هنا يصف لنا أساليب لتقييم الاستجابة الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحادة. في التحليل القائم على الفحص المجهري، ندرس تعريب هذه الأجهزة بعد التحفيز مختصرة مع تدفق القص المسمى فلوريسسينتلي. ونحن أيضا اختبار تنشيط البروتينات المختلفة لمصلحة في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة المتحلل.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
به، أو هجرة يصل تدرج تشيمواتراكتانت، هو أفضل طريقة مفهومة من موجه الهجرة. كشفت دراسات استخدام أميبا الاجتماعية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم أن شبكة توصيل إشارة معقدة من مسارات متوازية يسهب الرد على تشيمواتراكتانتس، ويؤدي إلى بلمرة الأكتين متحيزة ونتوء من بسيودوبود في اتجاه التدرج. وفي المقابل، الآليات الجزيئية القيادة أنواع أخرى من الهجرة الموجهة، على سبيل المثال، بسبب التعرض للقص تدفق أو المجالات الكهربائية، غير معروفة. العديد من المنظمين إنزيمية يحمل التعريب الرائدة أو متخلفة عن حافة خلية المهاجرة، فضلا عن إظهار التغييرات عابر في الترجمة أو التنشيط بعد التحفيز العالمي مع تشيمواتراكتانت. لفهم الآليات الجزيئية لأنواع أخرى من الهجرة الموجهة قمنا بتطوير أسلوب يسمح فحص الاستجابة الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحادة استناداً إلى موجز (2-5 ق) التعرض لإمالة تدفق. يمكن تسليم هذا التحفيز في قناة أثناء التصوير الخلايا معربا عن أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المسمى فلوريسسينتلي لدراسة سلوك الخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن حفز السكان خلية في لوحة، وتفكيك، وإيمونوبلوتيد باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف بالإصدارات النشطة من البروتينات ذات الاهتمام. من خلال الجمع بين كلا فحوصات، واحدة دراسة مجموعة واسعة من الجزيئات تفعيلها من خلال التغييرات في الترجمة سوبسيلولار و/أو الفسفرة. باستخدام هذا الأسلوب عقدنا العزم أن التحفيز الميكانيكي الحاد يؤدي تنشيط إشارة chemotactic أكتين وتوصيل الشبكات cytoskeleton. القدرة على دراسة الاستجابات الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحاد مهم لفهم أحداث المبادرة اللازمة للقص الناجمة عن تدفق الحركة. كما يوفر هذا النهج أداة لدراسة شبكة توصيل الإشارات chemotactic دون التباس تأثير مستقبلات chemoattractant.
المقدمة
هجرة خلايا حقيقية النواة متحيزة بمختلف الإشارات الكيميائية والفيزيائية في البيئة، بما في ذلك تدرجات تشيمواتراكتانتس قابلة للذوبان أو الركيزة زمنياً، وصلابة متغيرة من ركائز، المجالات الكهربائية، أو تدفق القص. على الرغم من أن هناك العديد من أوجه التقدم في فهمنا للآليات الجزيئية التي يقود به، يعرف عن الأنواع الأخرى من الهجرة الموجهة وكيف تتكامل هذه الإشارات المتنوعة على المستوى الخلوي لإنتاج موحد المهاجرة استجابة.
