توضح هذه المقالة بروتوكول لعزله أكسينيك على نطاق واسع وجمع من ميراسيديا تخترق من حظ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه وتجهيزها اللاحقة لإدخال الثقافة في المختبر .
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
العزل الجماعي وزراعة في المختبر من مراحل إينترامولوسكان لحظٌ الدم البشري بلهارسيه المنسونيه
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وقد المثقوبة الدم البشري، بلهارسيه spp.، لها دورة حياة معقدة تشمل المراحل الإنمائية اللاجنسي والجنسي داخل القواقع الوسيطة والثدييات مضيف نهائي، على التوالي. القدرة على عزل والمحافظة عليها في مراحل مختلفة من دورة الحياة تحت ظروف الثقافة في المختبر سهلت إلى حد كبير تحقيقات الآليات الخلوية والكيمياء الحيوية والجزيئية التي تنظم النمو الطفيلي، والتنمية والمضيف التفاعلات. ويتطلب انتقال البلهارسيا اللاجنسي والتنمية متعددة المراحل اليرقات داخل البلد المضيف الحلزون؛ من ميراسيديوم المعدية، من خلال سبوروسيستس الأولية والثانوية، إلى المرحلة النهائية السباحين الذي يتم المعدية للبشر. في هذه الورقة نقدم بروتوكول خطوة بخطوة الفقس الجماعي وعزل بلهارسيه المنسونيه ميراسيديا من البيض التي تم الحصول عليها من كبد الفئران المصابة، وإدخالها لاحقاً إلى الثقافة في المختبر . ومن المتوقع أن البروتوكول مفصلاً ستشجع الباحثين جديدة للانخراط في وتوسيع هذا المجال الهام من بحوث البلهارسيا.
المقدمة
الإنسان الدم المثقوبة بلهارسيه spp.، وهي العوامل المسببة لمرض البلهارسيا، أمراض استوائية مهملة التي يعاني منها على 230 مليون شخص في العالم ما يقدر1. الأنواع الأكثر انتشارا، المنسونيه بلهارسيه، تتوزع جغرافيا في أمريكا الجنوبية والأرخبيل منطقة البحر الكاريبي، والشرق الأوسط و أفريقيا الصحراء2. دورة حياة س. المنسونيه، والأخرى المنشقات، معقد، والتي تنطوي على مضيف نهائي الثدييات والقواقع المياه العذبة من جنس كان بمثابة تلزم الوسيطة المضيفين.
دودة البالغين الذكور والإناث المنسونيه س. أزواج يعيشون في عروق المساريقي العلوي الخلفي تتكاثر الثدييات المضيفة، أسفر عن إطلاق سراح امبريوناتيد البيض (البويضات) التي أصبحت استقرت في الأوردة الصغيرة في الغشاء المخاطي المعوي. البيض ثم فواصل من خلال جدران الأوعية، تهاجر من خلال الأنسجة المخاطية، وأدخل في نهاية المطاف التجويف المعوي حيث أنها هي باطلة مع البراز. عند إدخال البويضات هاتش المياه العذبة وتخترق اليرقات (ميراسيديا)، يجب، في وقت قصير، وجدوا حلزون كان مناسبة لتصيب من أجل مواصلة دورة الحياة. تتضمن هذه العملية الإصابة مرفق ميراسيديال إلى سطح الجسم الخارجي في الحلزون متبوعاً باختراق النشطة ودخول اليرقة إلى المضيف. فور دخول، يبدأ ميراسيديوم إلقاء لوحات البشرة عضو الخارجي حيث أنه يشكل سينسيتيوم التي ستصبح على السطح الخارجي الجديد (لحافة) للمرحلة القادمة اليرقات سبوروسيست الأولية أو الأم. من خلال اللاجنسي، تنتج كل سبوروسيست الأولية والنشرات جيل ثان من سبوروسيستس، ووصف الثانوية أو ابنه سبوروسيستس، التي تخلق بدورها، والإفراج عن إعداد كبيرة من المرحلة النهائية إينترامولوسكان، المذنبات3 . الهروب من البلد المضيف الحلزون، سيركاريا تخترق عند قادر على إرفاق ومباشرة اختراق الجلد من مضيف الثدييات مناسبة البشرية أو غيرها. عند دخول المضيفة الجديدة، سيركاريا تحويل إلى مرحلة شيستوسومولا الطفيلية وغزو نظام الأوعية الدموية. ، بدوره، تهاجر إلى الرئة ومن ثم إلى الوريد الكبدي حيث تنضج الديدان الكبار وشكل أزواج من الذكور والإناث والسفر إلى الأوردة المساريقي العلوي لإكمال دورة حياتها.
