ميتوفاجي، عملية إزالة تلف الميتوكوندريا، أمر ضروري لصيانة التوازن والصحة المتقدرية. تقدم هذه المقالة بعض ميتوفاجي أحدث أساليب الكشف في الخلايا البشرية، ايليجانس كاينورهابديتيسوالفئران.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في المختبر و في فيفو كشف ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس جيموالفئران
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الميتوكوندريا هي القوى للخلايا وإنتاج الطاقة الخلوية على شكل ATP. ويسهم خلل mitochondrial الشيخوخة البيولوجية ومجموعة متنوعة من الاضطرابات بما في ذلك الأمراض الأيضية ومتلازمات الشيخوخة المبكرة وأمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD). المحافظة على الصحة المتقدرية يتوقف على نشوء حيوي mitochondrial وتطهير كفاءة الميتوكوندريا المختلة وظيفيا من خلال ميتوفاجي. وقد تم تحدي الأساليب التجريبية لدقة الكشف عن أوتوفاجي/ميتوفاجي، لا سيما في نماذج حيوانية، لتطوير. وقد مكن التقدم المحرز مؤخرا نحو فهم الآليات الجزيئية ميتوفاجي تطوير تقنيات الكشف عن ميتوفاجي الرواية. وهنا، نحن نقدم عدة تقنيات متعددة لرصد ميتوفاجي في الخلايا البشرية، ايليجانس كاينورهابديتيس (مثلاً، روزيللا وسلالات DCT-1/1 لج)، والفئران (طن متري-كيما). سيتم تحسين دقة القياسات ميتوفاجي توليفة من هذه التقنيات الكشف عن ميتوفاجي، بما في ذلك تقييم الأنواع الصليب، ويؤدي إلى فهم أفضل لدور ميتوفاجي في الصحة والمرض.
المقدمة
ميتوفاجي ضروري لصيانة المتقدرية. الميتوكوندريا تتقاطع مع خلية متعددة مما يشير إلى مسارات وهي العضيات الخلوية الفرعية العالمية المسؤولة عن إنتاج الطاقة الخلوية واستقلاب الخلية، والكالسيوم التوازن1،2،3، 4-الميتوكوندريا باستمرار تجربة التحديات من مصادر داخلية وخارجية، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) وسميات المتقدرية، على التوالي، مما يؤدي إلى توليد الميتوكوندريا "المسنين" والمختلة وظيفيا. تراكم من الميتوكوندريا التالفة يقلل من كفاءة إنتاج ATP مع زيادة مقدار روس الضارة، وارتبط بالأمراض المرتبطة بالسن مثل الأمراض الأيضية، والإعلانات، وشعبة الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
الحيوانات (الفئران الذكور والإناث) قد ولدوا وتربوا في منشأة حيوان المعتمدين، وفقا وموافقة "لجنة الاستخدام" و "المعاهد الوطنية للصحة الحيوانية العناية". أساليب القتل الرحيم يجب أن تكون متسقة مع جميع الأنظمة الوطنية والمؤسسية.
1-الكشف عن ميتوفاجي في الخلايا البشرية
- الكشف عن ميتوفاجي باستخدام بلازميد كيما طن متري
ملاحظة: البروتين كيما، تنصهر فيها إشارة هدف الميتوكوندريا، والمبسطة طن متري-كيما، أثبت جدواه في فيفو الكشف ميتوفاجي. mt-كيما هو بروتين فلوري راتيوميتريك حساسة لدرجة حموضة الذي يسلك الفلورية الخضراء (الإثارة 458 نانومتر) في الشروط الأساسية أو محايدة والأسفار أحمر (الإثارة 561 nm) في الظروف الحمضية....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الكشف عن ميتوفاجي في خلايا الإنسان:
استخدام الإجراء المعروضة هنا، تم transfected خلايا هيلا الإنسان مع بلازميد كيما طن متري. خلايا صحية أثبتت شبكة منظمة تنظيماً جيدا المتقدرية (بروتينات فلورية خضراء، 488 نانومتر) مع حالات قليلة من ميتوفاجي (طلب تقديم العروض، 561 nm). ومع ذلك، الخلايا pretreated مع أونكوبلير الميتوكوندريا فككب (30 ميكرومتر ح 3) أظهرت زيادة قدرها عميقة في الإصابة ميتوفاجي (الشكل 1A). وتم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وتطالب تقنيا دقيقة لقياس ميتوفاجي. وهنا، وقد قدمنا العديد من التقنيات القوية التي تسمح لكلا كشف ميتوفاجي النوعي والكمي لمستويات ميتوفاجي في النماذج التجريبية الأكثر شيوعاً في المختبر.
