والهدف من هذه المادة تقديم وصف مفصل للبروتوكول للمقايسة خبيث الرئوية (PuMA). هذا النموذج يسمح للباحثين لدراسة نمو الخلايا osteosarcoma المنتشر (OS) في أنسجة الرئة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
فحص الرئة ورم خبيث (PuMA) هو نظام الثقافة الخلية المغلقة تسمح للباحثين لدراسة بيولوجيا الاستعمار الرئة في أوستيوساركوما (نظام التشغيل) بالفحص المجهري الأسفار و السابقين فيفو اكسبلانت الرئة. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً للبروتوكول، ويناقش أمثلة للحصول على بيانات الصورة في النمو المنتشر باستخدام ويديفيلد أو منصات مجهرية الأسفار [كنفوكل]. مرونة طراز بوما يسمح للباحثين لدراسة ليس فقط نمو الخلايا OS في المكروية الرئة، ولكن أيضا تقييم آثار العلاجات المضادة المنتشر على مر الزمن. مجهرية [كنفوكل] يسمح للتصوير لم يسبق لها مثيل، والاستبانة تفاعلات الخلية OS مع حمة الرئة. وعلاوة على ذلك، عندما طراز بوما يقترن بالأصباغ الفلورية أو الصحفيين الجينية بروتين فلوري، يمكن دراسة الباحثين المكروية الرئة والهياكل الخلوية وسوبسيلولار، ووظيفة الجينات ونشاط المروج في الخلايا المنتشر من نظام التشغيل. يوفر طراز بوما أداة جديدة للباحثين osteosarcoma اكتشاف جديد ورم خبيث البيولوجيا وتقييم نشاط رواية العلاجات المضادة المنتشر، مستهدفة.
المقدمة
لا يزال تحسين النتائج للأطفال المرضى مع osteosarcoma المنتشر (OS) حرجة غير الملباة سريرية 1. وهذا يؤكد أهمية تطوير علاجات جديدة تستهدف جزيئيا. يجب أن تستهدف تشريعات التقليدية أن انتشار الخلايا السرطانية الهدف لم يثبت أن تكون فعالة في علاج المرض المنتشر، وهكذا رواية استراتيجيات عملية المنتشر نفسه 2. المادة الحالية تتناول الجوانب العملية لنوع جديد نسبيا من السابقين فيفو الرئة ورم خبيث النموذجي، مقايسة خبيث الرئوية (PuMA) وضعتها ميندوزا والزملاء3، الذي يوفر أداة مفيدة في اكتشاف جديد الجزيئية من السائقين في الرئة ورم خبيث تطور في نظام التشغيل 4،5. قبل المتابعة، ومع ذلك، فإنه سيكون من الحكمة أن أتطرق بإيجاز إلى العديد من النماذج الحالية لورم خبيث، وكيف طراز بوما يوفر العديد من المزايا على مدى التقليدية في المختبر فحوصات.
النماذج التجريبية الأكثر المستخدمة لدراسة ورم خبيث تتألف من نظم في المختبر و في فيفو أن الخص خطوة معينة أو عدة خطوات لتتالي المنتشر. وتشمل هذه الخطوات: 1) ورم الخلايا المهاجرة بعيداً عن الورم الرئيسي، 2) إينترافاسيشن إلى السفن القريبة (الدم أو اللمفاوية) والعبور داخل الدورة الدموية، 3) إلقاء القبض على الموقع الثانوي، 4) التسرب والبقاء على قيد الحياة في موقع ثانوي، 5) تشكيل ميكروميتاستاسيس، و 6) النمو إلى الانبثاث فاسكولاريزيد (الشكل 1). يمكن أن تتضمن نماذج في المختبر من ورم خبيث ثنائي الأبعاد (2D) الهجرة وثلاثي الأبعاد (3D) فحوصات غزو ماتريجيل التي تستعرض بالتفصيل في أماكن أخرى 6. للنماذج في فيفو ، نظامان النموذجية المستخدمة عادة تشمل: 1) هو نموذج خبيث عفوية أورثوتوبيكالي حقن نوع أنسجة محددة لتشكيل ورم محلي الذي يلقي تلقائياً الخلايا المنتشر فيها خلايا السرطانية إلى مواقع بعيدة؛ 2) نموذج تجريبي خبيث حيث يتم حقن الخلايا السرطانية في الأوعية الدموية المنبع للجهاز الهدف. على سبيل المثال، ذيل حقن الوريد لورم الخلايا النتائج في التنمية الرئة الانبثاث5،،من78. وتشمل نماذج خبيث تجريبية أخرى حقن الخلايا السرطانية في الطحال أو الوريد المساريقي العلوي الذي يؤدي إلى تنمية الانبثاث الكبد9،10. -ناقش بالتفصيل الاعتبارات العملية لهذه النماذج في فيفو ولش 11. في فيفو نموذج آخر يستخدم لدراسة ورم خبيث في طب الأطفال الطويلا هو نموذج غرس الورم اختلال الكلي الكلوي مما يؤدي إلى تشكيل الورم المحلية وورم خبيث عفوية إلى 12،الرئتين13. تصور تقنية أكثر من الناحية التقنية شاقة مثل فيديوميكروسكوبي إينترافيتال يمكن مباشرة، في الوقت الحقيقي، التفاعلات بين خلايا السرطان المنتشر وميكروفاسكولاتوري من موقع المنتشر (أي. الرئة أو الكبد) كما وصفها ماكدونالد14 وانتينبيرج15، أو سرطان الخلية التسرب في غشاء تشوريوالانتويك كما وصفت كيم 16.