إينترامولوسكان بنجاح أو تطوير "المرحلة الحلزون" المنشقات اليرقات ضروري لاستمرار دورة للبشرية مضيف إلى مضيف الإرسال. أهمية حاسمة هو دخول ميراسيديوم تخترق إلى المضيف الحلزون وتحولها المبكر للمرحلة الابتدائية سبوروسيست الفترة التالية. اعتماداً على توافق الفسيولوجية والمناعية بين المضيف والطفيلي، فمن خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات أن النجاح الأولى أو عدم إثبات الإصابات هو العزم4،5،6 . التطور اللاحق للابتدائي سبوروسيستس قادرة على إنتاج بلا تزاوج سبوروسيستس الثانوية، ثم تولد سيركاريا الإنسان المعدية، كذلك تتطلب بيئة متساهلة مضيف فسيولوجية التي توفر لكل من النمو الطفيلي و يحتاج الإنجابية.
وحتى الآن، يعرف الكثير عن الأساسية الفسيولوجية، والكيمياء الحيوية والجزيئية عمليات مراقبة التفاعلات المنشقات-الحلزون، لا سيما الجزيئات ومسارات تشارك في تنظيم التنمية اليرقات والإنجاب، أو تحوير الاستجابات المناعية المضيف. سهولة الوصول إلى إعداد كبيرة من هذه المراحل اليرقات في ظروف في المختبر الثقافة التي تسمح بالتلاعب التجريبية سيسهل اكتشاف المسارات الإنمائية والآليات الأساسية لنمو الخلايا، التمايز والاستنساخ. المسارات الحرجة الطفيلي أو آليات، يتم تحديدها من خلال التجريب في المختبر ، ثم يمكن لعرقلة نمو اليرقات/الاستنساخ في المضيف الحلزون، أو لتحديد الحلزون المضيف المناعية الآليات المعنية بالاعتراف والقضاء على مراحل ميراسيديال أو سبوروسيست.
وفي هذه المادة وعرض الفيديو، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لطريقة لعزل عدد كبير من تخترق المنسونيه س. ميراسيديا لإدخال الثقافة في المختبر الذي ثم يمكن أن يتعرضوا للمتابعة التجريبية التلاعب (انظر الشكل 1 نظرة تخطيطي لسير عمل البروتوكول). على الرغم من أن إجراءات مماثلة قد وصفت سابقا7،،من89، شعرنا أن بروتوكول مفصلة ستكون مفيدة للباحثين الذين يرغبون في استخدام هذا النموذج لمعالجة ما زالت التساؤلات المتصلة ب التنمية اليرقات إينترامولوسكان وانتشار الهاتف الخلوي، والتفاعلات المناعية المنشقات-الحلزون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة تكييف هذا النهج لعزل البيض من غيرها تريماتودا طبيا هامة مثل المثانة مسكن دموية سأو المثقوبة الكبد أو الرئة المثقوبة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
موافقة جميع الإجراءات التجريبية ورعاية الحيوان الحيوان الرعاية المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة ويسكونسن-ماديسون تحت البروتوكول لا. V005717. البروتوكول التالي ينطوي على العمل في منشأة للسلامة الأحيائية المستوى 2 (BSL2) لمسببات الأمراض البشرية، على الرغم من أن أيا من مراحل المنشقات المبينة في هذا البروتوكول معدية للبشر أو لغيرها من الثدييات. اتبع سياسات مؤسسية للتعامل مع مسببات الأمراض البشرية خطر المجموعة 2 (RG2).