موجه الهجرة صوب بتركيز متزايد chemoattractant ينطوي على ثلاثة مكونات السلوكية: حركية والاستشعار اتجاهي والأقطاب1. حركية يشير إلى الحركة العشوائية للخلايا التي حققها نتوء بسيودوبود. الاتجاه الاستشعار هو قدرة ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-"إعداد الحلول"
- HL-5 إعداد الوسائط باستخدام ما يلي: سكر العنب 10 غرام/لتر، ببتون برتوس 10 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 0.965 غ/لتر Na 2 هبو 4 ·7H 2 س، خ 0.485 غرام/لتر 2 ص. ب 4، وكذلك، ما لم يبين خلاف ذلك، ستربتوميسين 0.03 غرام/لتر في المياه. اﻷوتوكﻻف المتوسطة وتخزين في درجة حرارة الغرفة-
ملاحظة: بسبب الاختلافات بين استخراج ببتون والخميرة بروتيوسي المكتسبة من موردين مختلفين، وكذلك بين المجموعات الفردية، الأس الهيدروجيني لوسائل الإعلام قد تحتاج إلى تعديل لمجموعة نموذجية من 6.4 إلى 6.7. - SM إعداد لوحات باستخدام ما يلي: 10 غرام/لتر سكر العنب، ببتون 10 غرام/لتر، 1 غرام/لتر الخميرة ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
استجابة الزمانية للمنظمين إنزيمية للتحفيز الميكانيكي الحادة
لتقييم استجابة الخلايا ديسكويديوم د للتحفيز الميكانيكي، تتعرض خلايا تجميع المختصة ملتصقة لنبضه قصيرة من تدفق القص. تجميع المختصة د ديسكويديوم الخلايا تفرز المخيم، التي يمكن أن تكون لمست بالخلايا المجاورة. للتغلب على مساهمة مما يشير إلى خلية خلية، تعامل الخلايا مع الكافيين، الذي يحول دون adenylyl cyclase في ديسكويديوم دال ، وهكذا يمنع إفراز المخيم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الأساليب الموصوفة هنا توفر طريقة مناسبة لتقدير كل من السكان وسلوك خلايا فردية في الاستجابة تدفق للقص. الأهم من ذلك، بينما تحليل الدراسات السابقة التعريب الرائدة ومتخلفة عن علامات الحافة أثناء الترحيل، يسمح النهج الحالي التحقيق في الآثار المباشرة بتطبيق تدفق القص حادة. باستخدام هذا الأسلوب أثبتنا أنه، في الواقع، الاستجابة الأولية للخلايا لإمالة تدفق لا تتطلب الهجرة الخلية. بدلاً من ذلك، يسبق الاستجابة السريعة وعابر لتحفيز تدفق القص الأولية هجرة اتجاهي ينظر مع التعرض المطول القص التدفق، وبالمثل للاستجابة العالمية الأولى ين.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35 GM118177 للحزب الوطني الديمقراطي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| سكر العنب | فيشر | D16-1 | استخدم لتحضير وسائط HL-5 وألواح SM (الخطوات 1.1 ، 1.2) |
| ببتون البروتيوز | فيشر | DF0120-17-6 | استخدم لتحضير وسائط HL-5 (الخطوة 1.1) |
| مستخلص الخميرة | فيشر | 50-550-445 | استخدم لتحضير وسائط HL-5 وألواح SM (الخطوات 1.1 ، 1.2) |
| Na2HPO4· 7H2< / sub>O | Fisher | S373-500 | استخدم لإعداد وسائط HL-5 ، و 10X Phosphate Buffer (الخطوات 1.1 ، 1.3) |
| KH2< / sub>PO4< / sub> | Fisher | P386-500 | استخدم لإعداد وسائط HL-5 وألواح SM و 10X Phosphate Buffer (الخطوات 1.1-1.3) |
| الستربتومايسين (كبريتات ثنائي هيدروستربتومايسين) | فيشر ICN10040525 | استخدم لتحضير وسائط HL-5 (الخطوة 1.1) | |
| الببتون (باكتو) | فيشر | DF0118-17-0 | استخدم لتحضير لوحات SM (الخطوة 1.2) |
| K2< / sub>HPO4< / sub> | Fisher | P288-100 | استخدم لتحضير لوحات SM (الخطوة 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | استخدم لتحضير لوحات SM (الخطوة 1.2) |
| MgSO4< / sub> | Fisher | M65-500 | استخدم لتحضير DB Buffer (الخطوة 1.4) |
| CaCl2< / sub> Fisher | C79-500 | استخدم لتحضير DB Buffer (الخطوة 1.4) | |
