تنشأ من أقبية كله الثقافات أورجانويد المعوية ولا تسمح التحليل الذاتي تجديد والتمايز بطريقة خاصة بالخلية. ويصف هذا البروتوكول إعادة تشكيل الجذعية تم فرزها (Lgr5+) ومكانه الخلايا (بانته)، والتي تؤدي إلى أورجانويدس حين تمكينهم من قبل التعديل البيوكيميائية والوراثية والتحليل الوظيفي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحليل إعادة تشكيل أورجانويد (ORA) للتحليل الوظيفي الجذعية المعوية وخلايا متخصصة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ظهارة الأمعاء تتميز بمعدل دوران سريع للغاية. في الثدييات، ويتم تجديد البطانة الظهارية الكامل خلال 4-5 أيام. الخلايا الجذعية البالغة المعوية الموجودة في الجزء السفلي من الخبايا Lieberkühn، وتخصص بالتعبير عن الجين Lgr5 ، والحفاظ على التوازن من خلال ما مميزة ارتفاع معدل التكاثري1. في جميع أنحاء الأمعاء، Lgr5+ يختلط الخلايا الجذعية مع الخلايا الافرازية المتخصصة تسمى الخلايا بانته. بانته الخلايا تفرز المركبات المضادة للبكتيريا (أيليسوزيمي وكريبتدينس/ديفينسينس)، وممارسة دور المسيطر على النباتات المعوية. في الآونة الأخيرة، تم اكتشاف وظيفة جديدة للخلايا بانته، وهي قدرتها على توفير الدعم المتخصصة بالخلايا الجذعية Lgr5+ من خلال عدة يغاندس الرئيسية ك Wnt3 ولو Dll12.
عندما عزل السابقين فيفو ومثقف حضور عوامل نمو محددة وعناصر المصفوفة خارج الخلية، الخبايا المعوية كله يؤدي إلى المعمرة والذاتي تجديد هياكل ثلاثية الأبعاد تسمى أورجانويدس التي تشبه جداً السرداب-زغابة هندسة الظهارية من الكبار الأمعاء الدقيقة3. الثقافات أورجانويد، عندما أنشأت من أقبية كله، تسمح دراسة التجديد الذاتي، والتفريق بين مكانة الخلايا الجذعية المعوية، على الرغم من دون التصدي لمساهمة مكوناتها الفردية، إلا وهي Lgr5+ و الخلايا بانته.
هنا، نحن تصف نهجاً جديداً للانزيم أورجانويد أن يستفيد من قدرة بانته و Lgr5+ الخلايا للمنتسبين وشكل أورجانويدس عندما شارك مثقف. هذا النهج، الذي يشار إليه هنا "أورجانويد إعادة الفحص" (أورا)، يسمح بتعديل الوراثية والبيوكيميائية بانته أو Lgr5+ الخلايا الجذعية، تليها إعادة تشكيل في أورجانويدس. على هذا النحو، فإنه يسمح للتحليل الوظيفي للعنصرين الرئيسيين في مكانة الخلايا الجذعية المعوية.
المقدمة
ظهارة الأمعاء هو الأكثر سرعة الذاتي تجديد الأنسجة في جسم الثدييات، وقد تم على هذا النحو، هدفا لعدد كبير دراسات الرامية إلى تحديد وتوصيف وظيفي للخلايا الجذعية البالغة الذين يقيمون في الجزء السفلي من سرداب من Lieberkühn، اعتماداً على إشارات Wnt المتعارف عليه1والمخصصة بالتعبير عن الجين Lgr5 . جدير بالذكر أن الخلايا الجذعية Lgr5+ الذي كان واقفاً وتدعمها الخلايا المتخصصة المتخصصة، أي خلايا بانيث، التي تعتمد أيضا على Wnt يدل على نضوج2. معا، هذه أنواع الخلايا اثنين تكمن وراء الذاتي تجديد البطانة الظهارية المعوية والحفاظ على توازن التماثل الساكن اليومي: Lgr5+ تقسيم الخلايا الجذعية سريعاً، وأن تؤدي إلى السلف وأكثر تخصصا الأمعاء الظهارية الخلايا؛ خلايا بانته توفر عوامل أساسية متخصصة (مثلاً، لو Dll1، Wnt3،) إلى Lgr5+ الخلايا الجذعية2. تم استغلاله كأداة تجريبية لتوفير نظرة ثاقبة العمليات مثل الذاتي تجديد قدرة الخبايا المعوية عند مطلي السابقين فيفو لتشكيل هياكل المنظمة وتجديد ذاتي يسمى أورجانويدس، أو "ميني-الشجاعة"، و التباين في الظروف العادية والمرضية بما في ذلك السرطان4. وقد أقيمت الثقافات أورجانويد من أنسجة عدة، بما في ذلك الأمعاء، البنكرياس، والكبد والكلى، ومن الماوس والعينات البشرية4. طريقة استخراج وعوامل النمو المستخدمة لتطوير هذه الثقافات أورجانويد الخاصة بالانسجة والمصممة لدفع التمايز النسب المتعددة وتحاكي أكبر قدر ممكن من الخلايا الجذعية مكانة الأصلي المجراة في. وقد أورجانويدس التطبيقات المحتملة بما في ذلك معالجة الأمراض الوراثية، وتقييم الفعالية العلاجية في السرطان، وتحليل المخدرات سمية، أو دراسة organogenesis في المختبر5.