ملاحظة: نستخدم الإناث الفئران السويسرية وبستر (6-أسبوع من العمر) بسبب تعرضها أعلى إلى10من العدوى، وبالتالي تحقق أكبر بيضة أعباء. وتصف تاكر et al. الماوس والقواقع العدوى البروتوكولات المستخدمة في هذا النظام النموذجي11. يسرد الجدول للمواد جميع معدات محددة ومواد، الكواشف والمصادر الحيوانية اللازمة لتنفيذ هذا البروتوكول التجريبي.
1-تجهيز الكبد المصابة
- Euthanize الفئران، 6-7 أسابيع بعد الإصابة، بالاختناق2 CO (معدل 10-30% حجم الدائرة في الدقيقة الواحدة). مراقبة الفئران لوقف التنفس وضربات القلب.
ملاحظة: عادة ما يصل إلى 20 من الفئران قد تتم معالجة في وقت معين. - بعد نقل euthanized الفئران للسلامة الأحيائية مجلس الوزراء، ضع الماوس على ظهورهم والرش على الأسطح البطني مع الإيثانول 70%. واسمحوا نقع لمدة 1 دقيقة.
- قرصه وسحب الجلد أسفل البطن وقطع عبر القاعدة الجلد انتزعت الأقرب إلى البطن مع مقص جراحي معقم. سحب قطع الجلد الأسفل (أي نحو الرأس) للكشف عن الكبد. ملاحظة أن الكبد ينبغي توسيعه ومنقط بسبب استجابة حبيبية المستحثة بالبيض (الشكل 2A).
- إزالة الكبد ووضعه في كوب يحتوي على 200 مل من معقم 1.2% كلوريد الصوديوم الحل الذي يتضمن القلم/بكتيريا.
- كرر الخطوات من 1.3 و 1.4 مع الفئران المتبقية.
ملاحظة: عادة ما يتم معالجة الفئران العشرين في محصول واحد. - وضع الكبد في طبق بتري معقم وإزالة الأنسجة الضامة الدهون/غير الكبد مع الملقط العقيمة.
- نقل كبد قلص/تنظيف زجاجة معقمة للطرد مركزي 250 مل تحتوي على ~ 200 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% العقيمة مع القلم/بكتيريا.
- قوة يهز زجاجة تحتوي على الكبد، واستخدام ماصة المتاح عقيمة، إزالة السطح الزائد رغوة/تعويم الحطام. ببطء من أجل إيقاف المحلول الملحي المتبقي في حاوية أو بالوعة تحتوي على 1% التبييض (مطهر).
- إضافة ~ 200 مل المحلول الملحي الطازجة للكبد، وكرر الخطوة 1.8 ثلاث مرات أكثر.
2-الكبد العزلة الاستخراج وميراسيديال
- وضع الكبد في كأس خلاط الفولاذ المقاوم للصدأ عقيمة صغيرة وإضافة ~ 2 مل محلول كلوريد الصوديوم 1.2% (الشكل 2).
- تغطية الكأس بإحباط وطبق بيتري لمنع الانسكابات، ومزج لمدة 1 دقيقة بالتناوب منخفضة وعالية السرعة (20 s منخفضة السرعة/10 ق عالية السرعة؛ وتكرار) (الشكل 2).
- توزيع بالتساوي بتعليق الكبد المخلوطة في زجاجات معقمة 250 مل أجهزة الطرد المركزي (لاستخدام كبد 20 4 زجاجات).
- إضافة المحلول الملحي المعقم بالمضادات الحيوية إلى حجم إجمالي ~ 200 مل/الزجاجة. وزن/التوازن الزجاجات قبل الطرد المركزي.
