الأساسية أو محايد (الرقم الهيدروجيني 7-8) والمشار إليها بواسطة الفلورية الخضراء عند transfected مع كيما طن متري. عندما تخضع ميتوفاجي الميتوكوندريا وفتيل مع lysosomes الحمضية، تنخفض درجة الحموضة إلى 4.5 ويحمل الميتوكوندريا التي تحتوي على طن متري-كيما ومضان أحمر6،،من1314. الأهم من ذلك، كيما طن متري مقاوم البروتياز الليزوزومية، مما يتيح تقييم ميتوفاجي على مدى فترات أطول. البروتوكول أدناه مصممة للوحات 6-جيدا.
    1. يوم 1: استخدام خلايا الإنسان الأولية (مثلاً، الليفية) أو الخلايا البشرية مخلدة (مثلاً، الخلايا خلايا هيلا أو U2OS). البذور حوالي 0.3-1 × 106 خلايا/بئر (تبعاً لمعدل نمو الخلية السماح بالوصول إلى كونفلوينسي 70% في اليوم التالي الخلايا) في لوحة 6-جيدا. الحفاظ على الخلايا في خلية كاملة الثقافة المتوسطة (المتوسطة المتوسطة ايجل تعديل (دميم) دولبيكو لتستكمل مع 10% FBS، و 1% مختلطة الحل للبنسلين والستربتوميسين)، واحتضان في حاضنة ثقافة خلية عند 37 درجة مئوية (20% س2، 5% CO2 ). إضافة 1 مل خلية كاملة متوسطة الثقافة/بئر في لوحة 6-جيدا.
      ملاحظة: يمكن أن يتم العلاج الجيني overexpression/ضربة قاضية أو المخدرات في هذه المرحلة6.
    2. يوم 2: ميكس طن متري-كيما بلازميد الحمض الخلوي الصبغي6 والحمض النووي تعداء كاشف (الخليط لواحد من لوحة 6-جيدا جيدا).
      1. تمييع 15 ميليلتر من كاشف تعداء الحمض النووي مع 150 ميليلتر من المتوسط خالية من المصل وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
      2. تخفف من 2-5 ميكروغرام من طن متري-كيما بلازميد الحمض النووي مع 150 ميليلتر من المتوسط خالية من المصل.
      3. إضافة بلازميد كيما mt المخفف للحمض المخفف تعداء كاشف، دوامة ل 10 ق، واحتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
        ملاحظة: قد يكون الأمثل للحمض النووي تعداء الشروط اللازمة تبعاً لحجم اللوحة (انظر بروتوكولات الشركات المصنعة للحصول على التفاصيل).
      4. إضافة خليط كاشف الحمض النووي/تعداء dropwise للخلايا، ثم يهز لوحات بلطف ل s 5-10 حتى يختلط تماما الحل.
    3. يوم 3: تغيير وسائط الإعلام باستبدال المتوسطة المحتوية على كاشف تعداء الحمض النووي بالخلية كاملة جديدة الثقافة المتوسطة (1 مل/جيد).
    4. يوم 4: صورة الخلايا باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]6. استخدام التصوير قناتين: قناة الأخضر (الإثارة 458 نانومتر، الانبعاثات 570 695 نانومتر) لتصور الميتوكوندريا العادي والقناة الحمراء (nm الإثارة 561، الانبعاثات 570 695 نانومتر) لتصور الميتوكوندريا التي يمر بها ميتوفاجي. الصورة عشوائياً المناطق 20 تحت 40 x التكبير لتغطية مجموع الخلايا 100-200 في كل بئر.
    5. القيام بتحليل البيانات. حساب مؤشر "ميتوفاجي" (النسبة المئوية من الميتوكوندريا التي تمر ميتوفاجي)، استخدام برنامج تحليل الصور لتحديد مقدار الأسفار في كل قنوات الأحمر والأخضر: تأخذ نسبة الأسفار حمراء للأسفار الأحمر + الأخضر، و قم بضرب 1006.
      ملاحظة: تشمل بدائل تعداء استخدام خطوط الخلية هيلا طن متري-كيما ستابلي أعرب عن14. منذ خلايا هيلا لا تعبر عن باركين، يجب أن أعرب باركين ستابلي لدراسة ميتوفاجي باركين المعتمدة في هذا خط الخلية.
  2. الكشف عن ميتوفاجي باستخدام كولوكاليزيشن بين "ج السيتوكروم" أوكسيديز وحدة فرعية الثاني (كوشي) و LAMP2
    ملاحظة: كوشي بروتين غشاء داخلي المتقدرية ترميز الجينوم. الفهرس 'ميتوفاجي' يساوي نسبة كوشي كولوكاليزيد مع LAMP2 كنسبة مئوية من مبلغ إجمالي قدرة كوشي.
    1. البذور هيلا الخلايا (أو خلايا أخرى للمصلحة المذكورة في الخطوة 1.1.1) في شريحة دائرة 4-جيدا (1-5 × 104 خلايا في 1 مل خلية كاملة متوسطة الثقافة/بئر) في خلية ثقافة حاضنة في 37 درجة مئوية (20% س2، 5% CO2) بين عشية وضحاها.
    2. إضافة ميليلتر 3.0 من الكربونيل 10 ملم السيانيد--4--(تريفلوروميثوكسي) فينيلهيدرازوني (فككب)، واحتضان في ثقافة الخلية الحاضنة (الخطوة 1.2.1) ح 3.
      ملاحظة: يمكن استخدام الأدوية الأخرى التي تؤثر على ميتوفاجي.
    3. إزالة المتوسطة الثقافة باستخدام ماصة 1 مل، وتغسل الخلايا مرتين مع 1 مل/جيدا من البرد (0-4 درجة مئوية) 1 x برنامج تلفزيوني. واسمحوا الحل الجلوس على 10-30 ثانية قبل الغسيل القادمة. ثم إضافة 0.5 مل 3.7% بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني x 1 لكل بئر واحتضان لمدة 10 دقائق على الجليد إصلاح الخلايا.
      تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السمية. العمل في غطاء دخان عند استخدام منهاج عمل بيجين.
    4. تجاهل الحل منهاج العمل باستخدام ماصة 1 مل، وتغسل الخلايا مرتين مع الباردة 1 X برنامج تلفزيوني (1 مل/حسنا؛ اسمحوا الحل الجلوس لمدة 10 s قبل الغسيل القادم)، وبيرميبيليزي الخلايا مع 1 مل/جيدا من المنظفات 0.25% (في برنامج تلفزيوني 1 x) لمدة 10 دقائق على الجليد.
    5. تجاهل المخزن المؤقت بيرميبيليزينج، وتغسل بلطف الخلايا مرتين مع الباردة 1 × برنامج تلفزيوني وتجاهل (اسمحوا الحل الجلوس لمدة 10 ق بين يغسل). كتلة الخلايا مع 1 مل/من 5% FBS في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. وتشمل الدوائر لمنع فقدان الرطوبة.
    6. إعداد 0.5 مل/جيدا لحل جسم مختلطة مع الأجسام المضادة كوشي (الماوس، وتمييع 1: 250) والأجسام المضادة LAMP2 (الأرانب، وتمييع 01:20--01:50) في برنامج تلفزيوني 1 x مع 5% FBS ومخزن على الجليد ل 0.5-1 ح.
    7. إخراج الشريحة الدائرة 4-جيدا من الغرفة الباردة وتجاهل حل حظر مع ماصة 1 مل. تغسل بلطف الخلايا مرتين مع 1 مل/جيدا من البرد 1 × برنامج تلفزيوني وتجاهل (اسمحوا الحل الجلوس لمدة 10 ق بين يغسل)، ثم إضافة 0.5 مل/وأيضا حل جسم مختلطة. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1 على شاكر سرعة منخفضة.
    8. تجاهل الحل جسم الأولى باستخدام ماصة 1 مل بلطف تغسل الخلايا ثلاث مرات مع 1 مل/جيدا لبرنامج تلفزيوني الباردة 1 x وتجاهل. تمكنك من الحل يجلس لمدة 10 ق قبل الغسيل القادمة. أضف 1 مل/بئر الفلورسنت الأجسام المضادة الثانوية (مثلاً، الماعز الأرنب المضادة مع الطول الموجي 568 شمال البحر الأبيض المتوسط من البروتين الأحمر نيون (RFP) ل LAMP2؛ والماعز المضادة الماوس مع الطول الموجي 488 نانومتر من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) كوشي) في تمييع 1: 250 مع 5% FBS في برنامج تلفزيوني 1 x. تغطية الشريحة الدائرة 4-جيدا مع رقائق الألومنيوم واحتضان في 37 درجة مئوية ح 1 على شاكر سرعة منخفضة.
    9. تجاهل الحل جسم الثاني مع ماصة 1 مل. تغسل بلطف الخلايا ست مرات مع 1 مل/جيدا لبرنامج تلفزيوني الباردة x 1. واسمحوا الحل الجلوس لمدة 1 دقيقة قبل الغسيل القادمة.
    10. جبل الخلايا مع 50 ميليلتر/البئر متوسطة تصاعد أنتيفادي مع DAPI، وإضافة كشوف الغطاء.
    11. صورة الخلايا تحت مجهر [كنفوكل] مع 66 × النفط التكبير والغمر (مسح بلاط/الفسيفساء يمكن أن تستخدم لزيادة عدد الخلايا المصورة بالبرنامج). استخدام نفس الإعدادات مثل قناة وقت التعرض، الإزاحة الرقمي إلخ طوال تصوير جميع العمليات (انظر تعليمات البرنامج لمزيد من التفاصيل)15، كسب الرقمية.
    12. استخدام برمجيات التحليل كولوكاليزيشن لتحليل كمي على الأقل 20 صور عشوائية من 100 الخلايا15. استخدم الدالة "بيزيه مغلقة" لتحديد خلايا فردية بأكملها. مقارنة معامل كولوكاليزيشن بيرسون التجارة والنقل لطلب تقديم العروض، أو مرجح مرجحة، لتحديد مستويات ميتوفاجي في خلايا تم تحليلها. الحفاظ على القيم لمرمى برمجيات التحليل كولوكاليزيشن في جميع أنحاء التحليل الأفقي والرأسي. بدقة لتحديد هذه الشعيرات المتصالبة، إعداد مجموعتين إضافية من الخلايا وتسمية واحدة كوشي و LAMP2 أخرى. ثم تعيين مرمى مباشرة أعلاه توزيع بكسل لكل قناة15 (انظر تعليمات البرنامج للحصول على التفاصيل).
  3. إنتاجية عالية التصوير القياس لفحص ميتوفاجي
    ملاحظة: أداء شاشات الإنتاجية العالية من المركبات المسببة ميتوفاجي أو تثبيط ميتوفاجي من مكتبات مجمع كبير تطالب من الناحية الفنية. أسلوب تصوير استناداً إلى كولوكاليزيشن الميتوكوندريا مع أوتوفاجوسوميس بديل أكثر تبسيطية، لكنها حساسة للغاية لفحص16ميتوفاجي.
    1. يوم 1: بذور الخلايا (مثلاً، البشرية الليفية الأولية في 5,000 الخلايا/100 مل خلية ثقافة وسائل الإعلام/بئر) في لوحة 96-جيدا (راجع الخطوة 1.1.1).
    2. يوم 2: علاج الخلايا من اليوم الثاني مع فككب أو غيرها من المركبات ذات الأهمية للوقت المعين الحضانة (راجع الخطوة 1.2.2).
    3. اتبع الخطوات 1.2.2-1.2.9 باستخدام الأجسام المضادة الأولية كوشي (الماوس، وتمييع 1: 250 مع 5% FBS في برنامج تلفزيوني 1 x) و LC3B (أرنب، 1: 100-تمييع 1: 200 مع 5% FBS في برنامج تلفزيوني 1 x). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام الأجسام المضادة الأولية كوشي و LAMP2.
    4. صورة الخلايا باستخدام قارئ فلورسنت16. جمع الصور في حقول الموضوعة عشوائياً ومع الحد أدنى 500 خلايا/جيدا.
    5. تحليل البيانات باستخدام بروتوكول محلل مخصص16خلية.

2-الكشف عن ميتوفاجي في C. ايليجانس

ملاحظة: ديدان أسطوانية C. ايليجانس منبرا للاعتداء ميتوفاجي على المستوى العضوي. يمكن استخدام سلالات اثنين لرصد ميتوفاجي: (1) تستهدف الميتوكوندريا روزيللا (متروسيلا) أو (2) ميتوفاجي مستقبلات DCT-1 تنصهر مع التجارة والنقل جنبا إلى جنب مع علامة أوتوفاجوسومال لج-1 تنصهر مع البروتين الفلورسنت الأحمر (دسريد) ديسكوسوما sp.5، 17.

  1. رصد استخدام biosensor روزيللا ميتوفاجي
    ملاحظة: روزيللا هو بيوسينسور جزيئية التي تجمع بين دسريد غير متحسسة للأس الهيدروجيني تنصهر فيها متغير بروتينات فلورية خضراء حساسة لدرجة حموضة. بيوسينسور روزيللا يستفيد من pH الاختلافات بين يحلول الحمضية (~ 4.5 درجة الحموضة) والمكونات الخلوية الأخرى. وقد استخدمت هذه بيوسينسور لرصد نجاح ميتوفاجي Saccharomyces cerevisiae وخطوط خلايا الثدييات عدة، مثل الحلة، HEK293، و HCT116،من1819. علينا تكييف هذا المراسل المزدوج-فلوري تنوعاً وولدت المعدلة وراثيا C. ايليجانس الخيطية معربا عن استهداف الميتوكوندريا روزيللا (متروسيلا) في خلايا العضلات في جدار الجسم. تتم الإشارة إلى الحث ميتوفاجي بانخفاض نسبة بروتينات فلورية خضراء/دسريد متروسيلا الأسفار.
    1. يوم 1: اختيار L4 يرقات الديدان معربا عن استهداف الميتوكوندريا روزيللا (متروسيلا) في خلايا العضلات في جدار الجسم على طبق من وسائط نمو ديدان أسطوانية (NGM) المصنف مع كولاي (OP50) باستخدام مجهر تشريح5. ضع 10-20 الديدان/لوحة على لوحات 3.5 سم على الأقل ثلاثة. احتضان للخيطيات عند درجة حرارة 20 درجة مئوية5القياسية.
      ملاحظة: راجع المرجع لتشريح الدودة، بما في ذلك تحديد L4 اليرقات20، وطريقة لجعل اختيار الذي يستخدم لنقل الديدان من موقع واحد إلى آخر21.
    2. يوم 5: مزامنة الديدان الخيطية بتحديد 15-20 L4 اليرقات المعدلة وراثيا ونقلهم إلى الطازجة OP50 المصنف لوحة NGM. استخدام لوحات خمسة على الأقل في حالة تجريبية.
    3. اليوم السابع: إعداد لوحات المركبات للعقاقير التي تؤثر على ميتوفاجي من الفائدة أو عناصر إيجابية.
      1. قتل بكتيريا كولاي (OP50) المصنف بتعريض لوحات NGM لمدة 15 دقيقة مع 222 µW/سم2 (كثافة) للأشعة فوق البنفسجية التأكد من أن المركبات المسببة ميتوفاجي يستقلبان لا بالبكتيريا. يجب أن تعرض لوحات مع 2,000 ي/م2.
        ملاحظة: ثانية من التعرض اللازمة = 2,000/((intensity in µW/cm2) * 100).
      2. إضافة compound(s) للفائدة على الجزء العلوي من لوحات NGM المصنف. إضافة مبلغ معادل من المركبات مركب (المذيبات المستخدمة لإذابة المجمع، مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) إلى لوحات المركبات كعنصر سلبي. لمراقبة إيجابية التعريفي ميتوفاجي، أنها سامة المتقدرية، استخدمت بركات (8 مم تركيز النهائي). إضافة محلول يحتوي على 10 ميليلتر م 8 بركات المخزون مع 190 ميليلتر ddH2س على رأس لوحة أجار لفريق العلاج. لمجموعة المركبات، إضافة محلول يحتوي على 10 ميليلتر من [دمس] مع 190 ميليلتر من ddH2س على رأس لوحة أجار.
        ملاحظة: قد أبقى الحل بركات-العامل لمدة شهر واحد في 4 درجات مئوية.
      3. دوامة اللوحات بلطف حتى المخدرات أو مركبة يكسو كامل السطح. السماح لوحات لتجف مع الأغطية مغلق في درجة حرارة الغرفة على الأقل 1 ح قبل نقل الديدان.
        ملاحظة: لوحات المخدرات يمكن أيضا إعداد بإضافة الأدوية في NGM السائلة قبل أن يتصلب.
    4. اليوم السابع: نقل 10-20 من عمره 2 يوما الكبار الحيوانات المحورة وراثيا إعدادها في الخطوة 2.1.2 إلى لوحات تتضمن أما بركات، compound(s) الفائدة، أو مركبة ([دمس]). تبني الحيوانات المحورة وراثيا في 20 درجة مئوية لمدة يومين.
    5. يوم 9: تحضير منصات [اغروس] 2% (انظر المواد التكميلية). ثم أضف قطره واحدة (10 ميليلتر) من levamisole 20 ملم في M9 كل لوح. شل الحيوانات المحورة وراثيا للتصوير، بوضعها في إسقاط M9 levamisole. بلطف ضع ساترة في الجزء العلوي.
    6. التقاط واحد الحيوانات المحورة وراثيا باستخدام كاميرا إرفاقه مجهر ابيفلوريسسينسي. الحصول على صور مضيئة من الديدان الخيطية المعدلة وراثيا كله معربا عن متروسيلا في خلايا العضلات في جدار الجسم في التكبير X 105. حفظ الصور التي تم جمعها.
    7. معالجة الصور المكتسبة مع برنامج إيماجيج. تحليل خلايا العضلات جدار الجسم الموجود في رأس الدودة لتجنب أوتوفلوريسسينسي في الأنسجة المعوية. قياس كثافة بكسل متوسط المنطقة القيمة والمجموع لكل صورة الفلورسنت فقط من منطقة رأس كل حيوان. لتحليل منطقة محددة من الفائدة:
      1. حدد 'تقسيم القناة' تحت 'صورة' و 'لون' القائمة المنسدلة لتحويل الصور.
      2. تستخدم الأداة 'اختيار حر' لالتقاط الفلورسنت مجال الاهتمام.
      3. حدد الأمر 'قياس' ضمن القائمة المنسدلة 'تحليل' والقيام بتحليل كثافة بكسل.
      4. وينبغي تطبيع كثافة بكسل بقسمة كثافة من المساحة الإجمالية التي تم تحليلها. على التطبيع، حساب في التجارة والنقل إلى دسريد نسبة22.
    8. استخدام التحليل الإحصائي البرمجيات أما إلى سلوك الطالب t-اختبار (مقارنة بين الفريقين) أو ANOVA (المقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع ف < 0.05 ك كبير5،17 .
  2. تقييم استخدام التعريب المشارك بين DCT-1 و 1 لج ميتوفاجي
    ملاحظة: DCT-1 هو بروتين غشائي الميتوكوندريا خارجي الذي يعمل كمستقبل ميتوفاجي في الاستجابة التشديد على الشروط، مماثلة المفترضة أورثولوجويس BNIP3 ونيكس/BNIP3L في الثدييات5. وهكذا، هو تقييم البدء ميتوفاجي التعريب المشارك بين DCT-1 ميتوفاجي أوتوفاجوسومال ومستقبلات بروتين غشائي لج-1 (homolog LC3 الثدييات).
    1. يوم 1: المصنف اليرقات L4 انتقاء الحيوانات المحورة وراثيا معربا عن DCT--1::GFP و DsRed::LGG-1 في جدار الجسم عضلة خلايا5 على OP50 لوحة NGM. 5-10 الديدان/3.5 سم لوحة، واستخدام لوحات ثلاثة على الأقل. احتضان الحبليات في 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: توجد في المتسلسلات على والبلازميدات منفصلة وأنها لم تدمج في الجينوم. التقاط الديدان الخيطية تحمل علامات كونترانسفورميشن التجارة والنقل rol-6(su1006) و فميو-2 . فقط التعبير عن الديدان المحورة وراثيا مع كل علامات كونترانسفورميشن DCT-1::GFP و DsRed::LGG-1 في خلايا العضلات في جدار الجسم.
    2. اتبع الخطوات من 2.1.2-2.1.5.
    3. صورة باستخدام كاميرا مرفقة مجهر [كنفوكل]5،23خلايا العضلات جدار جسم واحد. الكشف عن الصور حدود خلايا العضلات في جدار الجسم كامل وتأخذ z-مكدس تحت 63 x التكبير. يمكن أيضا استخدام أعلى التكبير.
    4. فتح وتجهيز الصور المكتسبة مع البرنامج [كنفوكل]. يتم الإشارة إلى الشروع في ميتوفاجي التعريب المشارك من مستقبلات ميتوفاجي (DCT-1::GFP) للعلامة أوتوفاجوسومال (DsRed::LGG-1). يدوياً لقياس الأحداث التعريب المشارك في كل مكدس من جدار الجسم عضلة الخلية5. من الضروري أن تبقى كافة إعدادات الكاميرا والمجهر (العدسة والمكبر، المرشحات، ووقت التعرض، والقرار، كثافة الليزر، كسب، إلخ) ثابتاً في التجارب. وينبغي ملاحظة كافة الإعدادات.
    5. استخدام التحليل الإحصائي البرمجيات أما إلى سلوك الطالب t-اختبار (مقارنة بين الفريقين) أو ANOVA (المقارنة بين مجموعات متعددة) للتحليل الإحصائي مع ف < 0.05 ك كبير5،17 . لاستخدام مقارنات ذات اتجاهين للطالب t-اختبار (0.05p < يعتبر الهامة). لإجراء مقارنات متعددة استخدام تحليل التباين عامل واحد (ANOVA)، تصحيح اختبار بونفيروني وظيفة المخصصة . ونحن نوصي تحليل الحيوانات على الأقل 50-70 أو خلايا العضلات في جدار الجسم 30-50 لكل حالة تجريبية. تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.

3-الكشف عن ميتوفاجي في الفئران

ملاحظة: الأساليب السابقة للكشف عن ميتوفاجي في الفئران كانت مرهقة وغير حساسة، ويصعب قياسها كمياً. نموذج الفأر وراثيا معربا عن شكل المتقدرية استهداف مراسل الفلورسنت كيما الآن يمكن أن تستخدم (طن متري-كيما) لتقييم مستويات ميتوفاجي في طائفة واسعة من الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية.

  1. Euthanize الفئران باستخدام بروتوكول أقرته لجنة الاستخدام ورعاية الحيوان المؤسسية14.
  2. تأمين الماوس (الجانب البطني الأعلى) إلى منصة العمل باستخدام دبابيس في أطرافه. إجراء شق في أسفل البطن باستخدام الجراحة المقص والملقط لفضح الكبد24. قص قطعة من الكبد (مثل، قطعة من الفص الأيمن في 1 × 1 × 1 سم) باستخدام الجراحة مقص وملقط.
    ملاحظة: الكشف عن ميتوفاجي في الفئران معقد ويتطلب المعرفة بتشريح الفأر والتعامل مع الماوس ماهراً جداً وجراحة الماوس. يوفر هذا البروتوكول الخطوات الأساسية والرئيسية في هذا الأسلوب، وهو أسلوب أكثر تفصيلاً متاحة24.
  3. مكان عينة الكبد على لوحة معدنية على الجليد لسرعة تبريد الأنسجة. الحفاظ النسيج على اللوحة المعدنية الباردة وعملية، في أسرع وقت ممكن. استخدامها على النحو الأمثل، ضمن ح 1 التشريح.
  4. رفع عينة الكبد باستخدام الملقط المنحنية وشطف مع 5 مل من المثلج x 1 برنامج تلفزيوني.
  5. نقل الكبد إلى طبق بتري (Ø 100 ملم) على الجليد باستخدام نهاية ملعقة ملعقة.
  6. قطع عينة الكبد باليد إلى 0.5-1 مم سميكة الأقسام باستخدام شفرات حافة واحدة.
  7. بعناية بنقل المقاطع الأنسجة إلى طبق أسفل زجاج باستخدام ملقط الجراحة.
  8. مجموعة المقطع الكبد بعناية مع ملقط لشد في الجزء السفلي.
  9. تغطي شرائح الكبد مع 3-5 قطرات من برنامج تلفزيوني الباردة x 1.
    ملاحظة: تلطيخ DAPI يوصي بتحديد منطقة الفائدة في بعض الأنسجة (مثلاً، الدماغ)24. للتحقق من صحة الترجمة المشارك من إشارة حمراء طن متري-كيما مع يحلول، الأصباغ الليزوزومية، مثل الأزرق تتالي ديكستران وليسوسينسور، يمكن أن تستخدم24.
  10. الصورة أقسام الأنسجة تحت الفحص المجهري [كنفوكل] عن طريق اثنين من الجسيمات متسلسلة24. تعيين اثنين من القنوات التصوير: "الأخضر" قناة mt-كيما (الإثارة 458 نانومتر، ومجموعة نانومتر الانبعاثات 570-695) وكيما طن متري "أحمر" (nm الإثارة 561، الانبعاثات 570 695 نانومتر النطاق). الحفاظ على إعدادات التصوير بين الظروف التجريبية. لتصوير أكثر كفاءة، تحليل اثنين من الحيوانات في وقت واحد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الكشف عن ميتوفاجي في خلايا الإنسان:

استخدام الإجراء المعروضة هنا، تم transfected خلايا هيلا الإنسان مع بلازميد كيما طن متري. خلايا صحية أثبتت شبكة منظمة تنظيماً جيدا المتقدرية (بروتينات فلورية خضراء، 488 نانومتر) مع حالات قليلة من ميتوفاجي (طلب تقديم العروض، 561 nm). ومع ذلك، الخلايا pretreated مع أونكوبلير الميتوكوندريا فككب (30 ميكرومتر ح 3) أظهرت زيادة قدرها عميقة في الإصابة ميتوفاجي (الشكل 1A). وتم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وتطالب تقنيا دقيقة لقياس ميتوفاجي. وهنا، وقد قدمنا العديد من التقنيات القوية التي تسمح لكلا كشف ميتوفاجي النوعي والكمي لمستويات ميتوفاجي في النماذج التجريبية الأكثر شيوعاً في المختبر.

للحصول على بيانات قابلة للنسخ المتماثل، ضروري تصميم تجريبي مع تكرار البيولوجية ثلاثة على الأقل. يجب أن يكون أعمى جميع الباحثين المشاركين في التجريب والتحليل للهويات المجموعة التجريبية. وعلاوة على ذلك، التصوير الحقول يجب عشوائياً اختيار أثناء الحصول على الصور. خلية ثقافة ودراسات C. ايليجانس ، ينبغي إجراء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وقد المختبر بور CRADA الترتيبات مع تشروماديكس وجلاكسو سميث كلاين.

شكر وتقدير

ونحن نشكر الدكتور أتسوشي ميياواكي والدكتور ريتشارد ج. يول لتقاسم بلازميد كيما طن متري وطن متري-كيما المتكاملة خلايا هيلا. ونحن نشكر حسام ألف شآمنا والدكتورة ديبورا لام كروتو لقراءة نقدية من المخطوطة. هذا البحث يدعمه "برنامج البحوث الداخلية" "المعهد الوطني للصحة" (فب)، منح المعهد الوطني للشيخوخة، فضلا عن الفترة 2014-2015 ومختبر داخل 2016-2017 نيا (EFF، فب). وأيده ممثل المؤسسة "ﻷمراض هيلسي" سور--معاهدة الفضاء الخارجي (رقم المشروع: 2017056) و "مجلس البحوث في النرويج" (رقم المشروع: 262175).

مساهمات مقدم البلاغ:

المؤسسة تصميم المخطوطة وإعداد المشروع؛ KP، NS، EMF، RDS، جسك، ساك، YH واد كتب مقاطع مختلفة من الورقة؛ NT، JP، حماد، و VAB تنقيح المخطوط وتقديم الخبرة الفنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
mt-Keima mouseJackson Laboratory
Lipofectamine 2000 كاشف تعداء الحمض النوويThermofisher# 11668027
Opti-MEM medium (Gibco)Thermofisher# 31985062متوسط خال من المصل
mtKemia البلازميد: pCHAC-mt-mKeimaaddgene# 72342
COXII الجسم المضاد (الفأر)abcam#ab110258
الجسم المضاد LAMP2 (أرنب)NOVUS
الماعز المضاد للأرانب بطول موجي 568 نانومتر من البروتين الفلوري الأحمر (RFP)Thermofisher#Z25306Alexa Fluor 568 صبغة
الماعز المضادة للفأر بطول موجي 488 نانومتر من البروتين الفلوري الأخضر (GFP)Thermofisher#Z25002صبغة Alexa Fluor 488
تطيل الذهب المضاد للتلاشي مع DAPIInvitrogen#P36931
6 آبار لوحةSIGMA
Corning Costar		#CLS3516
غرفة 4 آبارTHermofisher ، Nunc Lab-Tek# 171080
Nunc F 96-well لوحةThermofisher# 152038
LC3B أجسام مضادة للأرانبNOVUS#NB100-2220
الحمض النووي الأجسام المضادةProgen Biotechnik#anti-DNA الفأر أحادي النسيلة ، AC-30-10
DAPIThermofisher#D1306وسيط تركيب مضاد للبهتان مع
محلل خلية DAPI IN (قارئ الفلورسنت) GEHealthcare LifeSciences#IN محلل الخلية 2200
Eclipse TE-2000e مجهر متحد البؤرNikon#TE-2000e
برنامج Colocalization Volocity#Volocity 6.3برنامج Zeiss ZEN 2012 البديل
IN برنامج محقق الخليةGE Healthcare LifeSciences # 28408974
وسط زراعة الخلاياThermofisher#DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL)Thermofisher# 15140122
مصل الأبقار الجنينيSigma-Aldrich#12003C-1000ML
حاضنة ثقافة الخلاياThermofisher#Thermo Forma 3110 CO2 حاضنة
مجهر epifluorescenceZeiss ZeissAxio Imager Z2
الكاميراأوليمبوسأوليمبوس DP71
المجهر متحد البؤرزايسزايس أكسيو أوبزرفر Z1
برنامج متحد البؤرZeissZEN 2012
برنامج تحليل الصورالصورة Jتحليل التوطينية ، إلخhttps://imagej.nih.gov/ij/
برنامج التحليل الإحصائيGraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكيةمادة حزمة برنامج GraphPad Prism
لجعل دودة تختارSurepure Chemetals# 4655يتكون الانتقاء من 30 مقياس 90٪ بلاتين 10٪ سلك إيريديوم
IR: N2 ؛ Ex [pmyo-3< / em> TOMM-20:: Rosella]استفسار مادي ل Tavernarakis Nektariosالحفاظ على المعدلة وراثيا عند 20 درجة ؛ ج
الأشعة تحت الحمراء: N2 ؛ على السبيل [pdct-1< / em> DCT-1 :: GFP ؛ pmyo-3< / em> DsRed :: LGG-1]الاستفسار المادي إلى Tavernarakis Nektarios
pmyo-3< / em> TOMM-20 :: Rosellaاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios
pdct-1< em> DCT-1 :: GFPالاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios
pmyo-3< / em> DsRed:: LGG-1الاستفسار عن المواد لحل Tavernarakis Nektarios
Paraquatانظر البيانات التكميلية لإعداد
المخزن المؤقت M9انظر البيانات التكميلية لإعداد
المخزن المؤقت M9-levamisoleانظر البيانات التكميلية للتحضير
المجهر الزجاجي والأغطيةفيشرالعلمية#B9992000
ملقط جراحيSTERIS Animal Health19 قطعة حزمة تعقيم مقص جراحي اقتصادي
STERIS Animal Health19 قطعة حزمة تعقيم الاقتصادية
1x PBSThermofisher#AM9625يجب تخفيف 10x PBS إلى 1x PBS باستخدام ddH2O
شاكرفيشر العلمي# 11-676-178Thermo Scientific MaxQ HP منضدية مدارية صغيرة في الهواء الطلق منصة شاكر حزمة 2
وسادة الاغاروزانظر البيانات التكميلية للتحضير
شفرات الاهتزازالأدوات الدقيقة العالمية#BLADES-2معدني أحادي الحافة
MSC# 788039880.012 بوصة سميكة × 6 بوصة عرض × 12 بوصة ، 430 صفائح الفولاذ المقاوم للصدأ
Triton X-100منظف
ميثيل ثنائي كلوريد الفيولوجين هيدراتسيجما ألدريتش# 856177حاضنة باراكوات
للديدان الخيطيةحاضنة أكواליטيكللحفاظ على 20 درجة ؛ C
تشريح المجهر المجسمأوليمبوسSMZ645
المجهر متحد البؤرZeissAxioObserver Z1للديدان الخيطية (الخطوة 2) مجهر
epifluorescenceZeissAxioImager Z2للديدان الخيطية (الخطوة 2)
الأشعة فوق البنفسجية المتشابكةVilber LourmatBIO-LINK & ndash ؛ مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية BLX-E365؛ 356 نانومتر