طراز بوما هو السابقين فيفو، explant أنسجة الرئة، ونظام الثقافة المغلقة حيث نمو الخلايا السرطانية الفلورسنت طوليا يلاحظ عبر الفحص المجهري الأسفار على مدى فترة شهر (انظر الشكل 2 أ). ويجمل هذا النموذج في المراحل الأولى من الاستعمار الرئة (الخطوات من 3 إلى 5) في تتالي المنتشر. بعض المزايا الرئيسية من طراز بوما على النماذج التقليدية في المختبر : 1) أنه يتيح فرصة لقياس نمو الخلايا السرطان المنتشر في المكروية 3D الذي يحتفظ بالعديد من ميزات المكروية الرئة طوليا في فيفو 3؛ 2) من طراز بوما يسمح الباحث لتقييم ما إذا كان ضربة قاضية لعلاج الجينات أو المخدرات مرشح النشاط المضادة المنتشر في سياق المكروية 3D الرئة؛ 3) من طراز بوما يتسم بالمرونة مع أنواع عديدة من الأسفار منصات مجهرية (الشكل 2) مثل ويديفيلد fluorescence مجهرية أو ليزر المسح المجهري [كنفوكل]، وترد أمثلة لكل في الشكل 2 & د، على التوالي. وسوف تناقش هذه المقالة كيفية استخدام طراز بوما للحصول على بيانات التصوير الطولي على النمو المنتشر من البروتين المعزز الفلورية الخضراء (اجفب)-إذ يعرب، عن الخلايا البشرية osteosarcoma المنتشر العالية والمنخفضة (مننج ويخدم الخلايا، على التوالي) باستخدام الأسفار ويديفيلد تضخم منخفض. وتناقش أيضا أمثلة من التصوير صبغة فلورسنت التي تسميات حمة الرئة، وبروتين الأحمر نيون الخلايا الوراثية المراسل الذي تسميات الميتوكوندريا في نظام التشغيل في طراز بوما باستخدام مجهر مسح ليزر [كنفوكل].
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وأجريت جميع البروتوكولات الحيوانية التي تم الحصول على بيانات التصوير بالموافقة على "رعاية الحيوان" و "استخدام اللجنة" للمعهد الوطني للسرطان، والمعاهد الوطنية للصحة. كافة البروتوكولات الحيوان ناقش وصورت في المقالة الفيديو أقرتها اللجنة الرعاية الحيوانية في جامعة كولومبيا البريطانية.
1. إعداد الخلايا السرطانية للحقن والمواد الخاصة بنموذج من طراز بوما
ملاحظة: الكمية من الحلول والخلايا ستكون كافية للماوس 1. مقياس حسب الاقتضاء إذا استخدمت الفئران أكثر في الدراسة. لوصفات وسائل الإعلام، أرجع إلى الجدول 1 و الجدول 2.
- قبل دافئ مل 5 ألف-الإعلام في أنبوب مخروطي 15 مل في حمام مائي 37 سج.
- تذوب 1.2% انخفاض ذوبان [اغروس] الحل (في الماء المعقم) استخدام مختبر الموجات الدقيقة.
- نقل 5 مل من [اغروس] المنصهر في أنبوب مخروطي 15 مل، والحفاظ على الدفء في حمام مائي 37 سج. ضمان [اغروس] ذاب في 37 سج والسائل قبل الخطوة إينسوفلاتيون الرئة.
- قبل تشيل 30 مل من خلية ثقافة الصف تستكمل مع X 1 القلم/بكتيريا في دلو الجليد برنامج تلفزيوني.
- في بئر واحدة للوحة 6، حسنا، قبل نقع اسفنجة جيلاتين 1.5 مل ب-وسائل الإعلام. وسيكون الأسفنج الارتساء الدعم للشرائح الرئة.
