ويرد وضع بروتوكول لبناء إضاءة اختراق أنسجة لإيصال الضوء على كميات كبيرة مع الحد الأدنى من القطر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ويرد وضع بروتوكول لبناء إضاءة اختراق أنسجة لإيصال الضوء على كميات كبيرة مع الحد الأدنى من القطر.
ويصف هذا البروتوكول إضاءة الحجم الكبير، الذي تم تطويره للتلاعب أوبتوجينيتيك في الدماغ الرئيسيات غير البشرية. هو إضاءة ألياف الضوئية بلاستيكية معدلة مع تلميح محفوراً، مثل أن يكون الضوء التي تنبعث منها مساحة السطح > 100 × من الألياف التقليدية. هذا البروتوكول بالإضافة إلى وصف بناء إضاءة كبيرة الحجم، تفاصيل معايرة مراقبة النوعية المستخدمة لضمان التوزيع حتى الخفيفة. علاوة على ذلك، يصف هذا البروتوكول تقنيات لإدراج وإزالة إضاءة الحجم الكبير. قد تكون مضيئة هياكل كل سطحية وعميقة. إضاءة هذا الحجم الكبير لا تحتاج إلى يكون جسديا بالإضافة قطب، ونظرا لأن إضاءة مصنوعة من البلاستيك، ولا من الزجاج، سوف ببساطة ينحني في الظروف عندما سوف تتحطم الألياف الضوئية التقليدية. لأن يسلم هذا إضاءة الضوء على مدى حجم الأنسجة سلوكيا ذات الصلة (≈ 10 ملم3) مع لا ضرر اختراق أكبر من ألياف الضوئية تقليدية، ويسهل الدراسات السلوكية باستخدام أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية.
أدوات أوبتوجينيتيك، والتي تسمح بتحكم العصبية دقة ميلي ثانية واحدة، ويحركها الضوء تستخدم على نطاق واسع لدراسة الفيزيولوجيا الوظيفية والسلوك في القوارض واللافقاريات. ومع ذلك، محدودة التحديات التقنية استخدام أوبتوجينيتيكس في الدماغ الرئيسيات غير البشرية، والتي لديها وحدة تخزين ~ 100 × أكبر من الدماغ القوارض 1.
لتسهيل الدراسات أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية، صمم إضاءة لمعالجة الأهداف المتنافسة اثنين: كبر حجم الإضاءة واختراق أدنى ضرر. أن يأتي المحاولات السابقة لمعالجة أحد هذه الشواغل في تكلفة من الآخر. حزم من ألياف تضيء كميات أكبر ولكن مع زيادة القطر، ومن ثم الأضرار2،3. ألياف زجاجية مدبب تقليل أضرار الاختراق، لكن التركيز الضيق للضوء التي تنبعث منها المساحات السطحية < 100 ميكرومتر2 4،5. الإضاءة الخارجية الدماغ من خلال نافذة في دوراً تلتف التحدي المتمثل في الإيلاج الضرر ويجوز السماح لإنارة الحجم الكبير، ولكن يمكن استخدامه فقط ل مناطق الدماغ سطحية قليلة6.
لإنشاء إضاءة قطرها كبير الحجم والصغيرة (الشكل 1a)، حفرت غيض من البلاستيك البصرية الألياف هي الحرارة مدبب والكسوة وجوهر (الشكل 1، ج). خلافا لألياف مدبب أخرى أن يركز الضوء على نقطة ضيقة، يسمح النقش الخفيف للهروب بالتساوي على الجانبين من الطرف، ومن ثم، توزيع الضوء على نطاق واسع على مساحة كبيرة (الشكل 1 دوه). لأن أضرار الاختراق غير متناسب إلى القطر الاختراق، وإضاءة هذا لا أكثر ضررا من الاختراق من ألياف تقليدية، بعد فقد > 100 × الضوء التي ينبعث منها الضوء سطح المنطقة ويسلم على نطاق أوسع مع 1/100 سلطة خفيفة كثافة في دماغ وهمية (1.75% [اغروس]) (الشكل 1e). نموذج مونت كارلو (الشكل 1f) يوضح الفرق في ضوء انتشار بين ألياف تقليدية وإضاءة الحجم الكبير عندما يكون لديهم كثافات الطاقة الضوء متساوية كالضوء على انبعاث السطوح. يتم معايرة إضاءة كل على حدة استخدام مجالاً إدماج (الشكل 2 أ، ب) لضمان توزيع الضوء حتى على طول الحافة (الشكل 2 (ج)).