| الكافيين | فيشر | O1728-500 | استخدم لتحضير الكافيين (الخطوة 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 أقدام ، 5 أقدام أحادي الفوسفات الدوري ، ملح الصوديوم) | فيشر | 11-680-1100 مجم | استخدم لتحضير cAMP (الخطوة 1.6) |
| حمض الفوليك | Sigma | F7876 | استخدم لتحضير الفوليك حمض (الخطوة 1.7) |
| قاعدة تريس | فيشر | BP152-500 | استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8) |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) | فيشر | BP166-500 | استخدم لتحضير مخزن مؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8) |
| الجلسرين | فيشر | G33-500 | استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8) |
| بروموفينول الأزرق | Bio-Rad | 1610404 | استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة 3X (الخطوة 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة باستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8) |
| Na3< / sub>VO4< / sub> | Fisher | 50-994-911 | استخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة باستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8) |
| بيروفوسفات الصوديوم ديكاهيدرات | فيشر | S390-500 | يستخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8) |
| كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA (Roche) | 11873580001 Sigma | يستخدم لتحضير المخزن المؤقت للعينة باستخدام مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الخطوة 1.8) | |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | استخدم لتحضير Latrunculin A (الخطوة 1.9) |
| 4-15٪ Tris-HCl بولي أكريلاميد هلام | Bio-Rad | 3450029 | استخدام للنشاف المناعي (الخطوة 3.3) |
| غشاء فلوريد البولي فينيلدين | Bio-Rad | 1620177 | يستخدم في النشاف المناعي (الخطوة 3.3) |
| Phospho-PKC (مقلاة) (zeta Thr410) (190D10) إشارات خلايا الأجسام المضادة للأرانب | 2060 | الجسم المضاد الأساسي للاستخدام في النشاف المناعي (الخطوة 3.3) | |
| Phospho-p44 / 42 MAPK (Erk1 / 2) (Thr202 / Tyr204) ( D13.14.4E) إشارات خلية الأجسام المضادة XP | 4370 | الجسم المضاد الأساسي للاستخدام في النشاف المناعي (الخطوة 3.3) | |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (من الحمار) GE | Healthcare | NA934-100UL | الجسم المضاد الثانوي للاستخدام في النشاف المناعي (الخطوة 3.3) |
| ركيزة التلألؤ الكيميائي المحسنة (ركيزة Clarity Western ECL) | Bio-Rad | 1705060 | الاستخدام للنشاف المناعي (الخطوة 3.3) |
| المخزن المؤقت للتجريد (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | استخدم للنشاف المناعي (الخطوة 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | يستخدم للنشاف المناعي (الخطوة 3.3) |
| K. سلالة الجينات الهوائية (غير مسببة للأمراض) | مركز Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name< / strong> | Company< / strong> | <قوي>رقم الكتالوج | تعليقات |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (نموذج G-33 ، أو بديل مماثل) | نيو برونزويك العلمي | لنمو K. aerogenes< / em> (الخطوة 2.1.1) ، وللقاعدية وتحفيز خلايا D. discoideum< / em> (الخطوة 3). نصف قطر الدوران لهذا شاكر 9.5 ملم. | |
| طبق بتري 10 سم | فيشر | FB0875712 | استخدم لتحضير ألواح SM (الخطوة 1.2) |
| مقياس الدم | Fisher | 02-671-51B | استخدم لحساب خلايا D. discoideum< / em> (الخطوة 2.1.2) طبق |
| 35 مم (طبق ثقافة الأنسجة من Corning Falcon Easy-Grip) | Fisher | 08-772A | استخدم لطبق D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي متبوعا بتحلل الخلية (الخطوة 3.1.1) |
