البروتوكول خطوة واحدة لتقييم الوضع من موت الخلايا كلونوجينيك الإشعاع بالفحص المجهري Fluorescence

Daijiro Kobayashi; Atsushi Shibata; Takahiro Oike; Takashi Nakano

doi:10.3791/56338

مقالة منهجية

البروتوكول خطوة واحدة لتقييم الوضع من موت الخلايا كلونوجينيك الإشعاع بالفحص المجهري Fluorescence

DOI:

10.3791/56338

⸱

أكتوبر 23, 2017

Daijiro Kobayashi¹ , Atsushi Shibata² , Takahiro Oike¹ , Takashi Nakano¹

¹Department of Radiation Oncology, Gunma University Graduate School of Medicine, ²Advanced Scientific Research Leaders Development Unit, Gunma University Graduate School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البحوث المتعلقة بالإشعاعات المؤينة (الأشعة تحت الحمراء)-موت الخلية كلونوجينيك المستحث مهم لفهم آثار الأشعة تحت الحمراء على الأورام الخبيثة وأنسجة طبيعية. وهنا يصف لنا مقايسة خطوة واحدة لتقييم طرق رئيسية من موت الخلايا المستحثة بالأشعة تحت الحمراء كلونوجينيك استناداً إلى مورفولوجيا 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI)-الملون الأنوية تصور بالفحص المجهري الأسفار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البحوث المتعلقة بالإشعاعات المؤينة (الأشعة تحت الحمراء)-موت الخلية كلونوجينيك المستحث مهم لفهم تأثير الأشعة تحت الحمراء على الأورام الخبيثة وأنسجة طبيعية. هنا، نحن تصف مقايسة خطوة واحدة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم طرق رئيسية من موت الخلايا كلونوجينيك الناجم عن الأشعة تحت الحمراء، و أي، والمبرمج، وكارثة الانقسامية، والشيخوخة الخلوية في وقت واحد. في هذا الأسلوب، الخلايا التي نمت في كشف غطاء المشع بالأشعة السينية والملون مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI). باستخدام مجهر الأسفار، المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية هي حددت استناداً إلى مورفولوجيس مميزة من الأنوية الملون DAPI. [ابوبتوسس] تتحدد بوجود هيئات أبوبتوتيك (أي، نوى مكثف ومجزأة). كارثة الانقسامية يتحدد بوجود نوى أن يحمل اثنان أو أكثر من فصوص متميزة ونويات. الشيخوخة الخلوية يتحدد بوجود المرتبطة بالشيخوخة heterochromatic البؤر (أيالحمض النووي تحتوي على البؤر مشرقة وكثافة 30-50). ويسمح هذا النهج المجرب الشاشة بسهولة للخلية كلونوجينيك الموت طرق استخدام مختلف خطوط الخلايا واعدادات معالجة النقاط الزمنية، بهدف توضيح آليات موت الخلية في الخلايا المستهدفة والشروط لمصلحة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإشعاع المؤين (الأشعة تحت الحمراء) الحث على وسائط متعددة من موت الخلايا كلونوجينيك. البحث عن موت الخلايا المستحثة بالأشعة تحت الحمراء كلونوجينيك مهم لفهم سمية الأشعة تحت الحمراء للأنسجة الطبيعية، فضلا عن وضع أساليب لزيادة فعالية العلاج من السرطان العلاج الإشعاعي. المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية هي وسائط رئيسية من موت الخلايا كلونوجينيك الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء¹. المبرمج هو وضع تنظيم لموت الخلايا التي يتم تهيئتها بواسطة الحمض النووي الضرر¹. كارثة الانقسامية هو موت الخلايا التي تحدث بسبب الانقسام الشاذة الناجمة عن فواصل مزدوجة-حبلا الحمض النووي التي لم يتم إصلاحها¹. يتم تعريف الشيخوخة الخلوية كدولة في الخلية لا رجعة فيه النمو اعتقال²؛ ملاحظة أن الشيخوخة الخلوية لا موت الخلية في حد ذاتها، بل أنها طريقة لموت الخلايا كلونوجينيك لأنه يلغي بقاء الخلية مسن كلونوجينيك.