- كبد المخلوطة في ز 290 x لمدة 15 دقيقة في 4 س"جيم بلطف" صب قبالة سوبيرناتانتس في حاوية مع التبييض قبل التخلص من أجهزة الطرد المركزي.
- كرر الخطوات من 2.4-2.5 مرة. يجب التأكد من دقة ريسوسبيند الكبد الرسوبيات قبل الطرد المركزي.
- بعد التخلص من المياه المالحة الماضي يغسل (2.6 خطوة)، بإضافة 200 مل مياه الأحواض العقيمة مع القلم/بكتيريا نسيج الكبد الأعلاف، اهتز ريسوسبيند الرواسب، ونقل التعليق لتعقيم قارورة حجمي 1-L التي قد تم تغطيتها بشكل كامل مع الألومنيوم إحباط، باستثناء الجزء العلوي 3 سم الرقبة (الشكل 2D).
ملاحظة: استخدام زجاجتين (= كبد 10) كل قارورة 1-L. مياه الأحواض يحاكي بيئة المياه العذبة الطبيعية اللازمة لحفز ميراسيديال الفقس من البيض. - استخدام مياه الأحواض العقيمة، تملأ قارورة إلى حوالي 3 سم فوق إحباط تغطي على الرقبة. ثم، دون تأخير (كما ميراسيديا تبدأ قريبا التظليل) وإزالة الرغاوي المتبقية وأنسجة الكبد تطفو على السطح قبل بيبيتينج بسرعة حتى مل ~ 12 من أحواض المياه التي تحتوي على الحطام وتجاهل ذلك إلى منفصل تجاهل الأنبوبة. استبدال المياه العذبة الأحواض العقيمة.
- كرر التنظيف الخطوة 2.8، ثلاث مرات، والتحقق من وجود ميراسيديا في الأنبوب المرتجع. الكف عن تكرار التنظيف الخطوة إذا ميراسيديا تظهر في الحل الغسيل.
- بعد الغسيل الأخير، إضافة ببطء ~ 12 مل مياه الدافئة البركة العقيمة (قبل ارتفعت درجة حرارة 30 سج) لإنشاء تدرج درجة الحرارة مع الماء الدافئ نظيفة ومعقمة في الأعلى.
ملاحظة: هذا هو إنجاز أفضل بتصريف المياه على طول الجانب من الرقبة قارورة لتجنب الاختلاط ببطء. - ضع غطاء صحن بتري صغير على فتح قارورة وتسليط ضوء الساطع عبر الجزء العلوي من قارورة أعلاه غلاف إحباط لإلقاء الضوء على السطح العلوي للمياه.
ملاحظة: عادة، خلال 5-10 دقيقة، السباحة ميراسيديا، تنجذب إلى الضوء، وسوف تركز بإعداد كبيرة داخل سم 2-3 أول من الأحواض المائية (الشكل 3A).
3. زراعة وحصاد ميراسيديال
- عندما جمعوا ميراسيديا في السطح بعد 10 دقائق، باستخدام بيبيت نقل عقيمة، إزالة ~ 8 مل من الأحواض المائية ونقل إلى أنبوب الطرد مركزي 15 مل عقيمة. ضع الأنبوب الذي يحتوي على ميراسيديا على الجليد.
- إضافة مل 8 مرة أخرى من المياه الدافئة البركة العقيمة على طول داخل دورق حجمي وانتظر 10 دقائق أخرى.
- استخدام أنابيب جديدة كل مرة، كرر الخطوات من 3.1 و 3.2 ثلاث مرات أكثر. بعد جمعال 4، إبقاء الأنبوب النهائي على الجليد لمدة 10 دقيقة للسماح ميراسيديا تسوية. وتضم هذه المجموعة من أنابيب الحصاد الأول.
- أنابيب الطرد المركزي الذي يحتوي على ميراسيديا في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سج في مبردة قبل تبريد أجهزة الطرد مركزي.
- على الفور إزالة معظم المادة طافية (~ 7 مل) مع الحرص على عدم تعكير بيليه الطفيلي (الشكل 3B).