عموما، القيد الرئيسي للثقافات أورجانويد عندما أنشأت من عينات الأنسجة عدم التحديد في الخلية. على سبيل المثال، لا تسمح أورجانويدس المعوية المنشأة من الخبايا المعوية كله تحليل المكونات الخلوية الفردية ضمن المصدر الأنسجة (مثلاً، تحتوي على الأقبية كلها Lgr5+، بانته، و الخلايا السلف).
هنا، يمكننا وصف أسلوب رواية، يشار إلى أورا، الذي يجمع بين مزايا الثقافات أورجانويد المعوية مع التحليل الوظيفي لعناصرها الأساسية، إلا وهي الجذعية (Lgr5+) والخلايا المتخصصة (بانته). ويتحقق ذلك من خلال قدرة فريدة من نوعها بانيث والخلايا Lgr5+ المنتسبين فعلياً مع بعضها البعض عندما شارك المحتضنة وتؤدي إلى أورجانويدس2،،من610. ونحن استغل هذه الميزة وقبل يعامل أنواع الخلايا اثنين على حدة قبل السماح لهم بتشكيل أورجانويدس. عند القيام بذلك، يمكن أن يتعرض كل مكون من مكونات الخلية لأي المخدرات معين أو عامل النمو، مثبط البيوكيميائية، التعديل الوراثي أو العلاج الكيميائي قبل إعادة تشكيل وتكوين أورجانويد. ولذلك، استخدام مقايسة أورا سوف تسمح للبت في ما إذا كان العلاج من المخدرات محددة أو التحوير الوراثي له تأثير محددة على الخلايا الجذعية أو نظيرتها المتخصصة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد فعلت جميع الإجراءات وفقا للقوانين المحلية الرفق بالحيوان، والمبادئ التوجيهية.
1-إعداد أدوات ووسائط الثقافة وأطباق
- مجموعة اﻷوتوكﻻف 1 مقص المعوية، ومقص عادي والملقط في حاوية معقمة.
- 96-فضلا عن مكان (مسطحة القاع) طبق في حاضنة في 37 درجة مئوية.
- إعداد 10 مل من إكمال الثقافة المتوسطة مع الكواشف المسرودة في الجدول للمواد.
- احتضان المتوسطة كاملة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
- ذوبان الجليد تشكيل الغشاء بوضعه في دلو الجليد. سوف يصبح الغشاء الطابق السفلي المعاد تشكيلها السائل في 4 درجات مئوية.
- ملء 4 أطباق بيتري مع المياه المالحة الباردة مخزنة الفوسفات أو برنامج تلفزيوني المختصر (4 درجات مئوية).
2-عزل الأقبية الأمعاء الصغيرة
- التضحية باستنشاق أول أكسيد الكربون2 ماوس Lgr5-اجفب-إيريس-كريرt2 على خلفية C57BL6/ي. تشريح الصفاق طوليا مع زوج من مقص.
- عقد المعدة مع الملقط وقطع عليه مستعرضة في نصف.
- باستخدام مقص المعوية من الآن فصاعدا، سحب الأمعاء ووضعه في طبق بتري يحتوي على برنامج تلفزيوني.
ملاحظة: لديك مقص معوي حاد وتلميح غير حادة. تلميح هذه المقصات حادة يراد لا تضر العمارة سرداب-زغابة أثناء فتح الأمعاء. - ابدأ بوضع الحافة حادة في المعدة ودفعها بلطف من خلال بواب. المضي قدما من خلال قطع بالمقص وسحب مع الملقط.
- بمجرد فتح الأمعاء الدقيقة كلها طوليا، غسله في برنامج تلفزيوني الباردة خلال عقد مع الملقط وشطفه برفق في حل برنامج تلفزيوني مع الحركات على شكل U.
- مرة واحدة يتم مسح جميع مخلفات البراز، انتقل إلى تسطيح الأمعاء على قطع مجلس، لومينال الجانب الأعلى. الجانب لومينال يتم التعرف عليها بسهولة بغياب الأوعية الدموية ومظهره الباهت بالمقارنة مع الجزء الخارجي.