قد وضعت مختلف الاختبارات المستندة إلى الخلية تقييم فردي المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية. يمكن تقييم المبرمج بالمحطة الطرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز dUTP نك-نهاية وضع العلامات (TUNEL) تلطيخ وتلطيخ V أنيكسين، فحوصات الحمض النووي التشرذم و sub-G1 دورة الخلية مرحلة التصميم من خلال التدفق الخلوي¹. يمكن تقييم الكارثة الانقسامية التي الفلورة تلطيخ لعلامات الانقسامية، بما في ذلك MPM2، TUNEL تلطيخ والمجهر الإلكتروني¹. ويمكن تقييم الشيخوخة الخلوية تلطيخ المرتبطة بالشيخوخة β-جالاكتوسيداسي (SA-β-غال) وفحوصات النمو-الاعتقال والمجهر الإلكتروني¹. الأهم من ذلك، يختلف الوضع المهيمن لموت الخلايا كلونوجينيك بين خطوط الخلايا ومعالجة إعدادات³^،⁴. ولذلك، توضيح الشخصية عموما من موت الخلايا كلونوجينيك للحصول على إعداد تجريبي معين، فحوصات متعددة تغطي جميع هذه الأنماط من الموت يجب أن تجري معا، وهي كثيفة العمالة والتكلفة.

في هذه المقالة، يصف لنا تحليل خطوة واحدة سريعة وفعالة من حيث التكلفة في نفس الوقت تقييم المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية الناجمة عن الأشعة تحت الحمراء³^،⁴. في هذا الأسلوب، الخلايا التي نمت في كشف غطاء المشع بالأشعة السينية والملون مع 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي هيدروكلوريد (DAPI). باستخدام مجهر الأسفار، المبرمج كارثة الانقسامية الشيخوخة الخلوية هي كل التعرف على، واستنادا إلى مورفولوجيس المميزة الخاصة بكل منها من الأنوية الملون DAPI. وهذا النهج سيكون مفيداً للتطبيقات بما في ذلك الكشف عن ملامح موت الخلية كلونوجينيك في مختلف خطوط الخلايا وإعدادات معالجة النقاط الزمنية، بهدف التحقيق في آليات موت الخلية في الخلايا المستهدفة وشروط الفائدة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-"إعداد مواد"

كشوف غطاء اﻷوتوكﻻف.
1. وضع كشوف الغطاء في كوب زجاج.
2. تغطي الكأس الزجاج مع إحباط.
3. اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية في هذه المبادرة 15 على 20 دقيقة
4. الجافة في 50 درجة مئوية. تخزين في درجة حرارة الغرفة في غطاء ثقافة-
"إعداد تثبيت الحل": بارافورمالدهيد 3% + السكروز 2% في المحلول الملحي مخزنة الفوسفات (PBS).
1. على زجاجة زجاج مل 1,000، إضافة 700 مل برنامج تلفزيوني وبارافورمالدهيد 30 غ.
  تنبيه: بارافورمالدهيد المسببة للتآكل، وارتداء القفازات المناسبة.
2. بارافورمالدهيد حل تماما بالتدفئة إلى 80 درجة مئوية باستخدام ميكروويف.
  تنبيه: بارافورمالدهيد الأبخرة السامة، وارتداء قناع.
3. ترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
4. إضافة السكروز 20 غ.
5. "برنامج تلفزيوني إضافة" جعل حجم مجموع 1 ل.
6. قاسمة في 50 مل. يمكن تخزين حل التثبيت لمدة 3 سنوات في-20 درجة مئوية، أو لمدة 3 أشهر في 4 ° C.