- تجمع جميع ميراسيديا من هذا المحصول الأول في أحد أنبوب، ثم شطف جميع الأنابيب الأصلي مع ~ 1 مل ماء البركة العقيمة، وإضافة إلى الأنبوب "المجمعة".
- السماح للطفيليات ليستقر على الجليد ل ~ 5 دقيقة، ومرة أخرى الطرد المركزي الطفيليات في 290 x ز لمدة 1 دقيقة في 4 سجيم
- بعناية إزالة المادة طافية وإضافة Chernin العقيمة في 6-8 مل متوازنة الحل الملح (مجلس دول بحر البلطيق +؛ انظر الجدول للمواد) التي تحتوي على القلم/بكتيريا.
- بلطف بتعليق ميراسيديا وقاسمه لهم في لوحة ثقافة 24-جيدا (1 مل كل بئر)، تليها الشطف الأنبوب في 6-8 مل مجلس دول بحر البلطيق + وإضافة 1 مل شطف لكل بئر. احتضان الطفيليات في 26 سج تحت ظروف نورموكسيك. تركيزات ميراسيديا معزولة سوف تختلف، ولكن سيتم عادة المتوسط ~ 7000 مليلتر.
- إذا كانت لا تزال هي تركيز الطفيليات في مصدر الضوء، كرر الخطوات 3.1 إلى 3.9 لمواصلة الحصاد أواخر الفقس ميراسيديا لكن زيادة الفاصل الزمني بين المجموعات إلى 15-20 دقيقة.
ملاحظة: تمثل هذه المجموعة الجديدة من أنابيب الحصاد الثاني. ومع ذلك، نظراً لأن الأرقام ميراسيديال عادة منخفضة، اليرقات من جميع الأنابيب عادة مجمعة في ثقافة واحدة تتضمن أيضا 2 مل مجلس دول بحر البلطيق +. - في 24 ساعة بعد الحصاد، وزراعة، ريسوسبيند بلطف سبوروسيستس في آبارهم التي بيبيتينج.
- انتظر بضع دقيقة للسماح للطفيليات لتسوية إلى الجزء السفلي من الآبار. بمجرد أنهم استقروا بعناية إزالة المادة طافية (مل ~1.5)، التي سوف تحتوي على معظم لوحات البشرة عضو يلقي بها ميراسيديا خلال التحول اليرقات. أن تجاهل هذا "التحول" طافية أو إدماج دراسات المتابعة للمنتجات الافرازية اليرقات.
- إضافة 1.5 مل من جديد مجلس دول بحر البلطيق + لكل بئر وماصة ريسوسبيند سبوروسيستس برفق. كرر الخطوة 3، 12 إذا كان المطلوب هو زيادة الغسيل أو تغييرها إلى وسيلة مختلفة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الغالبية العظمى من ميراسيديا عادة سوف قد جمعت في الأولين "الحصاد". حضانة ميراسيديا معزولة في مجلس دول بحر البلطيق + مشغلات عملية التحول ميراسيديوم إلى سبوروسيست (الشكل 4 أ-ج). خلال الساعة الأولى الآبار التالية نقل إلى الثقافة التي تحتوي على + مجلس دول بحر البلطيق، أغلبية ميراسيديا وقف السباحة (الشكل 4 أ). في 6 ح في الثقافة، ميراسيديا حاليا بنشاط ذرف لوحات البشرة عضو (الشكل 4 باء). تز...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ميراسيديا س. المنسونيه، معزولة والتلاعب بها كما هو موضح هنا، يمكن أن تصيب فقط المضيف القواقع الوسيطة، ولذلك لا تمثل الإخطار البيولوجية بشرية خلال هذه المرحلة من التنمية اليرقات. بيد لتجنب التعرض العرضي/العدوى من القواقع، ينبغي الحرص أداء العزلة ميراسيديال في موقع آخر من المجالات التي قد يكون فيها عرضه كان الحلزون الأنواع الحالية أو صيانتها. غرفة منفصلة، مسجلة كالفضاء BSL2، ينصح بشدة. وباﻹضافة إلى ذلك، غسل جميع الحلول المستخدمة في تجهيز الكبد وعزل اليرقات ينبغي أن تعامل بمطهر (مثلاً، 1% التبييض)...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لها علاقة بالكشف عن المؤلف.
