أساليب للأس الهيدروجيني "التصوير داخل الخلايا" من "سلالة الخلايا الجذعية جريب" في "أنسجة المبيض" المورفولوجية لايف

ملخص

نحن نقدم بروتوكولا للتصوير pH داخل الخلايا النسب طلائي الخلايا الجذعية في أنسجة المبيض المورفولوجية حية. يصف لنا طرق لتوليد الذباب وراثيا معربا عن بيوسينسور درجة الحموضة، mCherry::pHluorin، والصورة بيوسينسور استخدام imaging fluorescence الكمية وتوليد المنحنيات القياسية، وتحويل قيم الكثافة الأسفار لقيم الأس الهيدروجيني.

الملخص

التغيرات في درجة الحموضة داخل الخلايا (pHi) دوراً هاما في تنظيم العديد من الوظائف الخلوية، بما في ذلك التمثيل الغذائي وانتشار والتمايز. عادة، يتم تحديد ديناميات pHi في الخلايا المستزرعة، وقابلة للقياس والتلاعب pHi تجريبيا. ومع ذلك، مؤخرا تطوير الأدوات والمنهجيات الجديدة جعلت من الممكن لدراسة ديناميات pHi داخل أنسجة سليمة، ويعيش. للبحوث المورفولوجية ، وكان أحد التطورات الهامة توليد خط المحورة وراثيا تحمل biosensor pHi، mCherry::pHluorin. هنا، يمكننا وصف بروتوكول التي نستخدمها بشكل روتيني للتصوير أوفاريوليس المورفولوجية حية لقياس pHi في نسب الخلايا الجذعية (FSC) جريب الظهارية في خطوط المعدلة وراثيا البرية نوع mCherry::pHluorin؛ ومع ذلك، الأساليب الموصوفة هنا يمكن تكييفها بسهولة للأنسجة الأخرى، بما في ذلك أقراص الجناح وظهاره العين. يصف لنا تقنيات للتعبير عن mCherry::pHluorin في النسب منتدى التعاون الأمني، المحافظة على أنسجة المبيض أثناء التصوير، والعيش واكتساب وتحليل الصور للحصول على قيم pHi.

المقدمة

كشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا بدور للتغييرات في pHi خلال الخلوي والتمايز وخلل التنسج في فيفو^1،2. تبين هذه الدراسات أن pHi يتسق ملحوظ في الخلايا من نفس النوع في نفس المرحلة من التمايز، ولكن أن يتحول كما الخلايا الانتقال من مرحلة إلى أخرى. وفي بعض الحالات، منع التغييرات في pHi جزئيا يعطل التمايز، مما يوحي بأن التغيير في pHi ليس فقط كنتيجة للتغييرات في مصير الخلية ولكن بدلاً من ذلك يساعد على تشجيع التغيير في مصير الخلية، ربما من خلال الآثار على الأس الهيدروجيني الحساسة التنظيمية بروتينات أو التفاعلات الكيميائية المطلوبة للمفاضلة. دراسات المستقبل لديها القدرة على الكشف عن مزيد من التبصر في أدوار مختلفة ك....

البروتوكول

ملاحظة: لقياس pHi في النسب منتدى التعاون الأمني، حساب نسبة كثافة fluorescence فلورين إلى مشري في التابعة، والهيدروكربونات المشبعة بالفلور، والخلايا جريب في الظروف الفسيولوجية، وتحويل القيم pHi مع معيار النسب منحنيات المعايرة لكل خلية اكتب ⁷. وتجري تجارب التصوير الأولى، ويعيش لقياس كثافة fluorescence فلورين ومشري في تشريح في المخزن مؤقت الذي يحتوي على ناكو ₃، الذي يحاكي الظروف الفسيولوجية ^{1 ،} جيرماريا ⁷-المنحنيات القياسية التالية، ويتم إنشاؤها بواسطة قياس كثافة fluorescence فلورين ومشري في غ ⁺-ك ⁺ المخزن المؤقت الذي يحتوي على نيجيريسين ionophore الحرة....