2. إعداد "خلية ثقافة"

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ هذه الإجراءات في غطاء ثقافة-

الخلايا البشرية osteosarcoma U2OS

الثقافة ومرور للحفاظ على نمو لوغاريتمي ⁵.
ملاحظة: يمكن استخدام أنواع الخلايا الأخرى بعد تحديد الجرعة المثلى التشعيع.
يمسح مشرط مع مناشف ورقية مبلل مع الإيثانول 70%. استخدام المبضع، ضع بكشف الغطاء على طبق ثقافة خلية 35 ملم (يشار إليها فيما بعد ببساطة المشار إليها ك " الطبق ")-
ملاحظة: يمكن زيادة عدد قسائم الغطاء في صحن واحد التجريبية وفقا للتصميم (انظر المناقشة)-
إضافة 1 مل ثقافة الإعلام: دميم وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين.
ملاحظة: يمكن استخدام وسائل الإعلام الأخرى تبعاً لنوع الخلية المختارة.
مسح الملقط مع مناشف ورقية مبلل مع الإيثانول 70%. بلطف باستخدام الملقط، عقد مركز بكشف الغطاء. نضح وسائط الثقافة من الطبق تماما، مع الحفاظ على عقد في كشف الغطاء-
ملاحظة: هذه الخطوة تعزز تجميد كشف الغطاء للطبق.
فصل الخلايا المستزرعة ملتصقة باستخدام التربسين ⁵-
1. نضح وسائط الثقافة من الطبق.
2. إضافة 1 مل برنامج تلفزيوني ويهز الطبق بلطف.
3. "برنامج تلفزيوني نضح" من الطبق.
4. إضافة 1 مل التربسين [0.25w/v% يدتا التربسين-1mmol/لتر] إلى الطبق.
5. إينكوباتي لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5% CO ₂-
6. إضافة 9 مل ثقافة وسائل الإعلام إلى الطبق.
7. ميكروبيبيتي 1000 ميكروليتر، باستخدام إعداد تعليق خلية واحدة-
عد الخلايا ⁵.
1. في أنبوب 1.5 مل، إضافة تعليق خلية 0.9 مل ومل 0.1 0.4% الحل تريبان الأزرق-
2. تطبيق 10 ميكروليتر إلى هيموسيتوميتير.
3. فحص العدد من أونستاينيد (أي لايف) من الخلايا تحت مجهر المقلوب المرحلة.
في أنبوب 15 مل، إعداد 3 مل تعليق خلية في وسائط الثقافة في كثافة 0.5 × 10 ⁵ خلايا/مل.
ملاحظة: تحتاج خلية يمكن تعديل كثافة وفقا التجريبية (انظر المناقشة)-
برفق بإضافة 2 مل تعليق خلية إلى الطبق.
إينكوباتي بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5% CO ₂-

3. تشعيع

تنبيه: التعامل مع إيرادياتور الأشعة السينية بعناية وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-

دراسة الخلايا تحت مجهر المقلوب المرحلة. التأكد من أن الخلايا مرفقة بكشف الغطاء وإحياء-
تشعيع الطبق مع "الأشعة السينية غراي" 6 (1.4 غراي في الدقيقة، كفب 300، 20 mA)-
إينكوباتي ح 72 في 37 درجة مئوية في جو يحتوي على 5% CO ₂-
ملاحظة: يمكن تعديل الوقت الاحتضان وفقا التجريبية التصميم (انظر المناقشة)-

4. تثبيت

نضح وسائط الثقافة من الطبق.
استخدام مقص، قص غيض من ميكروبيبيتي ميكروليتر 1,000.
ملاحظة: نصيحة قطع يساعد على سلاسة تطبيق "الحل التثبيت".
استخدام تلميح قص، أضف 1 مل الحل التثبيت (تم إعداده في الخطوة 1، 2) للطبق من الجدار الجانبي للطبق.
ملاحظة: هذه الخطوة الحساسة للوقت وينبغي أن يجري ذلك دون تغيير ميكروبيبيتي نصائح عند التعامل مع عينات متعددة. تطبيق "الحل التثبيت" مباشرة إلى الجزء السفلي من الطبق يمكن أن تلحق الضرر الخلايا-
ضع الطبق في صحن ثقافة مربعة. يهز الطبق الثقافة مربعة برفق لتوزيع "حل التثبيت" عبر كشف الغطاء بالتساوي.
إينكوباتي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة-
"تثبيت الحل نضح" من الطبق.
2 مل من برنامج تلفزيوني للطبق من الجدار الجانبي للطبق.
ملاحظة: تطبيق برنامج تلفزيوني مباشرة إلى الجزء السفلي من الطبق يمكن أن تلحق الضرر الخلايا-
"برنامج تلفزيوني نضح" من الطبق.
.
ملاحظة: يمكن تخزين الطبق لمدة أسبوع واحد في 4 درجات مئوية مع كشوف غطاء حمم في 2 مل PBS.