- تأمين الخلايا نظام التشغيل هي حوالي 70-90% المتلاقية في اليوم من هذا الإجراء. لا تستخدم الخلايا روافد المفرط، أو إذا كانت وسائل الإعلام هو اللون البرتقالي الأصفر منذ عادة يتم التشديد على الخلايا وتقلصت قدرة البقاء في هذه المرحلة. لخطوط الخلايا osteosarcoma، مننج، ويخدم، سيتم استخدام 5 × 105 في حجم 100 ميكروليتر لحقن الوريد ذيل الماوس 1. الراقي وبناء على ذلك إذا تم استخدام أكثر من الفئران للدراسة.
- حصاد الخلايا السرطانية باستخدام 0.25% التربسين-يدتا (3 مل لقارورة T75 أو 2 مل في صحن ثقافة 10 سم). عندما بدأت خلايا رفع قبالة اللوحة، تحييد التربسين-يدتا مع وسائل الإعلام كاملة. زيادة ونقصان لأسفل الخلايا وشطف مرة واحدة مع خلية ثقافة الصف PBS. ريسوسبيند بيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- إجراء عد خلية بالأساليب القياسية. فمن الأفضل لجعل تعليق خلية أكثر من ما هو مطلوب فعلا منذ خسارة تعليق خلية غالباً ما يحدث أثناء رسم الإبرة وفشل محاولات الحقن.
- القيام "مقايسة الاستبعاد" تريبان الأزرق على عينة من تعليق خلية لتقييم صلاحية الخلايا. المضي قدما فقط إذا كانت الخلية إظهار الجدوى 90 في المائة أو أعلى.
- ضخ 5 × 105 خلايا في حجم 100 ميكروليتر. ينبغي أن يعد فائض 2 X من هذا المبلغ، نسج أسفل 1 × 106 خلايا وحراكه في 0.2 مل حبس.
- وضع تعليق خلية في دلو الجليد حين إعداد الفئران لحقن.
2-ذيل حقن الوريد والرئة إينسوفليشن
ملاحظة: الكمية من الحلول والخلايا الموجودة في هذا المقطع سيكون كافياً للماوس 1. مقياس حسب الاقتضاء إذا استخدمت الفئران أكثر في الدراسة. للحصول على قائمة المعدات والمواد والأدوات الجراحية المستخدمة في الخطوات التالية، أرجع إلى الجدول 3 و الجدول 4.
- الحارة ماوس الإناث (سن 6-8 أسابيع) تحت مصباح تدفئة لمدة 5 دقائق كي الذيل الوريد ما يبدو أكثر وضوحاً. للخلايا K7M2 أو K12 مورين، استخدام الفئران بالب/ج؛ للخلايا MG63.3، MG63، مننج، ويخدم البشرية، استخدام الفئران المناعة المشتركة الشديد.
- تأكد من تعليق خلية موحد بالهز الأنبوب بلطف. بعناية بوضع تعليق خلية في محقن 1 مل دون الإبرة. كاب المحاقن مع 27 قياس الإبرة. تأكد من وجود النتوء إبرة على نفس الجانب كعلامات وحدة التخزين على الإبرة.
- ضع الماوس في ريسترينير، ومسحه الذيل مع مسح الكحول.
- الشروع في القيام حقن الوريد ذيل وحقن 100 ميكروليتر من تعليق خلية. ضع الماوس في دائرة2 CO 5 دقائق بعد الحقن، وتبدأ الإجراءات التشغيلية الموحدة القتل الرحيم (كالمخطط الخاص بك لجنة رعاية الحيوان المؤسسية). التفكك عنق الرحم ينبغي أن لا تستعمل كوسيلة للقتل الرحيم منذ الإجراء سيضر القصبة الهوائية.
- حالما يتم euthanized الماوس، البدء في إعداد هود الاندفاق الصفحي إينسوفليشن في الرئة الماوس مع الحل [اغروس]/A--وسائل الإعلام. داخل غطاء الاندفاق الصفحي، قم بإعداد مساحة عمل مع لوحة العقيمة. على هذه اللوحة سوف تضع أدوات معقمة والقسطرة رابعا، رابعا تمديد تعيين، وجهاز نضح الجاذبية (انظر تكميلية الشكل 1).
- ضع الماوس في ريكومبانسي الظهرية. مع مقص صغير عقيمة، بعناية تشريح القص لفضح تجويف الصدر. الحرص على عدم ثقب في الرئة حيث سيتم استخدام حلاً [اغروس]/A-وسائط الإعلام إينسوفلاتي في الرئة.