تم التحقق من هذا الحجم الكبير إضاءة مع التلاعب أوبتوجينيتيك السلوك وإطلاق الخلايا العصبية في المقدمات غير البشرية. يمكن تخصيص طول الألياف تلميح إلى أي منطقة في الدماغ، وإلى تعيين الحقل تقبلا الفردية كل الحيوانات. إضاءة يجوز أن يقترن قطب المخترقة لتسجيلات الخلايا العصبية التي تمتد على طول الإضاءة. علاوة على ذلك، نظراً لأنه يمكن أن تحمل هذه الألياف أي لون من الضوء المرئي، فإنه يمكن إقران مع أي من جزيئات أوبتوجينيتيك المتاحة المتوفرة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ملاحظة: جميع الإجراءات الحيوان تم وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة، وقد أقر "معهد ماساشوستس للجنة التكنولوجيا" في "العناية بالحيوان".
1-"تصنيع إضاءة"
2. إضاءة المعايرة ومراقبة الجودة
ملاحظة: تقييم هذه الأساليب للمعايرة للضوء الناتج غير الخطي على مسافات مختلفة من غيض الألياف. التفاوت في توزيع الضوء ينتج عادة عن “ وعرة ” أو “ مموج ” تفتق.
3-الإضاءة في فيفو
ملاحظة: هنا، تظهر هذه الأساليب باستخدام نموذج بلاستيك بدلاً من الرئيسيات غير البشرية-
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإضاءة لكميات كبيرة من الدماغ في المقدمات غير البشرية يسمح للتلاعب أوبتوجينيتيك سلوكيا ذات الصلة. أكر et al. (2016) تستخدم إضاءة هذا الحجم الكبير مع تحول الأحمر هالورهودوبسين، جوز 7 لدراسة مساهمة الزمانية الحقل العين أمامي (فف) الموجهة بالذاكرة ساككاديس في اثنين من القردة الريسوسي. على وجه التحديد، تم حقن مع ناقل فيروسية التي تحتوي على جوز فف الخلايا العصبية ومضيئة ثم مع استخدام إضاءة الحجم الكبير أثناء عرض الهدف أو فترة التأخير، أو فترة إعداد السيارات مهمة saccade الموجهة بذاكرة الضوء ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
بينما أوبتوجينيتيك أدوات تستخدم على نطاق واسع لدراسة الأمراض وعلم وظائف الأعضاء في القوارض، التحدي التقني منيرا الدماغ الكبيرة كميات محدودة استخدام أوبتوجينيتيكس في المقدمات غير البشرية. رائد الدراسات في القرود تستخدم كثافات الطاقة الخفيفة الكبيرة (~ 100 ميغاواط/مم2 إلى 20 واط/م2) لإلقاء الضوء على الكميات الصغيرة، وربما < 1 ملم3، والإبلاغ عن الآثار السلوكية متواضعة مع أوبسينس عليه في قشرة4، 9،،من
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
وتسلم LCA التمويل من زمالة ندسيج، جرفب جبهة الخلاص الوطني، وأصدقاء المعهد ماكغفرن. وتسلم الجيش الشعبي التمويل يونيس نورا آروب صندوق، فئة الصندوق آروب عام 1995 معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، هاري والصندوق آروب معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا. حساب الضمان باء تعترف بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة 2R44NS070453-03A1، بجائزة هارفي "الاتجار الدولي في الانبعاثات"، وجائزة مؤسسة روبرتسون الخلايا الجذعية في نيويورك. وتسلم RD التمويل من EY017292 المعاهد الوطنية للصحة. مايكل وليامز ساعد الفريق على تنظيم وجمع اللوازم قبل التصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الألياف الضوئية البلاستيكية | الألياف البصرية الصناعية | SK-10 | قطر 250 ميكرون ، متجرد الأسلاك خط Super Eska |
| أدوات كلاين | 11047 | 22 مقياس | |