- مع شريحة زجاجية، بلطف إزالة الزوائد بتجريف الأرض الأمعاء. تنفيذ هذه الخطوة مرتين على طول كامل للأنسجة.
- قطع الأمعاء الدقيقة مع شفرة جراحية معقمة إلى قطع 2-5 ملم.
- ضع أجزاء الأمعاء الصغيرة في أنبوب 50 مل تحتوي على 10 مل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
- تنظيف الأجزاء الأنسجة، إزالة أية شوائب المتبقية التي بيبيتينج عليها صعودا وهبوطاً في برنامج تلفزيوني. تجاهل المادة طافية وكرر هذه الخطوة حتى برنامج تلفزيوني واضح تماما.
- إضافة برنامج تلفزيوني الباردة 15 مل، لتحقيق الحجم الإجمالي النهائي لبرنامج تلفزيوني إلى 25 مل. إضافة حمض الإيثيلين 2 مم (يدتا) واحتضانها لمدة 45 دقيقة على اسطوانة في 4 درجات مئوية.
- تجاهل برنامج تلفزيوني/يدتا.
- أضف 10 مل من برنامج تلفزيوني، وفصل في الأقبية بقسوة بيبيتينج أجزاء الأنسجة صعودا وهبوطاً (ثلاث مرات على الأقل). جمع المادة طافية.
- كرر الخطوة 2.13 أربع مرات. إضافة الثقافة المتوسطة للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 50 مل.
- بيليه الخلايا بالطرد المركزي (300 غرام x لمدة 5 دقائق).
- ريسوسبيند بيليه في 10 مل من الثقافة المتوسطة وبيليه في الأقبية بالطرد المركزي (80 x ز لمدة 3 دقائق).
3. إعداد وحيد الخلية
- تجاهل المادة طافية أقبية الأعلاف وريسوسبيند لهم في 1 مل التربسين مثل الإنزيمات جنبا إلى جنب مع 50 ميليلتر الدناز (50 ميكروغرام/مل).
- احتضان الخلايا في حمام مائي عند 32 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- أضف 10 مل من الثقافة المتوسطة. ننأى الأقبية في الخلايا المفردة بقسوة بيبيتينج صعودا وهبوطاً 5 مرات على الأقل.
- تصفية الحل من خلال مصفاة 40 ميكرومتر (التخلص من كتل وغيرها من الشوائب) وبيليه الخلايا المفردة في 300 غرام x لمدة 5 دقائق.
4-التدفق الخلوي والطلاء
- إعداد 50 مل الحل الملح مخزنة في هانك x 1 أو HBSS/2% البقر الجنين المصل (FCS) الحل وريسوسبيند بيليه في 1 مل لكل 10 من6 خلايا
- إضافة إلى خلية تعليق لين BV421– (CD31، CD45، TER119) بتركيز 1: 100، و CD24-آسيا والمحيط الهادئ و CD117-PE على حد سواء بتركيز 1: 250 الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة.
- نوع Lgr5+ الخلايا الجذعية والخلايا بانته إلى انخفاض منفصلة ربط الأنابيب. لمزيد من التفاصيل حول الفرز بروتوكولات من أجل Lgr5+ وخلايا بانته، يرجى الاطلاع على روث et al. 7 و Schewe et al. 6
- أجهزة الطرد المركزي خلايا تم فرزها في ز 300 x للحد الأدنى 5 ريسوسبيند الخلايا في 100 ميليلتر المتوسطة مع المكونات المذكورة كما هو الحال في 1.3 (انظر الجدول للمواد).
- (مثلاً، بتعديل المواد الكيميائية أو الوراثية) علاج الخلايا بانته (n = 2000) أو الخلايا الجذعية Lgr5+ (n = 2000).
- لعلاج الخلايا، استخدم 5 ميليلتر من تعداء الحويصلية بوساطة كاشف في إجمالي حجم 100 ميليلتر ثقافة متوسطة وصغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA) بتركيز 100 نانومتر. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية ل siRNA أو الوقت اللازم للتعديل الذي تم اختياره.
- تغسل الخلايا مرتين في 500 ميليلتر الثقافة المتوسطة.
- الطرد المركزي في 300 غرام x لمدة 5 دقائق وريسوسبيند الخلايا في 10 ميليلتر الثقافة المتوسطة.
- تجمع العنصرين الخلوية (بانته أو Lgr5+ الخلايا) في الحجم الإجمالي ميليلتر وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت 20
- شارك احتضان بانته والخلايا Lgr5+ لمدة 10 دقائق في الرايت
- إزالة 10 ميليلتر من المادة طافية وترك غضروف السائل للتأكد لم نضح بيليه الخلية.
- إضافة 30 ميليلتر من الغشاء المعاد تشكيلها للخلايا لإجمالي حجم 40 ميكروليتر، ريسوسبيند الخلايا ولوحة في لوحة جيدا 96 المعالجون مسبقاً. بعد 10 دقيقة، إضافة 200 ميليلتر من المتوسطة كاملة (انظر الجدول للمواد). تغير متوسط كل 48 ساعة.
- عد تعدد أورجانويد في اليوم الخامس.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يسمح التحليل إعادة تشكيل أورجانويد تحليل المكونات الأساسية المتخصصة والخلايا الجذعية ظهارة الأمعاء، أثبت هنا صغيرة تدخل الجيش النيبالي الملكي (siRNA) الجين Apc وظيفية منفصلة.
لتحقيق هذا الهدف، علينا أولاً تستخدم خلية تنشيط الفلورسنت الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لفصل 8000 Lgr5+ الخلايا والخلايا بانته 6000 من الفطرية C57BL6/ياء الفئران. ويرد في الشكل 1 ألف، مخطط ان...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أورا يسمح التحليل الوظيفي المكرر المكونات الأساسية اثنين من مكانة المعوية الخلايا الجذعية، هي خلايا بانته و Lgr5+ . هذا النهج قد استخدمت سابقا من قبل لنا ولغيرنا مع تعديلات طفيفة6،،من1011. نقدم هنا، الإجراء أورا كبروتوكول مختبر استنساخه وموحدة. أيضا، ونحن تقريرا عن آثار downregulation Apc في الخلايا الجذعية Lgr5+ ، كمثال على إمكانية تنفيذ الوراثية (أو البيوكيميائية
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفين لها أي مصلحة مالية المتنافسة أو غيرها تضارب المصالح
شكر وتقدير
وأمكن هذه الدراسة بتمويل من "جمعية السرطان الهولندية" (كوف؛ EMCR 2012-5473) و "العالم السرطان البحث الصناديق الدولية" (WCRF؛ المشروع رقم 2014-1181)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM F12 المتقدم * | ثيرمو فيشر Scientific | 12634-010 | |
| Glutamax * | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | التركيز النهائي: 10 ملي مولار |
| البنسلين / الستربتومايسين * | 15140122 Thermo Fisher Scientific | التركيز النهائي: 1٪ | |
| هيبس * | 15630080 ثيرمو فيشر العلمي | التركيز النهائي: 10 ملي | |
| الفئران المؤتلفة EGF * | Thermo Fisher Scientific | PMG8041 | التركيز النهائي: 50 نانوغرام / مل |
| الفئران المؤتلفة Noggin * | Peprotech | 250-38 | التركيز النهائي: 100 نانوغرام / مل |
| y27632 * | Sigma | Y0503 | التركيز النهائي: 10 & micro ؛ M |
| Jagged-1 * | Anaspec Bio | AS-61298 | التركيز النهائي: 1 & micro ؛ م |
| الفئران المؤتلف R-spondin * | R & أنظمة D | 3474-RS-050 | التركيز النهائي: 1 مجم / مل |
| محلول جيني فليكسيتوب siRNA APC | Qiagen | GS11789 | التركيز النهائي: 100 نانومتر |
| ليبوفيكتامين 2000 | ثيرمو فيشر ساینتفيك | 11668019 | |
| CD24 APC | Biolegend | 101814 | |
| c-kit PE | Biolegend | 105808 | |
| BV 421 CD31 | Biolegend | 102424 | |
| BV 421 CD45 | Biolegend | 103134 | |
| BV421 TER119 | Biolegend | 116234 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 14180046 | |
| B6.129P2-Lgr5tm1 (cre / ERT2) | مختبرات | Jackson 008875 | |
| أنابيب ربط منخفضة | Eppendorf | Z666548-250EA | |
| Matrigel | Corning | 356230 | |
| * يشكل الجمع بين هذه الكواشف وسيط |
المراجع
- Barker, N., et al. Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5. Nature. 449, 1003-1007 (2007).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165, 1586-1597 (2016).
- Cantrell, M. A., Kuo, C. J. Organoid modeling for cancer precision medicine. Genome Med. 7, 32(2015).
- Schewe, M., et al. Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer. Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).
- Roth, S., et al. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury. PLoS One. 7, e38965(2012).
- Rodriguez-Colman, M. J., et al. Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function. Nature. 543, 424-427 (2017).
- Dow, L. E., et al. Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer. Cell. 161, 1539-1552 (2015).
- Yilmaz, O. H., et al. mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake. Nature. 486, 490-495 (2012).
- Igarashi, M., Guarente, L. mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction. Cell. , 436-450 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