5. تلوين DAPI

لزجاج شريحة، وتطبيق 1 ميكروغرام/مل ميكروليتر 5 DAPI تلطيخ كاشف.
ملاحظة: DAPI تلطيخ الكاشف مستقر لمدة 6 أشهر عند تخزين محمية من الضوء في أو أقل من-20 درجة مئوية.
باستخدام مشرط، إزالة بكشف الغطاء عن الطبق.
رسم إيقاف برنامج تلفزيوني الزائدة على كشف الغطاء بلمس حافة بكشف الغطاء مع منشفة ورقية.
بكشف الغطاء رأسا على قطره DAPI تلطيخ كاشف على زجاج الشريحة حيث أن الخلايا تتعرض لتلطيخ كاشف DAPI.
ملاحظة: هذه الخطوة حساسة للوقت. تجفيف DAPI تلطيخ كاشف يمكن أن تؤدي إلى تلطيخ الأمثل.
يمكن تخزين العينات لمدة سنة في-20 درجة مئوية.

6. التقاط صور

فحص العينة في مجهر الأسفار. هي تصور الأنوية باستخدام عامل التصفية DAPI.
ملاحظة: أما يمكن استخدامها 20 X أو عدسة نفط س 60، وفقا للباحث ' s الفائدة. عند استخدام عدسة نفط س 60، أضف قطره واحدة من النفط على كشف الغطاء. كن حذراً من أن العينات لا تلمس العدسة؛ وبخلاف ذلك، يمكن أن يحدث تلف العدسة.
الحصول على صور أنوية باستخدام كاميرا اتفاقية مكافحة التصحر وبرنامج اقتناء الصور الرقمية مع الإعدادات والمعلمات التالية: تصفية DAPI، الصور أحادي الطبقة، وكسب 1 X، والتعرض التلقائي.
الانتهاء من التقاط صور: مسح 20 X عدسة مع مناشف ورقية مبلل مع عدسة الأنظف. مسح 60 X عدسة النفط مع مناشف ورقية مبلل مع كلوروفورم.

7. تقييم "وضع موت الخلايا كلونوجينيك"

في الصور تم اختيارها عشوائياً، وحساب عدد الأنوية التي تفي بالمعايير للمبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية حتى يصل إجمالي عدد الأنوية تحسب 300. القيام بهذه الخطوة في ثلاث نسخ لكل إعداد تجريبية.
1. معايير للمبرمج: وجود apoptotic الهيئات (أي، نوى مكثف ومجزأ) ⁶ ^، ⁷-
2. معايير لكارثة الانقسامية: وجود نواة عرض اثنين أو أكثر من فصوص متميزة أو ميكرونوكلالصناعات الاستخراجية ⁸ ^، ^، من ⁹ ¹⁰-
3. معايير للشيخوخة الخلوية: وجود بؤر heterochromatic المرتبطة بالشيخوخة (صاف) (أي، الحمض النووي تحتوي على البؤر مشرقة وكثافة 30-50) ² ^، ¹¹-