شكر وتقدير
تمويل جزء من المعاهد الوطنية للصحة منحة RO1AI015503. قدمت الفئران المصابة المنشقات البلهارسيا نييد مركز الموارد في معهد البحوث الطبية الحيوية (روكفيل، دكتوراه في الطب) من خلال المعاهد الوطنية للصحة-نييد HHSN272201000005I العقد للتوزيع من خلال "موارد الشركة".
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي >محلول ملح متوازن من شيرنين (CBSS +) < / قوي > | < قوي > ل 1 لتر من المحلول < / قوي > | ||
| 2.8 جم كلوريد الصوديوم | فيشر Scientific | S271-3 | إذابة الأملاح ، باستثناء كلوريد الكالسيوم ، و ؛ |
| 0.15 غرام من كلوريد البوتاسيوم | Sigma-Aldrich | P5405 | في 800 مل ddH2O |
| 0.07 جم فوسفات الصوديوم ، ثنائي القاعدة اللامائي | فيشر Scientific | S374-500 | قم بإذابة كلوريد الكالسيوم بشكل منفصل في 200 & nbsp ؛ |
| 0.45 غرام كبريتات المغنيسيوم هيبتاهيدرات | سيجما ألدريتش | M1880 | مل ddH2O |
| 0.53 جم ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم | Mallinckrodt | 4160 | أضف الكالسيوم ببطء إلى الملح / السكر مع |
| 0.05 غرام بيكربونات الصوديوم | فيشر Scientific | S233-3 | مع خلط مستمر |
| 1 جم جلوكوز | MP Biomedicals | 152527 | ضبط على درجة الحموضة 7.2 وتصفية التعقيم باستخدام a & nbsp ؛ |
| 1 جم تريهالوز | سيجما ألدريتش | T0167 | 0.22 & micro ؛ م مرشح أعلى الزجاجة القابل للتصرف |
| 10 مل 100X البنسلين / الستربتومايسين | هيكلون | SV30010 | إضافة البنسلين المصفى والستربتومايسين soln ؛ الاستخدام السابق |
| <قوي>Bge غير المكتمل متوسط (Ibge) | <قوي>لمحلول 900 مل | ||
| 220 مل شنايدر' s ذبابة الفاكهة متوسطة معدلة | لونزا | 04-351Q | مزيج وسط شنايدر مع 680 مل ddH2O |
| 4.5 جم اللاكتالبومين التحلل الأنزيمي المائي | Sigma-Aldrich | L9010 | أضف تحلل اللاكتالبومين المائي والجالاكتوز |
| 1.3 جم galactose | Sigma-Aldrich | G0625 | اضبط على درجة الحموضة 7.2 وتعقيم التصفية باستخدام 0.22 & micro ؛ m مرشح زجاجة معقم مسبقا يمكن التخلص |
| منه <قوي > كامل Bge متوسط (cBge) < / قوي > | < قوي > ل 100 مل من المحلول < / قوي | ||
| > 90 مل وسط Bge | غير مكتمل لتعطيل FBS بالحرارة: احتضان FBS المذاب في & nbsp ؛ | ||
| 9 مل الحرارة غير الفعالة. مصل الأبقار الجنينية (FBS) (أوبتيما) حمام | Atlanta Biologicals | S12450 | عند 60 درجة ؛ C لمدة 1 ساعة بينما بلطف |
| 1 مل 100X البنسلين / الستربتومايسين | Hyclone | SV30010 | تدوير الزجاجة كل 10 دقائق Aliquot FBS المعطلة حراريا في أنابيب 15 مل ؛ وتخزينها في -20 درجة مئوية ؛ خلط متوسط + FBS و تعقيم المرشح باستخدام 0.22 & micro; م معقمة مسبقا مرشح أعلى زجاجة يمكن التخلص منه ؛ أضف البنسلين والستربتومايسين قبل الاستخدام |
| <قوي > ماء البركة (محلول مخزون) < / قوي > | <قوي > 1 لتر من محلول المخزون < / قوي > | ||