| كوب البوليسترين (5 مل) | VWR | 13915-985 | يستخدم لتحفيز تعليق الخلية D. discoideum< / em> مع جاذب كيميائي (الخطوة 3.2.2) |
| وحدة السوائل مع مضخة (نظام مضخة ibidi) | Ibidi | 10902 | يستخدم لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5) |
| انزلاق بقناة (& mu ؛ -Slide III 3in1 ibiTreat: # 1.5 غطاء بوليمر ، معالجة ثقافة الأنسجة ، معقمة) | المرجع | 80316 | استخدم للوحة D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي الذي يتم تسليمه بواسطة جهاز سائل (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5) |
| خزانات 50 مل (حامل خزان أبيدي لوحدة الموائع) | نفس المرجع | نفسه 10978 | استخدم لإعداد الجهاز السائل لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5) |
| خطوط الوحدة السائلة (مجموعة التروية YELLOW-and-GREEN)المرجع | 10964 | استخدم لإعداد الجهاز السائل لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 ، 4.2 و 5). ملاحظة: يمكن أيضا قطع الخطين من الأنبوب 1.6 مم (رقم الكتالوج 10842). | |
| خط للتصريف (أنبوب معرف 1.6 مم) | Ibidi | 10842 | استخدم لإعداد الجهاز السائل لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> في قناة (الخطوات 4.1 و 4.2 و 5). |
| مجهر مقلوب Zeiss Observer.Z1 مزود بهدف زيت 40X / 1.3 وهدف جوي 20X / 0.3 (أو بديل مماثل) | Zeiss | يستخدم لتصوير خلايا D. discoideum< / em> مع تباين الطور أو إضاءة مضان (الخطوتين 4 و 5) | |
| مجهر ثنائي البؤر القرص الدوار UltraView المجهز ب 40 مرة;/1.25– 0.75 هدف الزيت (أو بديل مماثل) | Perkin-Elmer | DM 16000 | بديل يستخدم لتصوير خلايا D. discoideum< / em> (الخطوة 4.1.4) حاقن |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf ؛ موديل 5247 ، أو بديل مماثل) مع Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D و 5192000027 | يستخدم لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> بواسطة ماصة دقيقة (الخطوة 4.3). ملاحظة: رقم الكتالوج مخصص لأحدث إصدار من الجهاز (4i). |
| ماصة دقيقة (Femtotip ؛ 1 & mu ؛ م القطر الخارجي ، 0.5 مو ؛ م القطر الداخلي) | Eppendorf | 930000035 | يستخدم لتوصيل التحفيز الميكانيكي لخلايا D. discoideum< / em> بواسطة ماصة دقيقة (الخطوة 4.3) |
| أطراف اللودر الدقيق (نصائح اللودر الدقيق Eppendorf Femtotips لحاقن Femtojet) | Eppendorf | 5242956.003 | استخدم لملء الماصة الدقيقة (femtotip) بمخزن مؤقت (الخطوة 4.3.1) غرفة |
| 1 بئر (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | فيشر | 12-565-472 | استخدم لألواح D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي الذي يتم توصيله بواسطة ماصة دقيقة (الخطوة 4.3.2) |
| غرفة ذات 8 آبار (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | فيشر | 12-565-338 | استخدم للوحة D. discoideum< / em> للتحفيز الميكانيكي الذي يتم تسليمه عن طريق إضافة المخزن المؤقت السائب (الخطوة 4.4.1) |
| <قوي>الاسم< / قوي> | <قوي>الشركة | رقم الكتالوج | تعليقات |
| Software | |||
| Image Analysis Software (فيجي) | المعاهد الوطنية للصحة | https://fiji.sc/ | استخدم لتحديد الاستجابة للتحفيز الميكانيكي (الخطوة 4.5) |
| برنامج تحليل الهجرة (أداة التتبع PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | يستخدم لتحديد سرعة الخلية وثباتها (الخطوة 5.4) |
المراجع
- Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
- Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