للحصول على بيانات قابلة للنسخ المتماثل، ضروري تصميم تجريبي مع تكرار البيولوجية ثلاثة على الأقل. يجب أن يكون أعمى جميع الباحثين المشاركين في التجريب والتحليل للهويات المجموعة التجريبية. وعلاوة على ذلك، التصوير الحقول يجب عشوائياً اختيار أثناء الحصول على الصور. خلية ثقافة ودراسات C. ايليجانس ، ينبغي إجراء .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
وقد المختبر بور CRADA الترتيبات مع تشروماديكس وجلاكسو سميث كلاين.
شكر وتقدير
ونحن نشكر الدكتور أتسوشي ميياواكي والدكتور ريتشارد ج. يول لتقاسم بلازميد كيما طن متري وطن متري-كيما المتكاملة خلايا هيلا. ونحن نشكر حسام ألف شآمنا والدكتورة ديبورا لام كروتو لقراءة نقدية من المخطوطة. هذا البحث يدعمه "برنامج البحوث الداخلية" "المعهد الوطني للصحة" (فب)، منح المعهد الوطني للشيخوخة، فضلا عن الفترة 2014-2015 ومختبر داخل 2016-2017 نيا (EFF، فب). وأيده ممثل المؤسسة "ﻷمراض هيلسي" سور--معاهدة الفضاء الخارجي (رقم المشروع: 2017056) و "مجلس البحوث في النرويج" (رقم المشروع: 262175).
مساهمات مقدم البلاغ:
المؤسسة تصميم المخطوطة وإعداد المشروع؛ KP، NS، EMF، RDS، جسك، ساك، YH واد كتب مقاطع مختلفة من الورقة؛ NT، JP، ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| mt-Keima mouse | Jackson Laboratory | ||
| Lipofectamine 2000 كاشف تعداء الحمض النووي | Thermofisher | # 11668027 | |
| Opti-MEM medium (Gibco) | Thermofisher | # 31985062 | متوسط خال من المصل |
| mtKemia البلازميد: pCHAC-mt-mKeima | addgene | # 72342 | |
| COXII الجسم المضاد (الفأر) | abcam | #ab110258 | |
| الجسم المضاد LAMP2 (أرنب) | NOVUS | ||
| الماعز المضاد للأرانب بطول موجي 568 نانومتر من البروتين الفلوري الأحمر (RFP) | Thermofisher | #Z25306 | Alexa Fluor 568 صبغة |
| الماعز المضادة للفأر بطول موجي 488 نانومتر من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) | Thermofisher | #Z25002 | صبغة Alexa Fluor 488 |
| تطيل الذهب المضاد للتلاشي مع DAPI | Invitrogen | #P36931 | |
| 6 آبار لوحة | SIGMA Corning Costar | #CLS3516 | |
| غرفة 4 آبار | THermofisher ، Nunc Lab-Tek | # 171080 | |
| Nunc F 96-well لوحة | Thermofisher | # 152038 | |
| LC3B أجسام مضادة للأرانب | NOVUS | #NB100-2220 | |
| الحمض النووي الأجسام المضادة | Progen Biotechnik | #anti-DNA الفأر أحادي النسيلة ، AC-30-10 | |
| DAPI | Thermofisher | #D1306 | وسيط تركيب مضاد للبهتان مع |
| محلل خلية DAPI IN (قارئ الفلورسنت) GE | Healthcare Life | Sciences#IN محلل الخلية 2200 | |
| Eclipse TE-2000e مجهر متحد البؤر | Nikon | #TE-2000e | |
| برنامج Colocalization Volocity | #Volocity 6.3 | برنامج Zeiss ZEN 2012 البديل | |
| IN برنامج محقق الخلية | GE Healthcare Life | Sciences # 28408974 | |
| وسط زراعة الخلايا | Thermofisher | #DMEM– Dulbecco's Modified Eagle Medium | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL) | Thermofisher | # 15140122 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma-Aldrich | #12003C-1000ML | |
| حاضنة ثقافة الخلايا | Thermofisher | #Thermo Forma 3110 CO2 حاضنة | |