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكمثال على ذلك، كانت الخلايا البشرية osteosarcoma U2OS تعامل مع "الأشعة السينية غراي" 6 والمحتضنة ح 72 ويتعرضون إلى DAPI تلطيخ المقايسة وفقا للبروتوكول. ويبين الشكل 1 الصور أسرع مورفولوجيس النووية النمطية المرتبطة بالمبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية التي تم الحصول عليها باستخدام عدسة نفط 60 ×. الرجوع إلى الخطوات 7.1.1-7.1.3 مورفولوجيس المميزة لكل وضع من موت الخلايا كلونوجينيك. رقم 2 يعرض نظرة عامة على الصور من الأنوية التي تم الحصول عليها باستخدام عدسة X 20. التشعيع "الأشعة السينية غراي" 6 الناجم عن كارثة الانقسامية في كثير من الأحيان والمبرمج أقل تواترا والشيخوخة الخلوية إلا نادراً. بهذه الطريقة، دراسة في حقل تضخم منخفض يسمح أحد للقبض على نظرة سريعة على الصورة العامة للشخصية موت الخلية كلونوجينيك في وضع تجريبي معين. ويبين الشكل 3 تمثيل رسومي للبيانات الكمية.

figure-results-1
رقم 1: تكبير الصور الملطخة DAPI نويات عرض مورفولوجيس نموذجية للمبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية. كانت الخلايا U2OS المشع مع 6 "غراي والأشعة السينية". بعد 72 ساعة، كانت الخلايا الثابتة والملون مع DAPI. الصور النووية تم الحصول عليها استخدام 60 X عدسة النفط. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-2
رقم 2: نظرة عامة على الصور الملطخة DAPI نويات الخلايا تعامل مع الأشعة السينية. خلايا U2OS المشع "الأشعة السينية غراي" 6 أو المشع وهمية. بعد 72 ساعة، كانت الخلايا الثابتة والملون مع DAPI. الصور نويات تم الحصول عليها باستخدام عدسة X 20. دوائر، المبرمج؛ أسهم، كارثة الانقسامية. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3: البيانات الكمية للمبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية التي يسببها في الخلايا تعامل مع الأشعة السينية. خلايا U2OS المشع "الأشعة السينية غراي" 6 أو المشع وهمية. بعد 72 ساعة، كانت الخلايا الثابتة والملون مع DAPI. الصور نويات تم الحصول عليها باستخدام عدسة X 20. من حقول عشوائية، تم تقييم ما مجموعة 300 الأنوية للمبرمج (Ap) وكارثة الانقسامية (MC)، والشيخوخة الخلوية (Sns). التقييمات التي أجريت في ثلاث نسخ. يتم عرض القيم متوسط، وأشرطة الخطأ تشير إلى الانحرافات المعيارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فيما يلي الخطوات الحاسمة ضمن البروتوكول. أولاً، الخلايا ينبغي زراعتها على الطبق الثقافة كأحادي الطبقة لإجراء تقييم الخصائص مورفولوجية لنوى DAPI الملون من الصعب لخلايا متعددة الطبقات. تحقيقا لهذه الغاية، في خطوة 2.9، يوصي بنقل دقيق للطبق الثقافة إلى حاضنة؛ اهتزاز للطبق الثقافة يولد دوامة خلايا مع وقف التنفيذ الذي يؤدي إلى تركيز الخلايا في مركز الطبق الثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي تجنب أوفيركونفلوينسي مما يؤدي إلى خلايا متعددة الطبقات. تحقيقا لهذه الغاية، في خطوة 2.7، يمكن تعديل عدد الخلايا المصنفة في الطبق ثقافة تستند إلى السكان مضاعفة الوقت والفاصل الزمني بين الإشعاع والتثبيت. ويوصي بالجمع بين ما يقرب من 80 في وقت التثبيت. ثانيا، المهم السرعة في التثبيت وتلطيخ DAPI (أي، الخطوات 4 و 5). عدم تناسق بين عينة فيما يتعلق بالوقت الذي تستغرقه هذه الخطوات يمكن أن يؤدي إلى عدم التجانس في كثافة إشارة DAPI في الأنوية، الذي من شأنه أن يحجب تقييم الخصائص المورفولوجية.

في الخطوة 2، 2، يمكن زيادة عدد كشوف الغطاء في صحن ثقافة واحدة؛ يمكن وضعها كحد أقصى أربعة تغطية كشوف في طبق 35 ملم، ويمكن زيادة العدد زيادة استخدام الأطباق أكبر. وضع كشوف تغطية متعددة في كل طبق الثقافة يتيح التشغيل الكفء للوقت بالطبع تقييم معاملة معينة (أي، غطاء يمكن جمعها بكشوف من طبق ثقافة واحدة تلو الأخرى في نقاط زمنية متعددة للفائدة).