- عند تشريح خارج القص، تشريح الماضي مدخل الصدر على جانبي القصبة الهوائية. كشف القصبة الهوائية بتشريح الأنسجة اللينة المحيطة بها بعيداً.
- كانولاتي القصبة الهوائية مع قسطرة قياس 20 رابعا. فضفاضة قرانهما جراحة استخدام خياطة الخيوط العقيمة حول القصبة الهوائية مقني.
- إرفاق ملحق الرابع مجموعة من القصبة الهوائية كاثيتيريزيد إلى حقنه 10 مل جهاز نضح الجاذبية.
- الجمع بين حرارة قبل 37 سج [اغروس] (5 مل) وألف-وسائط الإعلام (5 مل) في خليط 1:1. صب السائل الحل [اغروس]/A-وسائط الإعلام في حقنه 10 مل من الجهاز نضح الجاذبية. قبل إينسوفليشن الرئتين مع الحل [اغروس]/A-وسائط الإعلام، التأكد من أن طول تمديد تعيين قد تم جاهزة مع [اغروس]/A-وسائط الإعلام، مما يلغي إينسوفليشن غير مقصود من عينات الرئة بالهواء.
- ملء الرئة الحل [اغروس]/A--وسائل الإعلام حتى الرئة هو إينسوفلاتيد تماما.
- مرة واحدة هو إينسوفلاتيد الرئة تماما، إزالة القنية والتعادل بشدة إيقاف عقده العمليات الجراحية لمنع تسرب الحل أجاراسي/A--وسائل الإعلام من خلال القصبة الهوائية.
- الشروع في تشريح من نتف (القصبة الهوائية والقلب والرئة) من تجويف الصدر. الحرص على عدم ثقب أو تلف سطح الرئة.
- مكان نتف (في لا اتجاه معين) في 30 مل مبردة مسبقاً لبرنامج تلفزيوني وتستكمل مع القلم X 1/بكتيريا، والسماح [اغروس]/A-وسائط الإعلام على ترسيخ لمدة 20 دقيقة.
- باستخدام مقص جيد وملاقط، قص القطع الصغيرة في الرئة (3 مم × 1.5 مم) كما هو مبين في الشكل 1 ألف. يمكن تصويرها أصغر الرئة الشرائح بسهولة استخدام هدفا X 2.5. ويمكن خفض شرائح متعددة كل حالة تجريبية، عادة 4-10 شرائح كل مجموعة.
ملاحظة: لكل مجموعة تجريبية، وضع شرائح الرئة في بئر منفصلة (6-جيدا لوحة) التي تحتوي على اسفنجة جيلاتين 2 × 2 سم قبل غارقة في وسائل الإعلام ب. يجب أن تكون كمية وسائل الإعلام كل بئر 1.5 مل. تغيير وسائل الإعلام كل 2-3 أيام. دراسات المخدرات، هو تواتر تغيير الوسائط/الدواء المستخدم تحديد.
3-ويديفيلد Fluorescence تصوير شرائح الرئة والتحليل
ملاحظة: للأسفار ويديفيلد التصوير، أصغر شرائح يتم قطع (3 مم × 1.5 مم × 1 مم) كي تناسب الصورة 1 باستخدام هدفا X 2.5 المقطع الرئة.
الحصول على الصور في مجهر الأسفار ويديفيلد:
- عادة يتم تصويرها شرائح الرئة في 0, 3 و 7 و 14 يوما بعد انتهاء الحقن. في بيئة معقمة لمجلس الوزراء البيولوجية، بعناية نقل الشرائح الرئة من الجيلاتين جولة الأسفنج لزجاج معقمة 35 مم-قاع الطبق. العناية بالدأب قبالة السوائل الزائدة من شريحة الرئة كما سيكون بمثابة مرآة السوائل الزائدة وتعكس ضوء فلورسنت قادمة من الخلايا السرطانية.
- ترتيب الشرائح الرئة بنفس الطريقة المبينة في الشكل 1A. ويمثل كل عمود شرط تجريبية مختلفة. رعاية لا الصليب-تلويث الرئتين مع الملقط. شطف مع الإيثانول 70% والجافة قبل التعامل مع شرائح الرئة من مجموعة تجريبية أخرى.
- تحسين المعلمات التصوير (ie. مكسب، الإزاحة، التعرض الوقت، binning) التي توفر أفضل التباين بين الخلايا السرطانية الفلورسنت وأنسجة الرئة الخلفية في عنصر التحكم (مركبة دون علاج) مجموعة. استخدام نفس المعلمات من السيطرة على المجموعة في صورة مجموعات تجريبية. حفظ كتنسيق صورة tiff.
- لمرجع نطاق، التقاط صورة رقمية ميكرومتر في نفس الهدف.