| ملزمة المشبك | ويلتون | 11104 | عام طاولة جبل نائب المشبك |
| مسدس حراري مزدوج درجة | ميلووكي | 8975-6 | 570 / 1,000 درجة ؛ F |
| مختبر علامة | VWR | 52877 | |
| مجهر تشريح | VistaVision | 82027-156 | مجهر ستيريو مع ضوء متوهج مزدوج ، تكبير 2X / 4X ، متوفر من |
| شريط VWR Lab | VWR | 89097-972 | 4 عبوات من اللون البنفسجي ؛ ومع ذلك ، لا يهم لون الشريط |
| كربيد السيليكون | ThorLabs | LF5P | 5 ميكرون حصى ، 10 عبوات |
| لوح لف أكسيد الألومنيوم | ThorLabs | LF3P | 3 ميكرون حصى ، 10 عبوات |
| الألومنيوم اللف ورقة | ThorLabs | LF1P | 1 ميكرون حصى ، 10 عبوات |
| لوح لف ألومينا مكلس | ThorLabs | LF03P | 0.3 ميكرون حصى ، 10 عبوات |
| سكين ساخن | ألياف بصرية صناعية | IF370012 | 60 وات ، |
| نطاق | فحص الألياف الثقيلةThorLabs | FS201 | اختياري |
| من الفولاذ المقاوم للصدأ الطويق | الألياف البصرية | الدقيقة MM-FER2003SS-265 265 | ميكرون القطر الداخلي |
| 1 مل حقنة | BD | 14-823-30 | يفضل طرف Luer-lok لتقليل مخاطر التسرب ، ولكن ليس هناك حاجة ماسة |
| الايبوكسي | الألياف البصرية الصناعية | 40 0005 | |
| 18 إبرة حادة | قياس BD | 305180 | 1.5 بوصة |
| طول مناديل خالية من الوبر (KimWipe) | ThorLabs | KW32 | متاح من العديد من البائعين |
| رقائق امتصاص الضوء | ThorLabs | BKF12 | |
| الشريط الكهربائي | 3M | Temflex 1700 | اختياري ، قد يحل محل العلامات التجارية / الموديلات الأخرى |
| 26 قياس إبرة حادة ؛ | BD | 305111 | 0.5 بوصة طول |
| Micromanipulator | Siskiyou | 70750000E | قد يحل محل العلامات التجارية / الموديلات الأخرى |
| ذراع Steretactic | Kopf | 1460 | قد يحل محل العلامات التجارية / الموديلات الأخرى |
| نظارات السلامة بالليزر | KenTeK | KCM-6012 | يجب أن يتم اختيارها بناء على لون الليزر المستخدم ، على سبيل المثال المعطى هنا |
| الليزر أو مصدر الضوء الآخر | vortran | Stradus 473-50 | مثال على الليزر الأزرق |
| دمج المجال | ThorLabs | S142C | عداد الطاقة المرفق ، متوفر أيضا من ThorLabs ، البند #PM100D |
| غرفة تسجيل Ultem | Crist instrument | company 6-ICO-J0 | حسب الطلب مع محاذاة الشق |
| برج microdrive مع المشابك | NAN | DRTBL-CMS | |
| أنبوب التوجيه | مخصص | N / A | مصنوعة من إبرة شوكية قياس 25 (BD) أو أنابيب غير حادة |
| NAN نظام تشغيل | NAN NANDrive | ||
| تصميم شبكة مخصص | مخصصة | متاحة عند الطلب | |
| ملقط حاد | FischerScientific | 08-875-8A | ملقط حاد من الفولاذ المقاوم للصدأ عام ملاقط |
| رقمية | Neiko | 01407A | متوفر على amazon.com. قد تختار الفرجار بدقة أدق لقياسات أكثر دقة. |
| كابل التصحيح | ThorLabs | FG200LCC مخصص | هذا أحد الأمثلة على العديد من كبلات التصحيح الممكنة. طالما أن قطر الألياف أقل من أو يساوي قطر الألياف لمصباح الحجم الكبير وطالما أن واجهة الموصلات ، فإن أي كابل تصحيح (زجاج أو بلاستيك ، تم شراؤه أو صنعه في المختبر) مناسب لهذا التطبيق. |
| أغطية الغبار البلاستيكية الشفافة | ThorLabs | CAPF | حزمة من 25 |
| تزاوج منفصل من السيراميك | Precision Fiber Products، Inc. | SM-CS1140S |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.