| 12.5 جم كربونات الكالسيوم | فيشر Scientific | C64-500 | امزج جميع الأملاح في 1 لتر من ddH2O |
| 1.25 جم كربونات المغنيسيوم | فيشر Scientific | M27-500 | لاحظ أن الأملاح لن تحتوي على كامل ؛ |
| 1.25 جم & nbsp ؛ كلوريد الصوديوم | فيشر Scientific | S271-3 | مذاب. رج العبوة بقوة لتعليق |
| 0.25 جم & nbsp; أملاح كلوريد البوتاسيوم | Sigma-Aldrich | P5405 | قبل صنع soln العامل ؛ |
| <قوي >مياه البركة (محلول عمل) < / قوي > | < قوي > 1.5 لتر من المحلول < / قوي > | ||
| 0.8 مل محلول مخزون مياه البركة (رج الاستخدام المسبق) في & nbsp ؛ | امزج المرق إلى ddH2O | ||
| 1500 مل من ddH2O | تعقيم مياه البركة عن طريق التعقيم (بطيء دورة) | ||
| 1.5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين ؛ | Hyclone | SV30010 | أضف البنسلين والستربتومايسين الاستخدام السابق |
| < قوي > محلول ملحي (1.2٪ كلوريد الصوديوم) < / قوي > | <قوي > 1.5 لتر من المحلول < / قوي > 18 | ||
| جم كلوريد الصوديوم في 1500 مل من محلول ملحي للأوتوكلاف ddH2O | Fisher Scientific | S271-3 | لتعقيم |
| 1.5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين | Hyclone | SV30010 | إضافة البنسلين والستربتومايسين الاستخدام السابق |
| <قوي>المعدات والمواد الإضافية: غرفة القتل الرحيم للفأر < / قوية > | |||
| 7 لتر | بعد بروتوكول IACUC المعتمد رقم V001551 | ||
| خزان CO2< / sub> ومنظم | |||
| زراعة الأنسجة 24 بئر | TPP | 92424 | |
| حجمية سعة 1 لتر | |||
| مصدر الضوء (150 واط) | جهاز طرد مركزي Chiu Tech Corp | موديل F0-150 | |
| ، مبرد ، دلو متأرجح | Eppendorf | موديل 5810R | |
| طرد مركزي زجاجات (250 مل) | Nalgene | ||
| 15 مل ، | 430053 | ||
| معقمة يمكن التخلص منها ؛ | فيشر 1371120 | العلمي | |
| 0.22 & ميكرو; م مرشح زجاجة علوي قابل للتصرف معقم مسبقا ؛ | EMD Millipore | SCGPS05RE | |
| خلاط الفولاذ المقاوم للصدأ | Waring نموذج تجاري | 51BL31 | |
| كوب خلاط ، سعة 100 مل | Waring مجهر مركب مقلوب تجاري | ||
| نيكون Instruments ؛ | كسوف TE300 |
المراجع
- Colley, D. G., Bustinduy, A. L., Secor, W. E., King, C. H. Human schistosomiasis. Lancet. 383, 2253-2264 (2014).
- WHO. Schistosomiasis: number of people treated worldwide in 2013. Wkly. Epidemiol. Rec. 5 (90), 25-32 (2015).
- Yoshino, T. P., Gourbal, B., Théron, A. Schistosoma sporocysts. Schistosoma: biology, pathology and control. Jamieson, B. G. M. , CRC Press. Boca Raton. 118-148 (2017).
- Bayne, C. J. Successful parasitism of vector snail Biomphalaria glabrata by the human blood fluke (trematode) Schistosoma mansoni: a 2009 assessment. Mol. Biochem. Parasitol. 165 (1), 8-18 (2009).
- Yoshino, T. P., Coustau, C. Immunobiology of Biomphalaria-trematode interactions. Biomphalaria snails and larval trematodes. Toledo, R., Fried, B. , Springer. New York. 159-189 (2011).
- Coustau, C., et al. Advances in gastropod immunity from the study of the interaction between the snail Biomphalaria glabrata and its parasites: A review of research progress over the last decade. Fish Shellfish Immunol. 46 (1), 5-16 (2015).
- Bayne, C. J., Hahn, U. K., Bender, R. C. Mechanisms of molluscan host resistance and of parasite strategies for survival. Parasitology. 123, S159-S167 (2001).
- McMullen, D. B., Beaver, P. C. Studies on schistosome dermatitis. IX. The life cycles of three dermatitis-producing schistosomes from birds and a discussion of the subfamily Bilharziellinae (Trematoda: Schistosomatidae). Amer. J. Hyg. 42, 128-154 (1945).
- Voge, M., Seidel, J. S. Transformation in vitro of miracidia of Schistosoma mansoni and S. japonicum into young sprocysts. J. Parasitol. 58 (4), 699-704 (1972).
- Eloi-Santos, S., Olsen, N. J., Correa-Oliveira, R., Colley, D. G. Schistosoma mansoni: mortality, pathophysiology, and susceptibility differences in male and female mice. Exp. Parasitol. 75 (2), 168-175 (1992).
- Tucker, M. S., Karunaratne, L. B., Lewis, F. A., Freitas, T. C., Liang, Y. S. Schistosomiasis. Curr Proto Immunol. 103, 19.1:19.1.1-19.1.58 (2013).
- Basch, P. F., DiConza, J. J. The miracidium-sporocyst transition in Schistosoma mansoni: surface changes in vitro with ultrastructural correlation. J. Parasitol. 60 (6), 935-941 (1974).
- Hansen, E. L. Secondary daughter sporocysts of Schistosoma mansoni: their occurrence and cultivation. Ann. N. Y. Acad. Sci. 266, 426-436 (1975).
- Stibbs, H. H., Owczarzak, O., Bayne, C. J., DeWan, P. Schistosome sporocyst-killing amoebae Isolated from Biomphalaria glabrata. J. Invertebr. Pathol. 33, 159-170 (1979).
- DiConza, J. J., Basch, P. F. Axenic cultivation of Schistosoma mansoni daughter sporocysts. J. Parasitol. 60 (5), 757-763 (1974).
- Hansen, E. L. A cell line from embryos of Biomphalaria glabrata (Pulmonata): Establishment and characteristics. Invertebrate tissue culture: Research applications. Maramorosch, K. , Academic Press. New York. 75-97 (1976).
- Yoshino, T. P., Laursen, J. R. Production of Schistosoma mansoni daughter sporocysts from mother sporocysts maintained in synxenic culture with Biomphalaria glabrata embryonic (Bge) cells. J. Parasitol. 81 (5), 714-722 (1995).
- Ivanchenko, M. G., et al. Continuous in vitro propagation and differentiation of cultures of the intramolluscan stages of the human parasite Schistosoma mansoni. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 4965-4970 (1999).
- Yoshino, T. P., Bayne, C. J., Bickham, U. Molluscan cells in culture: primary cell cultures and cell lines. Can. J. Zool. 91, 391-404 (2013).
- Coustau, C., Yoshino, T. P. Flukes without snails: Advances in the in vitro cultivation of intramolluscan stages of trematodes. Exp. Parasitol. 94, 62-66 (2000).
- Milligan, J. N., Jolly, E. R. Cercarial transformation and in vitro cultivation of Schistosoma mansoni schistosomules. J. Vis. Exp. (54), e3191(2011).
- Basch, P. F. Cultivation of Schistosoma mansoniin vitro. II production of infertile eggs by worm pairs cultured from cercariae. J. Parasitol. 67 (2), 186-190 (1981).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