| مجهر epifluorescence | Zeiss Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| الكاميرا | أوليمبوس | أوليمبوس DP71 | |
| المجهر متحد البؤر | زايس | زايس أكسيو أوبزرفر Z1 | |
| برنامج متحد البؤر | Zeiss | ZEN 2012 | |
| برنامج تحليل الصور | الصورة J | تحليل التوطينية ، إلخ | https://imagej.nih.gov/ij/ |
| برنامج التحليل الإحصائي | GraphPad Software Inc. ، سان دييغو ، الولايات المتحدة الأمريكية | مادة حزمة برنامج GraphPad Prism | |
| لجعل دودة تختار | Surepure Chemetals | # 4655 | يتكون الانتقاء من 30 مقياس 90٪ بلاتين 10٪ سلك إيريديوم |
| IR: N2 ؛ Ex [pmyo-3< / em> TOMM-20:: Rosella] | استفسار مادي ل Tavernarakis Nektarios | الحفاظ على المعدلة وراثيا عند 20 درجة ؛ ج | |
| الأشعة تحت الحمراء: N2 ؛ على السبيل [pdct-1< / em> DCT-1 :: GFP ؛ pmyo-3< / em> DsRed :: LGG-1] | الاستفسار المادي إلى Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3< / em> TOMM-20 :: Rosella | استفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios | ||
| pdct-1< em> DCT-1 :: GFP | الاستفسار عن المواد إلى Tavernarakis Nektarios | ||
| pmyo-3< / em> DsRed:: LGG-1 | الاستفسار عن المواد لحل Tavernarakis Nektarios | ||
| Paraquat | انظر البيانات التكميلية لإعداد | ||
| المخزن المؤقت M9 | انظر البيانات التكميلية لإعداد | ||
| المخزن المؤقت M9-levamisole | انظر البيانات التكميلية للتحضير | ||
| المجهر الزجاجي والأغطية | فيشر | العلمية#B9992000 | |
| ملقط جراحي | STERIS Animal Health | 19 قطعة حزمة تعقيم مقص جراحي اقتصادي | |
| STERIS Animal Health | 19 قطعة حزمة تعقيم الاقتصادية | ||
| 1x PBS | Thermofisher | #AM9625 | يجب تخفيف 10x PBS إلى 1x PBS باستخدام ddH2O |
| شاكر | فيشر العلمي | # 11-676-178 | Thermo Scientific MaxQ HP منضدية مدارية صغيرة في الهواء الطلق منصة شاكر حزمة 2 |
| وسادة الاغاروز | انظر البيانات التكميلية للتحضير | ||
| شفرات الاهتزاز | الأدوات الدقيقة العالمية | #BLADES-2 | معدني أحادي الحافة |
| MSC | # 78803988 | 0.012 بوصة سميكة × 6 بوصة عرض × 12 بوصة ، 430 صفائح الفولاذ المقاوم للصدأ | |
| Triton X-100 | منظف | ||
| ميثيل ثنائي كلوريد الفيولوجين هيدرات | سيجما ألدريتش | # 856177 | حاضنة باراكوات |
| للديدان الخيطية | حاضنة أكواליטيك | للحفاظ على 20 درجة ؛ C | |
| تشريح المجهر المجسم | أوليمبوس | SMZ645 | |
| المجهر متحد البؤر | Zeiss | AxioObserver Z1 | للديدان الخيطية (الخطوة 2) مجهر |
| epifluorescence | Zeiss | AxioImager Z2 | للديدان الخيطية (الخطوة 2) |
| الأشعة فوق البنفسجية المتشابكة | Vilber Lourmat | BIO-LINK & ndash ؛ مصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية BLX-E365 | ؛ 356 نانومتر |
المراجع
- Fang, E. F., et al. Nuclear DNA damage signalling to mitochondria in ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (5), 308-321 (2016).
- Scheibye-Knudsen, M., Fang, E. F., Croteau, D. L., Wilson, D. M. 3rd, Bohr, V. A. Protecting the mitochondrial powerhouse. Trends Cell Biol. 25 (3)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