في الخطوة 3، 2، يمكن تعديل جرعة الإشعاع وفقا للاهتمام الباحثين. تطبيق جرعة تتفق على خطوط خلايا متعددة تمكن المقارنة بين حساسية لوضع كل من موت الخلايا كلونوجينيك بين خطوط الخلايا. من ناحية أخرى، يمكن استخدام جرعات بقاء iso-كلونوجينيك لكل خط الخلية مقارنة كلونوجينيك خلية الموت التشكيلات الجانبية بين خطوط الخلايا. يمكن تحديد الجرعة بقاء إيزو--كلونوجينيك بواسطة مقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك¹². القيمة₁₀ د، الجرعة التي توفر 10% كلونوجينيك البقاء على قيد الحياة، نقطة مشتركة للجرعة بقاء iso-كلونوجينيك.

في الخطوة 3، 3، يمكن تعديل الوقت من الإشعاع للتثبيت وفقا للفائدة الباحثين؛ هذا مهم لأن فترة الذروة للمبرمج المستحثة بالأشعة تحت الحمراء، وكارثة الانقسامية، والشيخوخة الخلوية تختلف وفقا لخط الخلية والعلاج. في هذه المقالة، استخدمنا ح 72 بعد التشعيع كالنقطة الزمنية التي ستكون أكثر فائدة للفحص الأولى ملامح الموت الخلية كلونوجينيك، واستنادا إلى دراسات متعددة من مجموعتنا ووصف آخرون كما يلي²¹^،^، ³ ^, ⁴ ^, ⁸ ^, ⁹: (ط) المبرمج الناجمة عن أشعة X في خلايا المنشأ من الأورام الصلبة معظمها يحدث بضعة أيام بعد التشعيع. (ثانيا) X-أشعة الناجمة عن كارثة الانقسامية في الخلايا السرطانية يحدث أبرزها في الثانية أو الثالثة والانقسام بعد الإفراج عنهم من إلقاء القبض على دورة الخلية المؤقتة الناجمة عن الإشعاع. عادة ما يحدث الإفراج عن حوالي 24 ساعة بعد التشعيع، يتبع من ميتوسيس المتكررة على فترات من حوالي 24 حاء (ثالثا) إكس-رأي – الناجمة عن الشيخوخة الخلوية يصبح واضحا بعد فاصل زمني يتوقف على خط الخلية في السؤال: بعد يومين تشعيع لبعض الحالات المبكرة، و 7 أيام بعد التشعيع لمعظم خطوط الخلايا. بعد الحصول على صورة شاملة للخلية كلونوجينيك ملامح الموت من الفحص الأولى، وقت التجارب بالطبع سوف توفر توضيح أكثر تفصيلاً من وقت الذروة لوضع كل من موت الخلايا كلونوجينيك في خط الخلية المحددة و/أو شرط ⁴من الفائدة.

تجدر الإشارة إلى أن DAPI تلطيخ المقايسة ومقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك، أسلوب معيار الذهبي لتقييم حساسية الإشعاعات، ليست قابلة للتبديل. كارثة الانقسامية والمبرمج فقط تستمر لساعات. وهكذا، يكشف DAPI تلطيخ المقايسة لنقطة زمنية معينة المبرمج وكارثة الانقسامية التي تحدث عند نقطة وقت التقييم. من ناحية أخرى، نتائج بقاء كلونوجينيك الاعتداء في وقت معين نقطة تشمل المبلغ الإجمالي للمبرمج وكارثة الانقسامية التي وقعت خلال فترة الحضانة عادة 10-14 يوما بعد التشعيع. تبقى مختلفة من المبرمج وكارثة الانقسامية، وخلايا مسن على الطبق الثقافة؛ أنها تتراكم تدريجيا مع مرور الوقت وبعد التشعيع. ولذلك، تعكس النتائج على حد سواء DAPI تلطيخ المقايسة ومقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك المبلغ الإجمالي للشيخوخة التي حدثت أثناء فترة الحضانة. الأهم من ذلك، تتفاوت نسبة المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الناجمة عن الإشعاع على نطاق واسع وفقا للخلية خط وتشعيع الجرعات. أخذت معا، نظرياً، نتائج تحليل واحد لا يمكن ترجمتها مباشرة إلى تلك مقايسة الأخرى.