النتائج

هنا لقد قمنا بوصف عملية قياس pHi في ظهارة جريب، التي تنطوي على عدة خطوات. أولاً، يتم تشريح المبيض من الذباب من النمط الوراثي المناسب باستخدام أدوات تشريح وتركيب (الشكل 1). يتم تصويرها في أوفاريوليس ثم استخدام مجهر الأسفار الكمية ويتم تحليل الصور للحصول على قياسات pHi. لكل صورة، يتم تعريف أنواع الخلية من الفائدة كما هو موضح في القسم 3.1 (الشكل 2). يتم تحويل نسبة شدة الأسفار في قنوات التجارة والنقل ومشري pHi القيم باستخدام منحنى قي.......

المناقشة

هنا، يمكننا وصف طريقة لقياس أي الخلايا في النسب منتدى التعاون الأمني داخل الأنسجة wildtype. تم تطوير هذا البروتوكول وصقلها على مدى السنوات الخمس الماضية، منذ أن بدأنا أولاً بدراسة pHi في أنسجة المبيض المورفولوجية . وخلال ذلك الوقت، استخدمت بنجاح البروتوكول المحققين متعددة في لدينا مختبر ومالا يقل عن أربعة قرص مختلفة للغزل والليزر مجاهر المسح. إمكانية تكرار نتائج ملاحظتنا الأصلي، أن الزيادات pHi كالتفريق بين الخلايا في النسب منتدى التعاون الأمني من الخلايا الجذعية للهيدروكربون إلى جريب الدولة الخلية، وعبر هذه الت.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي>ذبابة الأسهم
UAS-mCherry::p Hluorin[1]
y1 ث *; P {GawB} 10930 / CyO	Bloomington Stock Center	7023
Act-Gal4 Flipout stock	Center	4409
Name	Company	Catalog Number	Comments
>Chemicals for Buffer Preparation
كلوريد الصوديوم	سيجما ألدريتش	S5886
KCl	سيجما ألدريتش	P-3911
الجلوكوز	Mallinckrodt	4912
هيبس	ثيرمو فيشر العلمي	BP310
MgSO4	ثيرمو فيشر Scientific	M63
CaCl2	سيجما ألدريتش	C-5080
HCO3	Sigma Aldrich	S-5761
MgCl2	Sigma Aldrich	M-9272
NMDG +	Sigma Aldrich	M-2004
K2HPO4	Mallinckrodt	7088	استخدم لصنع KHPO4 درجة الحموضة 7.4
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362	استخدم لصنع KHPO4 درجة الحموضة 7.4
Concanavalin A ، Alexa Fluor 647 Conjugate	Thermo Fisher Scientific	C21421	0.25 ملغ / مل التخفيف
Nigericin	Thermo Fisher Scientific	N1495
Name	Company	Catalog Number	Comments
Analysis and Install tools
2 Dumont ملقط إينوكس (مقاس 5)ملقط	Thermo Fisher Scientific	NC9473431
2 إبر حقنة قياس 23	سيجما ألدريتش	Z192457
طبق تشريح زجاجي 9 آبار	Thermo Fisher Scientific	13-748B
فراغ الشحوم	داو كورنينج	1018817
22 × 40 ملم أغطية زجاجية	Thermo Fisher Scientific	12545C
أغطية زجاجية مستديرة ، قطر 12 مم ، سمك 0.13-0.16 مم	Ted Pella، Inc.	26023
غرفة تركيب ثلاثية الأبعاد	مخصصة		و ملفات .ipt للطابعة ثلاثية الأبعاد مدرجة كملفات تكميلية
<قوي>الاسم	الشركة	Catalog Number	Comments
معدات أخرى
مقياس الأس الهيدروجيني	ثيرمو فيشر العلمي	13-620-183A	الموديل: Accumet AB15
مجهر تشريح	أوليمبوس كوربوريشن	0H11436	الموديل: SZ2-ST
مجهر متحد البؤر	Leica Biosystems		SP5 أو SP8 مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مع هدف 40 مرة بفتحة عددية 1.3

مصنعة.stl