#CD107b شريحة مغلفة بالماء شرائح ٪ لوح

المراجع

  1. Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
  2. Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3), 158-170 (2015).
  3. Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. The Mitochondrial Basis of Aging. Mol Cell. 61 (5), 654-666 (2016).
  4. Shadel, G. S., Horvath, T. L. Mitochondrial ROS signaling in organismal homeostasis. Cell. 163 (3), 560-569 (2015).
  5. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  6. Lazarou, M., et al. The ubiquitin kinase PINK1 recruits autophagy receptors to induce mitophagy. Nature. 524 (7565), 309-314 (2015).
  7. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's Disease: Cellular and Molecular Mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  8. Fivenson, E. M., et al. Mitophagy in neurodegeneration and aging. Neurochem Int. , (2017).
  9. Menzies, F. M., Fleming, A., Rubinsztein, D. C. Compromised autophagy and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 16 (6), 345-357 (2015).
  10. Rubinsztein, D. C., Shpilka, T., Elazar, Z. Mechanisms of autophagosome biogenesis. Curr Biol. 22 (1), R29-R34 (2012).
  11. Kerr, J. S., et al. Mitophagy and Alzheimer's disease: cellular and molecular mechanisms. Trends neurosci. 40 (3), 151-166 (2017).
  12. Menzies, F. M., Moreau, K., Puri, C., Renna, M., Rubinsztein, D. C. Measurement of autophagic activity in mammalian cells. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 15, Unit 15 16(2012).
  13. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chem Biol. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  14. Sun, N., et al. Measuring In Vivo Mitophagy. Mol Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
  15. Fang, E. F., et al. Defective mitophagy in XPA via PARP-1 hyperactivation and NAD(+)/SIRT1 reduction. Cell. 157 (4), 882-896 (2014).
  16. Diot, A., et al. A novel quantitative assay of mitophagy: Combining high content fluorescence microscopy and mitochondrial DNA load to quantify mitophagy and identify novel pharmacological tools against pathogenic heteroplasmic mtDNA. Pharmacol Res. 100, 24-35 (2015).
  17. Schiavi, A., et al. Iron-Starvation-Induced Mitophagy Mediates Lifespan Extension upon Mitochondrial Stress in C. elegans. Curr Biol. 25 (14), 1810-1822 (2015).
  18. Rosado, C. J., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., Devenish, R. J. Rosella: a fluorescent pH-biosensor for reporting vacuolar turnover of cytosol and organelles in yeast. Autophagy. 4 (2), 205-213 (2008).
  19. Sargsyan, A., et al. Rapid parallel measurements of macroautophagy and mitophagy in mammalian cells using a single fluorescent biosensor. Sci Rep. 5, 12397(2015).
  20. Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2009).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293(2011).
  22. Palikaras, K., Tavernarakis, N. In vivo Mitophagy Monitoring in Caenorhabditis elegans to Determine Mitochondrial Homeostasis. Bio Protoc. 7 (7), e2215(2017).
  23. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Assessing Mitochondrial Selective Autophagy in the Nematode Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol. 1567, 349-361 (2017).
  24. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nat Protoc. 12 (8), 1576-1587 (2017).
  25. Eiyama, A., Okamoto, K. Assays for Mitophagy in Yeast. Methods Mol Biol. 1567, 337-347 (2017).
  26. McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. J Cell Biol. 214 (3), 333-345 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Mito Keima C Elegans HeLa FCCP LAMP2 COXII
في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.