- منذ الرئة السيارات-الأسفار التغييرات على مر الزمن، يجب تعديل المعلمات التصوير إلى الرئتين مراقبة كل دورة التصوير. المعلمات التصوير لدورة واحدة قد لا بالضرورة تكون الأمثل لدورات التصوير اللاحقة.
تحليل الصورة:
ملاحظة: تتم خطوات المعالجة الصورة التالية مع إيماجيج ح 1.51 برنامج حزمة 17.
- فتح ملف صورة في إيماجيج (الشكل 3A).
- طرح الخلفية: عملية > "خلفية طرح" > المتداول الكرة دائرة نصف قطرها (ابدأ مع 50 بكسل)، قم بإلغاء تحديد "خلفية الضوء" (الشكل 3).
- تحويل الصورة إلى تنسيق 8 بت: الصورة > نوع > 8-بت (الشكل 3).
- تعيين وحدات بكسل: الصورة > Enter "بكسل" في "وحدة طول"، قم بإدخال 1 في "العرض بكسل"، "الارتفاع بكسل"، "عمق فوكسل". خانة "العالمي" لتطبيق على الصور اللاحقة.
- باستخدام أداة التحديد المضلع، مخطط تفصيلي لشكل شريحة الرئة كاملة وتحديد مجال شريحة مجموع الرئة (2من بكسل). سيتم استخدام هذه القيمة لحساب عبء المئة ورم في الرئة.
- الصورة عتبة: الصورة > ضبط > عتبة > تسليط الضوء على "الافتراضي" و "B & W" > استخدام شريط التمرير لعتبة الصورة مثل أن يسلط الضوء على معظم الخلايا السرطانية بدقة. الضغط على "تطبيق" سيؤدي إلى صورة أبيض وأسود فيها الرئة كل شيء أسود، وآفات الفلورسنت الأبيض (3D الشكل). الضغط على "تطبيق" لمرة ثانية سيتم عكس الصورة فيها جميع الهياكل الفلورسنت الآن الأشكال السوداء (3E الشكل).
- التحديد الكمي لعدد وشكل آفات:
تحليل > تعيين قياسات > التحقق من "المنطقة". قم بإلغاء تحديد كافة خانات أخرى.
تحليل الجزيئات > الحجم (بكسل2): 0-اللانهاية تمثل مجموعة الأشكال التي سوف تعداد إيماجيج. تحديد أصغر الآفة التي تعتبر خلية ورم وحيد في صور المركبات اليوم 0 تجريبيا. استخدام مجال هذه الخلية ورم واحد كحد أدنى للصور المتبقية في مجموعة البيانات. للعمل المعروضة في هذه الورقة، يتم تعيين 11 بكسل2 كحد أدنى. للعمل الذي عرضه في المثال الفيديو، يتم تعيين 24 بكسل2 كحد أدنى. ترك "تدوير" النطاق 0-1. يمكن تعيين "إظهار" "لا شيء". وبدلاً من ذلك، إذا تم تحديد "إظهار" و "الخطوط"، يتم إنشاء رسم من كافة الأشكال المحددة. تحقق من وجود "عرض النتائج" نافذة منفصلة للقياسات يطفو على السطح. بشكل اختياري، بعد المربع "إضافة إلى مدير" محدداً سيوفر جميع الأشكال كمياً إلى مدير العائد على الاستثمار، التي يمكن حفظها للرجوع إليها في المستقبل. بعد الضغط على موافق، سوف يطفو نافذة "نتائج" التي تحتوي على جميع الأشكال المذكورة ومجال القياسات (3F الشكل). - نسخ ولصق البيانات من إطار "نتائج" في جدول بيانات. استخدام الدالة SUM حسابية في Excel لحساب مجموع جميع مجالات الآفات المنتشر لتلك الشريحة الرئة خاصة. لتقييم عبء شريحة الرئة ورم الرئة المئة، تقسيم مجموع مجالات آفات المنتشر بإجمالي مساحة الشريحة الرئة. هذه المعلمة كما هو معروف كسر منطقة (A) الذي يوصف بقنديل 18.
عبء ورم الرئة = مجموع آفة المتنقل المناطق إلى مجموع مساحة شريحة الرئة - حساب عبء ورم الرئة لبقية أقسام الرئة في مجموعة المراقبة والفئات المتبقية. ارسم عبء ورم الرئة متوسط كل مجموعة على 0, 3, 7 و 14 يوما. تظهر الصور ويديفيلد الممثل الفلورية العالية والمنخفضة المنتشر خلايا نظام التشغيل البشرية المتنامية في طراز بوما في نقاط زمنية التدريجي (الشكل 4 أ). ويرد رسم بياني خطي يبين إضعاف-التغيير (تطبيع إلى اليوم 0) في عبء الورم المنتشر في المائة على مر الزمن (الشكل 4 باء).
4-[كنفوكل] Fluorescence تصوير من طراز بوما
ملاحظة: لتصوير [كنفوكل]، تجهيز الأنسجة مشابهة لذلك في القسم السابق فيما عدا أنه يتم قطع أكبر الرئة شرائح (مقاطع عرضية كاملة، 1-2 مم) للسماح لأكثر رويس تصويرها.
وضع العلامات في حمة الرئة مع DAR4M:
- تزج شرائح الرئة في 10 μμM من DAR4M (في حبس) لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. DAR4M تسميات أنواع النيتروجين التفاعلي داخل الخلايا الرئة.
- وبعد 45 دقيقة من الحضانة، شطف شرائح الرئة مع حبس جديدة.
- مكان الشريحة الرئة في 35 ملم زجاج السفلي جولة طبق، والصورة على المجهر [كنفوكل].
- يتم سرد المعلمات التصوير للصور مثلاً هو موضح في الشكل 5 في الجدول 5.
- اكتساب Z كدسة لمنطقة الاهتمام. استخدام سمك الشريحة Z المقترح لأخذ العينات نايكست. فيلم ممثل مكدس ثلاثي الأبعاد عرض الخلايا OS الفلورية الخضراء في أنسجة الرئة المسمى DAR4M يرد في 1 الفيلم و تكميلية الفيلم 1.
وكانت الدورة التصوير للصور مثلاً [كنفوكل] هو موضح في الشكل 5، المحطة الطرفية. إذا كان مطلوباً التصوير الطولي، ينصح استخدام 2-فوتون أو فوتون متعدد مجهز [كنفوكل] LSM المجهر للتصوير حيث يوجد أقل د للمعيشة الأنسجة19،20.
وإذ تعرب عن الخلايا MG63 ميتو-طلب تقديم العروض في طراز بوما التصوير:
- تنفيذ البروتوكول بوما كمخطط تفصيلي في الخطوة 1 و 2 باستخدام خلايا MG63 الإعراب عن بناء ميتو-طلب تقديم العروض.
- مكان الشريحة الرئة في 35 ملم زجاج السفلي جولة طبق، والصورة على المجهر [كنفوكل].
- يتم سرد المعلمات التصوير للصور مثلاً هو موضح في الشكل 6 في الجدول 6. فيلم ممثل مكدس ثلاثي الأبعاد عرض الخلايا OS نيون الأخضر مع الأحمر نيون الميتوكوندريا يتم توفيرها في فيلم 2 و تكميلية الفيلم 2.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تضخم منخفض ويديفيلد fluorescence مجهرية
بالنسبة ويديفيلد fluorescence الفحص المجهري لشرائح الرئة بوما، تبين الصور التمثيلية وتحديد مقدار البيانات في الشكل 2، و الشكل 4A و ب. المزيف المنتشر لخطوط الخليوي المنتشر العالية والمنخفضة تتجلى بصريا عبر النقاط الزمنية تدريجيا. كفاءة الخلايا مننج يمكن استعمار أنسجة الرئة بينما لا تنمو خل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
المادة التقنية التالية توضح بعض الجوانب العملية من طراز بوما في دراسة الاستعمار الرئة في نظام التشغيل. فيما يلي بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول بحيث أن الباحثين ينبغي أن تأخذ الرعاية الإضافية:
أ) كانوليشن من القصبة الهوائية. القصبة الهوائية يمكن أن تتلف بسهولة أثناء تشريح المحيطة العضلات والنسيج الضام. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة دفع إبرة القسطرة عن طريق القصبة الهوائية. إيلاء اهتمام وثيق لكيفية الشطب الإبرة يدخل القصبة الهوائية عند إدراج القنية.
ب) ثقب أو إتلا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
ونود أن نشكر الدكتور أرنولفو مندوزا الذي وفر التدريب في تقنية بوما. بالإضافة إلى ذلك، نود أن نعترف بيليغوز تشاند خانا، سوزان غارفيلد (NCI/المعاهد الوطنية للصحة)، ووسام أباريسيو (وكالة السرطان قبل الميلاد) لتوفير استخدام مجاهر بها أثناء هذه الدراسة. وأيد "البرنامج البحوث الداخلية" "المعاهد الوطنية للصحة"، مركز "بحوث السرطان"، طب الأورام فرع هذا البحث (جزئيا). M.M.L. أيده "المعاهد من البرنامج الصحي الوطني الداخلية زيارة زميل" (جائزة 15335)، وتدعمها حاليا على "جوان باركر زمالة" في "أبحاث ورم خبيث". P.H.S. معتمد من قبل "مؤسسة مكافحة السرطان في كولومبيا البريطانية".
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>الجدول 2< / قوي > | |||
| < قوي > كواشف ثقافة الخلية للوسائط A ، والوسائط B ، والوسائط الكاملة < / | |||
| ATCC | CRL-1547 | خط خلية نظام التشغيل عالي النقيلي | |
| HOS | ATCC | CRL-1543 | خلية نظام التشغيل النقيلي بشكل سيئ |
| MG63.3 | مختبر إيمي ليبلانك (NCI) | N / A | خط خلية OS عالي النقيلي |
| MG63 | ATCC | CRL-1427 | خلية OS نقيلي |
| ضعيف 10X M199 وسائط | Thermofisher | 11825015 | وسائط أساسية للمياه المقطرة A-media و B-media |
| (معقمة) | Thermofisher | 15230-147 | مكون من A-media & B-media |
| 7.5٪ محلول بيكربونات الصوديوم | Thermofisher | 25080094 | مكون من A-media & B- ميديا |
| هيدروكورتيزون | سيجما ألريش | H6909 | مكون من A-media & B-media |
| الريتينول أسيتات القابلة للذوبان في الماء | Sigma-Alrich | R0635-5MG | مكون من A-media & amp ب ميديا |
| البنسلين / الستربتومايسين 10X مركز (10000 وحدة / مل) محلول | Thermofisher | 15140122 | مكون من A-media & B-media ، وسائط كاملة. |
| محلول الأنسولين البقري (10 مجم / مل) | سيجما ألريش | I0516-5ML | مكون من A-media & B-media |
| DMEM ، | الرطوبة | عالية | الوسائط الأساسية لوسائل الإعلام |
| الكاملة L-Glutamine (200 مليمتر) | Thermofisher | 25030081 | مكون من |
| الجنين | الأبقار Thermofisher | 16000044 | مكون من Dulbecco الإعلامي الكامل |
| s الفوسفات | مخزن Thermofisher | 14190144 | يستخدم في زراعة الخلايا. |
| هانك s محلول أملاح مخزن ، خال من الكالسيوم ، لا مغنيسيوم ، لا فينول | أحمر 14175095 ثيرموفيشر | يستخدم لإعادة تعليق حبيبات الخلية قبل الحقن | |
| Trypsin-EDTA (0.25٪) ، | 25200114 | الفينول الأحمر Thermofisher | يستخدم في زراعة الخلايا. |
| DAR4M | Enzo | ALX-620-069-M001 | يستخدم لتسمية حمة الرئة. |
| <قوي>الاسم | <قوي>الشركة | رقم الكتالوج | تعليقات |
| الجدول 3 | |||
| مواد ل PuMA | |||
| Zeiss 710 متحد البؤر LSM | Zeiss | N / A | مستقيم LSM متحد البؤر مجهر |
| زايس 780 متحد البؤر LSM | زايس | N / A | مقلوب LSM مجهر متحد البؤر |
| SCID الفئران | تشارلز ريفر | N / A | NOD. CB17-Prkdcscid / NcrCrl ، أنثى ، من 6 إلى 8 أسابيع |
| GelFoam | Harvard Apparatus | 59-9863 | تستخدم كدعم لأقسام أنسجة الرئة. |
| SeaPlaque Agarose | Lonza | 50100 | يستخدم أثناء نفخ الرئة. |
| حقنة 1 مل بإبرة قياس 27 | Fisherscientific | 14-826-87 | تستخدم لحقن وريد الذيل. |
| 10 مل حقنة | BD | 309604 | تستخدم لنفخ الرئة. |
| قسطرة قياس 20 | Terumo | SR-OX2032CA | تستخدم أثناء نفخ الرئة. |
| مجموعة تمديد أبوت الرابع (30 بوصة ، معقمة) | Medisca | 8342 | تستخدم أثناء نفخ الرئة. |
| مسحات الكحول | BD | 326895 | لمسح وريد الذيل قبل الحقن |
| قفازات جراحية معقمة | Fisherscientific | يختلف باختلاف الحجم | تسليم متشكك لرئتي الفأر |
| مسطرة 30 سم | دبابيس | تستخدم لنفخ الرئة. | |
| دعم الوقوف على المسطرة | Pipette.com | HS29022A | يستخدم لنفخ الرئة. |
| طبق ثقافة زجاجي ذو قاع زجاجي مقاس 35 | مم Ibidi | 81158 | يستخدم أثناء تصوير شرائح الرئة |
| وسادات سفلية ماصة مع حاجز رطوبة مقاوم للماء | VWR | 56617-014 | تستخدم لبطانة منطقة العمل المعقمة في الغطاء البيولوجي. |
| خياطة Catgut عادية قابلة للامتصاص | Braun | N / A | تستخدم لربط القصبة الهوائية المقنية. |
| <قوي>الاسم | <قوي>الشركة | رقم الكتالوج | تعليقات |
| الجدول 4 | |||
| أدوات جراحية لمقص تشريح PuMA< / strong> | |||
| Micro 3.5 "مستقيم حاد / حاد | Roboz | RS-5910 | لقطع أقسام الرئة |
| 4 " (10 سم) طويل مسنن مستقيم دقيق للغاية 0.5 مم طرف | Roboz | RS-5132 | لمعالجة / عقد أقسام الرئة. |
| 4 " (10 سم) منحنى طفيف مسنن طويل 0.8 مم طرف | Roboz | RS5135 | لمعالجة / عقد أقسام الرئة. |
| ملقط تضميد الإبهام. مسنن; لطيف; 4.5 بوصة الطول ؛ عرض الطرف 1.3 مم | Roboz | RS-8120 | للتشريح العام. |
| ملقط ضمادة الإبهام 4.5 بوصة مسنن 2.2 مم عرض الطرف | Roboz | RS-8100 | للتشريح العام. |
| مقص تشريح دقيق فائق الدقة 3.5 بوصة مستقيم حاد / حاد ، شفرة 20 مم | Roboz | RS-5880 | للتشريح العام. |
| مقص Knapp. مستقيم; حاد حاد. طول الشفرة 27 مم ؛ 4 "الطول الكلي | Roboz | RS-5960 | للتشريح العام. |
المراجع
- Khanna, C., et al. Toward a drug development path that targets metastatic progression in osteosarcoma. Clin Cancer Res. 20 (16), 4200-4209 (2014).
- Steeg, P. S. Perspective: The right trials. Nature. 485 (7400), S58-S59 (2012).
- Mendoza, A., et al. Modeling metastasis biology and therapy in real time in the mouse lung. J Clin Invest. 120 (8), 2979-2988 (2010).
- Hong, S. H., Ren, L., Mendoza, A., Eleswarapu, A., Khanna, C. Apoptosis resistance and PKC signaling: distinguishing features of high and low metastatic cells. Neoplasia. 14 (3), 249-258 (2012).
- Lizardo, M. M., et al. Upregulation of Glucose-Regulated Protein 78 in Metastatic Cancer Cells Is Necessary for Lung Metastasis Progression. Neoplasia. 18 (11), 699-710 (2016).
- Pouliot, N., Pearson, H. B., Burrows, A. Investigating Metastasis Using In Vitro Platforms. Metastatic Cancer: Clinical and Biological Perspectives. , Landes Bioscience. Austin, Texas. (2012).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
- Morrow, J. J., et al. mTOR inhibition mitigates enhanced mRNA translation associated with the metastatic phenotype of osteosarcoma cells in vivo. Clinical Cancer Research. , (2016).
- Varghese, H. J., et al. In vivo videomicroscopy reveals differential effects of the vascular-targeting agent ZD6126 and the anti-angiogenic agent ZD6474 on vascular function in a liver metastasis model. Angiogenesis. 7 (2), 157-164 (2004).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Welch, D. R. Technical considerations for studying cancer metastasis in vivo. Clin Exp Metastasis. 15 (3), 272-306 (1997).
- Somasekharan, S. P., et al. YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1. J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).
- El-Naggar, A. M., et al. Translational Activation of HIF1alpha by YB-1 Promotes Sarcoma Metastasis. Cancer Cell. 27 (5), 682-697 (2015).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nat Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
- Kim, Y., et al. Quantification of cancer cell extravasation in vivo. Nat Protoc. 11 (5), 937-948 (2016).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Underwood, E. E. Quantitative stereology. , Addison-Wesley Pub. Co. (1970).
- Tanaka, K., et al. In vivo optical imaging of cancer metastasis using multiphoton microscopy: a short review. Am J Transl Res. 6 (3), 179-187 (2014).
- Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research. Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).
- Bijgaart, R. J., Kong, N., Maynard, C., Plaks, V. Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment. J Vis Exp. (108), e53741(2016).
- Guha, M., et al. Mitochondrial retrograde signaling induces epithelial-mesenchymal transition and generates breast cancer stem cells. Oncogene. 33 (45), 5238-5250 (2014).
- Ren, L., Morrow, J. J., et al. Positively selected enhancer elements endow osteosarcoma cells with metastatic competence. . Nat Med. , (2018).
- Ren, L., et al. Metabolomics uncovers a link between inositol metabolism and osteosarcoma metastasis. Oncotarget. 8 (24), 38541-38553 (2017).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