وقد DAPI تلطيخ المقايسة عدد قليل من القيود. أولاً، أنه لا يزال المثير للجدل عما إذا كانت الكارثة الانقسامية طريقة متميزة لموت الخلايا. في ميدان البيولوجيا الإشعاعية، يعتبر كارثة الانقسامية وسيلة رئيسية لموت الخلايا المستحثة بالأشعة تحت الحمراء التي تختلف عن آليات أخرى ل موت الخلية كلونوجينيك¹. من ناحية أخرى، يجادل آخرون بأن كارثة الانقسامية ليست طريقة متميزة لموت الخلية ولكن بدلاً من ذلك عملية التي تسبق موت الخلايا المبرمج ونخر¹³^،¹⁴منها. وهكذا، المبرمج وكارثة الانقسامية قد تتداخل إلى حد ما. الدراسات السابقة، والثانية تشير إلى أن الشيخوخة الخلوية يمكن أن تحدث في غياب صاف في بعض خطوط الخلايا ومعالجة إعدادات². في فحوصات الحالية، وأخرى مصممة خصيصا لكل خلية كلونوجينيك يجب استخدام وضع الموت لزيادة متانة الاستنتاجات التي خلصت إليها تجربة معينة. ثالثا، لا يمكن تقييم DAPI تلطيخ مقايسة وسائط موت الخلايا كلونوجينيك خلاف المبرمج وكارثة الانقسامية والشيخوخة الخلوية (مثلنخر وأوتوفاجي)،. رابعا، قد لا تم توضيح فائدة DAPI تلطيخ المقايسة مؤشرا لاستجابة الورم للعلاج الإشعاعي في العيادة. من وجهة النظر هذه، مقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك، الذي يقيم المبلغ الإجمالي لموت الخلية كلونوجينيك، متفوقة على DAPI تلطيخ المقايسة لأنه تم إنشاء ارتباط بين SF2، الكسر الباقين على قيد الحياة من خلايا المشع مع 2 غراي الأشعة السينية، واستجابة الورم للعلاج الإشعاعي¹⁵. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن مقايسة البقاء على قيد الحياة كلونوجينيك لا يستخدم على نطاق واسع في العيادة، أساسا بسبب الحاجة إلى درجة عالية من الخبرة وفترة طويلة من الزمن (أي14 يوما) للحصول على البيانات. وعلى سبيل المقارنة، إجراءات DAPI تلطيخ المقايسة أبسط وتستغرق وقتاً أقل، حوالي 3-4 أيام، إلى حد كبير لتوليد نتائج. الأداة المساعدة لتلطيخ DAPIوسيتم اختبار المقايسة مؤشرا لاستجابة الورم للعلاج بالأشعة في العيادة في المستقبل القريب.

وخلاصة القول، DAPI تلطيخ مقايسة مقايسة خطوة واحدة فعالة من حيث التكلفة لتقييم ثلاثة أنماط رئيسية من موت الخلايا كلونوجينيك المستحثة بالأشعة تحت الحمراء في نفس الوقت. ويسمح هذا النهج واحدة الشاشة بسهولة مع أوضاع من موت الخلايا كلونوجينيك لمختلف خطوط الخلايا وإعدادات معالجة النقاط الزمنية، بهدف توضيح آليات موت الخلية في الخلايا المستهدفة والشروط للفائدة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر السيدة أكيكو شيباتا للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل بمعونة من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا في اليابان عن برامج للمدارس الرائدة في الدراسات العليا، وزراعة قادة العالم في المداواة أيون الثقيلة والهندسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي
زلة الغطاء	ماتسونامي	C013001
بارافورمالدهايد	سيجما-ألدريتش	P6148-1KG
السكروز	سيجما-ألدريتش	84097-250G
محلول ملحي مخزن بالفوسفات	Cosmo Bio	16232000
مشرط	كاي الطبي	رقم 20 ، طبق ثقافة الخلايا 520-A
35 مم	Falcon	353001
التربسين	واكو	201-16945
مجهر الطور المقلوب	شيمازو	114-909
السينية المبرد	الفاكسيترون Bioptics	الفاكسيترون RX-650
طبق ثقافة مربع	Corning	431110
زجاج منزلق	Matsunami	Pro-11
DAPI كاشف	تلطيخإشارات الخلية	8961S
مجهر مضان	نيكون	كليبس نيكل
مجهر مضان DAPI مرشح	نيكون	U-FUW ، BP340-390 ، BA420IF ، DM410
عدسة مجهر مضان (20 مرة ؛)	نيكون	خطة أبو & لامدا; 20X/0.75
عدسة مجهر مضان (60 مرة, زيت)	نيكون	خطة أبو & 60X/1.40 زيت
	أوليمبوس	N5218600
كاميرا CCD	نيكون	DS-Qi2
برنامج الحصول على الصور الرقمية	نيكون	NIS-Elements
	أوليمبوس	OT0552
كلوروفورم	واكو	035-02616

الأشعة منظف عدسة المستندات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wouters, B. G. Cell death after irradiation: how, when and why cells die. Basic Clinical Radiobiology. 4th ed. Joiner, M. C., van der Kogel, A. J. , Hodder Education. London. 27-40 (2009).
Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol. Biol. 965, 185-196 (2013).
Kobayashi, D., et al. Mitotic catastrophe is a putative mechanism underlying the weak correlation between sensitivity to carbon ions and cisplatin. Sci. Rep. 7, 40588(2017).
Amornwichet, N., et al. Carbon-ion beam irradiation kills X-ray-resistant p53-null cancer cells by inducing mitotic catastrophe. PLoS One. , 115121(2014).
Masters, J. R., Stacey, G. N. Changing medium and passaging cell lines. Nat. Protoc. 2, 2276-2284 (2007).
Sawai, Y., et al. Effectiveness of sulforaphane as a radiosensitizer for murine osteosarcoma cells. Oncol. Rep. 29, 941-945 (2013).
Cummings, B. S., Wills, L. P., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Curr. Protoc. Pharmacol. , Suppl. 56, Chapter 12: Unit 12.8 (2012).
Oike, T., et al. C646, a selective small molecule inhibitor of histone acetyltransferase p300, radiosensitizes lung cancer cells by enhancing mitotic catastrophe. Radiother. Oncol. 111, 222-227 (2014).
Oike, T., et al. A synthetic lethality-based strategy to treat cancers harboring a genetic deficiency in the chromatin remodeling factor BRG1. Cancer Res. 73, 5508-5518 (2013).
Russo, A. L., et al. In vitro and in vivo radiosensitization of glioblastoma cells by the poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor E7016. Clin. Cancer Res. 15, 607-612 (2009).
Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat. Cell Biol. 13, 292-302 (2011).
Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nat. Protoc. 1, 2315-2319 (2006).
Vakifahmetoglu, H., Olsson, M., Zhivotovsky, B. Death through a tragedy: mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 15, 1153-1162 (2008).
Imreh, G., Norberg, H. V., Imreh, S., Zhivotovsky, B. Chromosomal breaks during mitotic catastrophe trigger γH2AX-ATM-p53-mediated apoptosis. J. Cell Sci. 129, 1950(2016).
Torres-Roca, J. F. A molecular assay of tumor radiosensitivity: a roadmap towards biology-based personalized radiation therapy. Per. Med. 9, 547-557 (2012).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DAPI

البروتوكول خطوة واحدة لتقييم الوضع من موت الخلايا كلونوجينيك الإشعاع بالفحص المجهري Fluorescence

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة