يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Megakaryocyte التمايز وتكوين الصفائح الدموية من الإنسان الحبل CD34 المستمدة من الدم الخلايا+

19.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56420

⸱

ديسمبر 27, 2017

 ,  ,  , 
1Haematology Research Unit, St George and Sutherland Clinical School, University of New South Wales, 2Haematology Department, St George and Sutherland Hospitals

في هذه المقالة

ملخص

يمكن الحصول على جمهرة نقية جداً من ميجاكاريوسيتيس من الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا. أسلوب ل CD34+ التمايز العزلة و megakaryocyte خلية يرد هنا.

الملخص

إنتاج الصفائح الدموية يحدث أساسا في نخاع العظام في عملية تعرف باسم ثرومبوبويسيس. أثناء ثرومبوبويسيس، التفريق بين الخلايا المكونة للدم السلف للسلائف الصفيحات نموذج يسمى ميجاكاريوسيتيس، التي تميز الميؤوس من شفائهم للإفراج عن الصفائح الدموية من عمليات طويلة هيولى يسمى بروبلاتيليتس. ميجاكاريوسيتيس هي خلايا نادرة تنحصر في نخاع العظام ولذلك يصعب على الحصاد بإعداد كافية للاستخدامات المختبرية. كفاءة إنتاج megakaryocytes البشرية يمكن أن يتحقق في المختبر باستزراع CD34+ الخلايا تحت ظروف مناسبة. وصف البروتوكول بالتفصيل هنا عزل CD34+ الخلايا بالخلية المغناطيسية الفرز من عينات دم الحبل السري. يتم وصف الخطوات اللازمة لإنتاج megakaryocytes عالية نقية وناضجة تحت ظروف خالية من المصل. كما يتم توفير التفاصيل المظهرية تحليل التمايز ميجاكاريوسيتي والتصميم لإنتاج بروبلاتيليت في تشكيل والصفائح الدموية. يمكن إضافة المستجيبة التي تؤثر على التمايز ميجاكاريوسيتي و/أو تشكيل بروبلاتيليت، مثل mimetics ثرومبوبويتين، أو الأجسام المضادة الصفيحات للخلايا المزروعة لدراسة الوظيفة البيولوجية.

المقدمة

عزل عدد كاف من ميجاكاريوسيتيس البشرية الأولية (MK) للاستخدامات المختبرية العادية ليس ممكناً بسبب ما تردد منخفض في نخاع العظام، حيث أنها تمثل ~0.01% للخلايا المنواه1. وهو بديلاً ملائماً السابقين فيفو التوسع والتمايز الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف حضور عوامل نمو محددة. كان عدد من السيتوكينات بما في ذلك معامل الخلايا الجذعية (صندوق إنقاذ الطفولة؛ ج-طقم يجند) وانترلوكين (إيل)-3 وايل-11 المستخدمة في نظم الاستزراع لإنتاج أعضاء الكنيست-ثرومبوبويتين (TPO) هو عامل نمو وتمايز الأكثر فعالية للثقافات ميجاكاريوسيتيك وهو فعال وحدها أو مع السيتوكينات الأخرى، مثل صندوق إنقاذ الطفولة وايل-32. يمكن أن يعمل TPO على السكان الخلايا الجذعية تسفر عن انتشار ونضوج أعضاء الكنيست2.

عضو الكنيست إنتاج الصفائح الدموية من هيولى نتوءات تسمى بروبلاتيليتس، و الحية، حوالي 1 × 1011 الصفائح تشكيل يوميا للحفاظ على حساب الصفائح الدموية من 150-400 × 109الصفيحات/L. الإنتاج في المختبر هو يصل إلى 1000 -إضعاف أقل من التقديرات في فيفو 3، وهذا قد أدى إلى العديد من شروط ثقافة استخدام CD34+ الخلايا المكونة للدم السلف لتحسين عضو الكنيست والصفائح الدموية الإنتاج في المختبر. المصدر الأولى ل CD34+ الخلايا المستخدمة للتمييز بين عضو الكنيست كان الدم المحيطي البشري4. تشمل المصادر الأخرى خلية نخاع العظم5،6، والخلايا الجذعية الجنينية/التي يسببها pluripotent الخلايا الجذعية (ESC/اللجنة التوجيهية)7، والحبل السري الدم (UCB)8،9،10 . نخاع العظام البشرية CD34+ 11 والماوس النسب نخاع العظم سلبية الخلايا5 إنتاج عضو الكنيست والصفائح الدموية في المختبر؛ ومع ذلك، عدم توافر نخاع العظام البشرية يحد من استخدامه كمصدر ل CD34+ الخلايا. وفي المقابل، ESC واللجنة التوجيهية تمثل مصدرا غير محدود من الخلايا في المختبر إنتاج الصفائح الدموية. ويتطلب إنتاج الصفائح الدموية من هذه الخلايا الخلايا المغذية مثل مورين OP9 الخلايا وفترات أطول من الثقافة. الصفائح الدموية المستمدة في ظروف خالية من علبة التغذية بالورق، على ما يبدو، وظيفية أقل من12. الصفائح الدموية المستمدة من اللجنة التوجيهية من المحتمل أن يكون للاستخدام في ظروف سريرية حيث أنها يمكن توسيعها لنطاق واسع. وهذه العملية تتطلب توصيل لينتيفيرال بوساطة عوامل النسخ و ثقافة خلية طويل الأجل13.

UCB مصدر موجوداً من CD34+ الخلايا التي يمكن استخدامها في سهولة البحث إعدادات. TPO وحدها يمكن أن يعزز تمايز الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا وهذا يؤدي إلى أعضاء الكنيست نقية جداً وناضجة دون الحاجة إلى مكملات مصل أو الثقافة المشتركة مع الخلايا المغذية. السيتوكينات الأخرى مثل صندوق إنقاذ الطفولة قد إنقاص التمايز من UCB CD34+ الخلايا، بينما يجند أنطوني-3 وايل-11 تشجيع الإنتاج غير ناضجة ميجاكاريوسيتيس14. ويصف هذا البروتوكول إنتاج عالية نقية الثقافات عضو الكنيست من دم الحبل السري CD34+ الخلايا في ظروف خالية من المصل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

هذا البروتوكول أقره "جنوب شرق سيدني البشرية البحوث لجنة الأخلاقيات" وصدقت عليها "لجنة أخلاقيات البحوث البشرية" بجامعة نيو ساوث ويلز. وقدم دم الحبل السري التي تم الحصول عليها من الجهات المانحة صحية "سيدني حبل بنك الدم" (سيدني، نيو ساوث ويلز، أستراليا). واستخدمت وحدات تخزين ما يقرب من 100 مل لهذا الإجراء.

ملاحظة: يعمل في السلامة الأحيائية "الفئة الثانية" مجلس الوزراء باستخدام تقنية معقمة. تطهير الجزء خارجي كيس دم الحبل السري مع الإيثانول 70%. استخدام أدوات معقمة (مقص وملاقط) لهذا الإجراء.

1-سلك إعداد خلايا الدم وعزل CD34 الخلايا+

  1. إعداد فصل معقم المخزن المؤقت (SB) مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وفي الرقم الهيدروجيني 7.2، وتحتوي على 0.5% البقري الزلال ومم 2 يدتا.
  2. الاستغناء عن 10 مل من بينالي الشارقة في أنبوب 50 مل مخروطية (أنبوب واحد كل 10 مل دم مطلوب). باستخدام إبرة كليلة G18 التي شنت على حقنه 10 مل، رسم 10 مل دم من الكيس والاستغناء عن في أنابيب 50 مل تحتوي على 10 مل من س. ب.
  3. إضافة 15 مل من اللمفاويات فصل وسائط الإعلام (انظر الجدول للمواد) إلى الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على الدم المخفف، خلق طبقتين.
    ملاحظة: الاستغناء عن وسائل الإعلام ببطء في الجزء السفلي من الأنبوب لتفادي الخلط بين الطبقات المختلفة.
  4. الطرد المركزي أنابيب في ز × 1,200 لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) مع لا فاصل ولا التسارع.
  5. نقل الطبقة قرب مركز الأنبوبة التي تحتوي على الخلايا وحيدات النوى (حوالي 5-10 مل من كل أنبوبة) في أنبوب 50 مل جديدة باستخدام ماصة باستور. إضافة بينالي الشارقة لكل أنبوبة لإجمالي حجم 50 مل.
  6. الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 10 دقائق في تجاهل الرايت المادة طافية.
  7. ريسوسبيند الكريات الخلية بعناية مع ماصة باستور في 5-10 مل من الجمع بين SB. الخلايا مع وقف التنفيذ وإعادة التخزين إلى 50 مل مع س. ب.
  8. حساب عدد الخلايا باستخدام التلوين تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير أو الآلي الخلية مضادة (انظر الجدول للمواد). لتحديد النسبة المئوية ل CD34+ الخلايا في العينة، ريسوسبيند 2.5 × 105 خلايا في 100 ميليلتر من بينالي الشارقة ووصمة عار بإضافة 10 ميليلتر من الأجسام المضادة-CD34-PE لمدة 15-30 دقيقة في 4 درجات مئوية. تحليل من خلال التدفق الخلوي (الشكل 1A).
  9. أنابيب الطرد المركزي في ز × 400 لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: إذا لم يكن المطلوبة فورا، يمكن تجميد الخلايا وحيدات النوى في هذه المرحلة.
  10. ريسوسبيند الخلايا في 300 ميليلتر من SB الواحد 108 خلايا. إضافة 100 ميليلتر من مفتش البشرية FcR (حجب الكاشف، انظر الجدول للمواد) و 100 ميليلتر من CD34 المغناطيسي الخرز الواحدة 108 خلايا. المزيج بلطف واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30-40 دقيقة.
    ملاحظة: مطلوب تعليق خلية مفردة (إذا لزم الأمر، تمر الخلايا على الرغم من عامل تصفية 30 ميكرومتر قبل إضافة الكواشف). استخدام وحدات التخزين كاشف الموصوفة هنا ل 108 خلايا أو أقل. لأكثر من 108 خلايا، رفع مستوى الكواشف (SB، عرقلة الحل، والخرز المغناطيسي CD34) تبعاً لذلك.
  11. إعداد العمود فصل ليرة سورية خلال فترة الحضانة بوضع العمود LS في حامل مغناطيسية والغسيل مع 3 مل من تجاهل SB. النفايات السائلة.
    ملاحظة: يمكن تحميل LS فصل الأعمدة يصل إلى 2 × 108 مجموع الخلايا. تتوفر الأعمدة الأصغر والأكبر.
  12. أضف 5-10 مل من بينالي الشارقة إلى خليط الخلية وأجهزة الطرد المركزي في 400 × ز للحد الأدنى 10 تجاهل المادة طافية.
  13. ريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل من بينالي الشارقة وتحميل تعليق خلية (1.5 مل) على العمود ليرة سورية. جمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا غير المسماة في أنبوب جمع 15 مل (كسر السلبية #1). واسمحوا السائل واستنزاف أغسل العمود مع 1.5 مل من س. ب.
  14. تحميل التدفق التي تم جمعها من خلال (3 مل) مرة أخرى إلى العمود وجمع من خلال التدفق في أنبوب جمع 15 مل نفس (كسر السلبية #1). أغسل العمود LS 3 مرات مع 3 مل من س. ب.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر، يمكن الملون الخلايا في كسر السلبية (12 مل) مع جسم CD34 المضادة للتأكد من القبض على CD34+ الخلايا حسب العمود ليرة سورية.
  15. إزالة عمود من الفاصل المغناطيسي وتدفق الخلايا ببطء مع المكبس حقنه في أنبوب 15 مل جديدة مع 2 مل من س. ب.
  16. مكان العمود مرة أخرى على فاصل مغناطيسي وتحميل 2 مل الخلايا مرة أخرى في العمود. التدفق من خلال جمع وتغسل مع 2 مل س. ب. هذا هو الكسر السلبية #2 (4 مل).
  17. إزالة العمود LS من فاصل مغناطيسي وإضافة 2 مل خلايا SB. دافق ثبات وحزم مع المكبس حقنه لجمع CD34+ الكسر في الخلية. عد الخلايا باستخدام التلوين تريبان الأزرق وهيموسيتوميتير أو العداد الآلي الخلية.
  18. أنبوب الطرد المركزي مع الكسر الإيجابية في ز × 400 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الخلايا في وسائل الإعلام الحرة المصل ل CD34+ الخلايا (الإدارة المستدامة للغابات، انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: إذا لم يكن المطلوبة فورا، الخلايا يمكن أن تجمد في النتروجين السائل في هذه المرحلة.

2. الاختيار النقاء من CD34 عزل الخلايا+

  1. وصمة عار 2 × 104 خلايا من الكسر إيجابية مع 10 ميليلتر المضادة-CD34-PE جسم وجسم المضادة-CD45-بيركب 20 ميليلتر لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية (استخدام أنبوب منفصل لضوابط ايستب) (الشكل 1B).
  2. أضف 1 مل من بينالي الشارقة لغسل. الطرد المركزي في 400 غ × للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من س. ب.
  3. أداء تحليل تدفق سيتوميتريك وبوابة السكان خلية حية لاستبعاد الحطام (الشكل 1B). البوابة للسكان إيجابية PE وبيركب استخدام PE وبيركب ايستب عناصر التحكم (الشكل 1B) وتحديد النسبة المئوية ل CD34+/CD45+ الخلايا.

3-megakaryocyte التمايز

  1. البذور 5 × 105 خلايا/مل CD34+ الخلايا في 2 مل من الإدارة المستدامة للغابات وتستكمل مع 50 نانوغرام/مل الماشوب البشري ثرومبوبويتين (رهتبو) كل بئر في لوحة 12-جيدا. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية، 5% CO2 في جو هوميديفيد. إذا كانت الخلايا المتلاقية قبل أن تكون مطلوبة من أجل التحليل، حصاد الخلايا وتقسيمها إلى الآبار متعددة مع وسائط جديدة ورهتبو.
    ملاحظة: ينبغي إعداد الآبار اثنين أو ثلاثة على وجه التحديد لرصد التمايز في نقاط زمنية مختلفة (مثلاً، أيام 7 و 9 و 10).
  2. حصاد الخلايا من الآبار التي خصصت لرصد التمايز دون الإخلال بالخلايا الموجودة في الآبار الأخرى.
  3. الخلايا وصمة عار مع الأجسام المضادة-GPIIb/CD41-فيتك 20 ميليلتر ومكافحة--جبيكس/CD42a-أليكسا ميليلتر 10 فلور 647 جسم في حجم نهائي 100 ميليلتر. أنبوب إعداد عنصر تحكم باستخدام الأجسام المضادة التي تحكم ايستب كل منهما. احتضان لمدة 15-30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. أضف 1 مل من بينالي الشارقة لغسل.
الطرد المركزي في 400 غ × لأدنى 10 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200-300 ميليلتر لتحليل SB. بالتدفق الخلوي.
  • لكل فلوروفوري، تحليل عناصر التحكم لتعيين النابضة للسكان إيجابية فيتك و 647 الطحين أليكسا ايستب. تحليل عينات الخلايا الملون لتحديد النسبة المئوية من CD41+/CD42a+ مضاعفة الخلايا الإيجابية، التي تمثل MK الناضجة (الشكل 1).
  • لرؤية مجهرية الخلية وصمة علامات سطح الخلايا كما هو موضح في 3.3.
    1. أضف 1 مل من بينالي الشارقة لغسل. أجهزة الطرد المركزي في 400 غ × للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في 100 ميليلتر من بينالي الشارقة وتدور على شريحة زجاجية في 1,000 ز x للحد الأدنى 5 إصلاح الخلايا على الشريحة بالغمس في الميثانول 30 س. الهواء الجاف، لإضافة 20 ميليلتر من تصاعد الوسائط التي تحتوي على DAPI (انظر الجدول للمواد) ، تغطية مع ساترة، ووضع تصور لاستخدام مجهر فلوري (الشكل 2A).
  • للتصور المستضدات داخل الخلايا، ريسوسبيند الخلايا في برنامج تلفزيوني وإصلاحها مع بارافورمالدهيد (1% تركيز النهائي) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بيرميبيليزي الخلايا، إضافة تريتون-X 100 (0.1%) واحتضانها للخلايا يغسل 15 دقيقة مع 2 مل PBS/0.1% تريتون-X 100. ريسوسبيند في 100 ميليلتر من PBS/0.1% تريتون-X 100 وإضافة المضادة لأضداد CD62p فوف ومكافحة (تخفيف 1: 200) واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    1. يغسل مع 2 مل PBS/0.1% تريتون-X 100 والطرد المركزي في ز × 400 لمدة 10 دقائق، ريسوسبيند في 100 ميليلتر من نفس المخزن المؤقت وإضافة أليكسا مفتش 594 المضادة الماوس والارنب المضادة IgG-أليكسا 488 (1: 100). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ويغسل مع 2 مل PBS/0.1% تريتون-X 100، ريسوسبيند في 100 ميليلتر من نفس المخزن المؤقت، وإضافة 20 ميليلتر لمكافحة CD42b-آسيا والمحيط الهادئ. ثم تدور الخلايا على الشرائح الزجاجية كما هو موضح في الخطوة 3.6.1 وإعداد العينات للتصور مجهرية كما هو موضح في الخطوة 3.6.1.
  • لتحديد بلويدي، وحصاد الخلايا في الأيام 12 أو 13 من التفريق. أضف 1 مل من بينالي الشارقة لغسل. أجهزة الطرد المركزي في 400 × ز 10 دقيقة ووصمة عار مع 20 الأجسام المضادة-جبيب/CD41-فيتك ميليلتر في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر. إينكوباتي عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    1. أغسل مرة واحدة مع 1 مل من بينالي الشارقة وريسوسبيند بيليه في 300 ميليلتر من سترات ناقص التوتر المخزن المؤقت (1.25 مم سترات الصوديوم، كلوريد الصوديوم 2.5 مم، 3.5 مم سكر العنب) التي تحتوي على 20 ميكروغرام/مل propidium يوديد و 0.05% 100 تريتون العاشر. احتضان لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية محمية من الضوء.
    2. إضافة رناسي إلى تركيز نهائي 20 ميكروغرام/مل واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء. تحديد كثافة يوديد propidium بالتدفق الخلوي بتجميع الأحداث 30,000 إلى 50,000 السكان CD41-فيتك+ (الشكل 2).

    • 4-بروبلاتيليت العد وتعداد الصفائح الدموية وتنشيط الصفائح الدموية

    1. حصاد الخلايا (من الخطوة 3.1) في يوم 8 أو 9 من التمايز والبذور في 1 × 104 خلايا/بئر لوحات 48-جيدا في 200 ميليلتر للإدارة المستدامة للغابات جديدة تستكمل مع 50 نانوغرام/مل رهتبو. الثقافة لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية، 5% CO2-
      ملاحظة: لأغراض كوانتيتيشن، البذور الآبار في ثلاث نسخ. مطلوب هذه الكثافة المنخفضة للتصور والعد من بروبلاتيليت تحمل بروبلاتيليتس MK. وعادة ما تبدأ في الظهور بعد يومين ثقافة. الذروة ما بين 4 و 5 أيام.
    2. عد عضو الكنيست بروبلاتيليت الحاملة في البئر كله على مجهر ضوء مقلوب استخدام 10 X أو 20 X أهداف.
      ملاحظة: مرحلة مجهر ساخنة (37 درجة مئوية) الأفضل، نظراً لحفظ الخلايا في درجة حرارة الغرفة لفترات طويلة يسبب انكماش ملحقات بروبلاتيليت. ولوحظت بروبلاتيليتس كامتدادات طويلة من الجسم عضو الكنيست. قد يكون لكل عضو الكنيست عدة نتوءات بروبلاتيليت. كما وضع بروبلاتيليتس، يقلل الجسم من عضو الكنيست في الحجم.
    3. حصاد الخلايا والطرد المركزي في ز 400 x لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. وصمة عار الخلايا مع 20 جسم الإنسان لمكافحة CD41-فيتك ميليلتر، كما هو موضح في الخطوات 3.3 و 3.4. حساب النسبة المئوية لعضو الكنيست الحاملة بروبلاتيليت (ببمك): ببمك (%) = [(أعضاء الكنيست بروبلاتيليت الحاملة/حسنا)/(مجموع CD41+ الخلايا/حسنا)] x 100
    4. لعد الصفائح الدموية التي تطلق في المتوسط الثقافة، بلطف مزيج الخلايا مع ماصة باستور وجمع 100 ميليلتر في يوم 14 أو 15 من الثقافة.
      1. وصمة عار مع 20 ميليلتر المضادة الإنسان CD41-فيتك جسم لمدة 20-30 دقيقة في 4 درجات مئوية. إنشاء أنبوب مراقبة استخدام جسم التحكم ايستب كل منهما.
      2. إضافة 150 ميليلتر من بينالي الشارقة و 50 ميليلتر من عد الخرز.
      3. بالنسبة لتحليل تدفق سيتوميتريك، تعيين منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب لتسجيل النطاق. استخدام الصفائح الدموية البشرية العادية من البلازما الغنية بالصفائح الدموية ملطخة فيتك CD41 كما هو موضح في قسم 4.4.1 لتعيين النابضة للصفائح الدموية (الشكل 3A).
      4. تحليل الصفائح الدموية الملون مع عد الخرز بالتدفق الخلوي. جمع الأحداث 1,000 لعد الخرز استخدام منتدى التعاون الأمني مقابل SSC مبعثر مؤامرة (الشكل 3A). حساب عدد الصفائح الدموية استناداً إلى الأحداث الإيجابية CD41-فيتك (الشكل 3B) باستخدام الصيغة:
        الصفائح الدموية كل ميليلتر = [(عدد من الأحداث الإيجابية فيتك CD41)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/نموذج وحدة التخزين)]
    5. لتحليل تنشيط الصفائح الدموية، بلطف مزيج الخلايا مع ماصة باستور وجمع 100 ميليلتر في يوم 14 أو 15 من الثقافة. إضافة 1 مل تيرودي في المخزن المؤقت (137 مم كلوريد الصوديوم، 2.7 مم بوكل، مجكل 1 مم2، 1.8 مم كاكل2، 0.2 مم نا2هبو4, 12 ملم ناكو3، 5.5 ملم د-الجلوكوز، الرقم الهيدروجيني 6.5) وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 5 دقائق بيليه الخلايا.
      1. جمع المادة طافية وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 10 دقيقة بيليه الجسيمات الحجم الصفائح الدموية.
      2. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند في 100 ميليلتر تيرودي في المخزن المؤقت. إضافة 20 ميليلتر من جسم PAC1-فيتك و diphosphate الأدينوزين (ADP) بتركيز نهائي من 20 ميكرومتر. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة ل 20 دقيقة تحليل بالتدفق الخلوي لتحديد النسبة المئوية للأحداث الإيجابية فيتك. استخدام الصفائح الدموية البشرية الطازجة يعامل بنفس الطريقة كعنصر إيجابي (الشكل 3).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    يسمح هذا البروتوكول إعداد عالية نقية الثقافات عضو الكنيست من الحبل CD34 المستمدة من الدم+ الخلايا. النسبة المئوية ل CD34+ الخلايا في الحبل الدم هو حوالي 1.3%15 (الشكل 1A)، والعدد الكلي للخلايا وحيدات النوى (الخطوة 1.8) يتراوح بين 90-300 × 106 لكل وحدة UCB. نقاء CD34 + CD45 + الخلايا بعد عزلة يتراوح من 90 إلى 99 في المائة (الشكل 1B). عضو الكنيست (ويعرف CD41+ الخلا...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    البروتوكول الموصوفة هنا مناسبة لإنتاج متسقة لعضو الكنيست والصفائح الدموية في الثقافة من دم الحبل السري. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة مختلف العمليات مثل تأثير المخدرات أو الأنشطة البيولوجية على انتشار عضو الكنيست، والتمايز، وتشكيل بروبلاتيليت، وإنتاج الصفائح الدموية.

    قدمت مجموعة متنوعة من وسائط الثقافة وتركيبات سيتوكين في الأدب. إضافة السيتوكينات مثل عامل الخلايا الجذعية ويجند أنطوني-3، 3 إيل وايل-6 يدعم CD34+ خلية الانتشار. ومع ذلك، النتائج هذا التوسع في انخفاض MK النقاء في الثقا...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    شكر وتقدير

    الكتاب تقر بالدعم "الصحي الأسترالي" و "مجلس البحوث الطبية" (مشروع المنح 1012409 مرتبطة بالبيلاروسية).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    <قوية > كواشف ثقافة الخلايا < / قوية >
    مؤتلفة بشرية TPOMiltenyi Biotec130-094-013
    StemSpan SFEM IIStem Cell Technologies9605وسائط خالية من المصل لخلايا CD34
    + <قوي>الاسم < / قوي ><قوي>شركة < قوي ><قوي>رقم الكتالوج < / قوي>Comments
    CD34 Isolation Recodes
    CD34 MicroBead kit فائقة النقاءMiltenyi Biotec130-100-453تتضمن هذه المجموعة كاشف حجب IgG البشري FcR وميكروبيدات CD34. تحتوي هذه الخرزات على استنساخ الجسم المضاد المضاد ل CD34 QBEND / 10. استخدم استنساخا مختلفا مضادا ل CD34 للتحقق من النقاء (على سبيل المثال ، استنساخ 8G12).
    LymphoprepAlere Technologies1114545وسائط فصل الخلايا الليمفاوية (الكثافة 1.077 جم / مل)
    عازلة فصل معقمة (SB)Miltenyi Biotec130-091-221يحتوي هذا المخزن المؤقت على محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ودرجة الحموضة 7.2 تحتوي على 0.5٪ ألبومين مصل بقري و 2 ملي مولار EDTA. يمكن تحضيره باستخدام مكونات معقمة لزراعة الخلايا. قم بإزالة الغاز قبل الاستخدام لأن فقاعات الهواء يمكن أن تسد العمود.
    <قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
    Flow Cytometry وكواشف تلطيخ الخلايا
    PE ماوس مضاد للإنسان CD34BD Biosciences340669استنساخ 8G12. يمكن استخدام هذا لفحص نقاء CD34. تركيز الأجسام المضادة النهائي 1:10 التخفيف.
    فأر PerCP مضاد للإنسان CD45BD Biosciences3474641:10 تخفيف
    PerCP التحكم في النمط النظيريBD Biosciences3490441:10
    FITC Mouse المضاد للإنسان CD41aBD Biosciences340929تركيز الأجسام المضادة النهائي 1: 5 التخفيف.
    APC Mouse المضاد للإنسان CD42bBD Biosciences551061يمكن أيضا استخدام هذا الجسم المضاد للكشف عن MK الناضج (النسبة المئوية للخلايا الإيجابية عادة أقل من مضادات CD42a). تركيز الأجسام المضادة النهائي 1:10 التخفيف.
    Alexa Fluor 647 Mouse Anti-Human CD42aAbD SerotecMCA1227A647Tيتم توزيعه حاليا بواسطة Bio-Rad. تركيز الأجسام المضادة النهائي 1:10 التخفيف.
    Alexa Fluor 647 Mouse Negative ControlAbD SerotecMCA928A647يتم توزيعه حاليا بواسطة Bio-Rad. الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتشافي
    مكافحة فون ويلبراند عامل الأرنب متعدد النسيلةAbcamAB69941:200 التخفيف
    V450 الفأر المضاد للحمصة CD41aBD Biosciences584251: 20 التخفيف
    V450 التحكم في النمط النظيريBD Biosciences5803731:20 التخفيف
    PAC1-FITC الجسم المضادBD Biosciences3405071:10 التخفيف
    المضاد للفأر CD62p أحادي النسيلةAbcamAB66321:200 التخفيف
    Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للأرانب IgGInvitrogenA110081:100 التخفيف
    Alexa Fluor 594 الماعز المضاد للفأر IgGInvitrogenA110201:100 التخفيف
    Ig كوكتيل التحكم في النمط المتشابوي-CBD Biosciences558659الجسم المضاد للتحكم في النمط
    المتنظير بروبيديوم يوديدسيجما ألدريتشP4864
    CountBright الخرز العد المطلقالمجسات الجزيئية ، InvitrogenC36950عد
    الخرز Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments
    Materials
    LS الأعمدةMiltenyi Biotec130-042-401الأعمدة الأصغر والأكبر متوفرة تجاريا أيضا
    مغناطيس فاصل MidiMACSMiltenyi Biotec130-042-302
    MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
    Falcon 5mL أنابيب البولي بروبيلين FACS ذات القاع المستدير ، مع غطاء المفاجئ ، تقنيات معقمةفي المختبر352063
    شرائح زجاجيةوسائط تركيبJ3800AMNZ
    معDAPI Vector LaboratoriesH-1200وسيط تركيب مضاد للتلاشي مع DAPI
    strong>NameCompanyCatalog NumberComments
    Equipment
    المجهر المقلوبLeicaDMIRB المجهر
    المجهر الفلوريZeissVert.A1
    محلل الخلاياBD BiosciencesFACS Canto II
    Cytospin الطرد المركزيThermoScientificCytospin 4
    NameCompanyCatalog رقم< / strong>تعليقات< strong>
    Software
    برنامج محلل الخلاياBD BiosciencesFACS Diva برنامج
    تحليل الخلية الواحدةTree StarFlowJo
    برنامج المجهر الفلوريZeissZen 2 الإصدار
    تخفيف Menzel-Glaser<المقلوب الأزرق

    المراجع

    1. Nakeff, A., Maat, B. Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation. Blood. 43 (4), 591-595 (1974).
    2. Zeigler, F. C., et al. In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells. Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).
    3. Reems, J. -A., Pineault, N., Sun, S. In Vitro Megakaryocyte Production and Platelet Biogenesis: State of the Art. Transfus. Med. Rev. 24 (1), 33-43 (2010).
    4. Choi, E., Nichol, J. L., Hokom, M. M., Hornkohl, A. C., Hunt, P. Platelets generated in vitro from proplatelet-displaying human megakaryocytes are functional. Blood. 85 (2), 402-413 (1995).
    5. Perdomo, J., et al. A monopartite sequence is essential for p45 NF-E2 nuclear translocation, transcriptional activity and platelet production. J Thromb Haemost. 8 (11), 2542-2553 (2010).
    6. Shim, M. H., Hoover, A., Blake, N., Drachman, J. G., Reems, J. A. Gene expression profile of primary human CD34+CD38lo cells differentiating along the megakaryocyte lineage. Exp Hematol. 32 (7), 638-648 (2004).
    7. Feng, Q., et al. Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells. Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).
    8. Bruno, S., et al. In vitro and in vivo megakaryocyte differentiation of fresh and ex-vivo expanded cord blood cells: rapid and transient megakaryocyte reconstitution. Haematologica. 88 (4), 379-387 (2003).
    9. Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro. Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).
    10. Lev, P. R., et al. Impaired proplatelet formation in immune thrombocytopenia: a novel mechanism contributing to decreased platelet count. Br. J. Haematol. 165 (6), 854-864 (2014).
    11. Gandhi, M. J., Drachman, J. G., Reems, J. A., Thorning, D., Lannutti, B. J. A novel strategy for generating platelet-like fragments from megakaryocytic cell lines and human progenitor cells. Blood Cells Mol. Dis. 35 (1), 70-73 (2005).
    12. Lu, S. -J., et al. Platelets generated from human embryonic stem cells are functional in vitro and in the microcirculation of living mice. Cell Res. 21 (3), 530-545 (2011).
    13. Moreau, T., et al. Large-scale production of megakaryocytes from human pluripotent stem cells by chemically defined forward programming. Nature Commun. 7, 11208(2016).
    14. De Bruyn, C., Delforge, A., Martiat, P., Bron, D. Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor cells: cord blood versus mobilized peripheral blood. Stem Cells Dev. 14 (4), 415-424 (2005).
    15. Nimgaonkar, M. T., et al. A unique population of CD34+ cells in cord blood. Stem cells. 13 (2), Dayton, Ohio. 158-166 (1995).
    16. Italiano, J. E., Patel-Hett, S., Hartwig, J. H. Mechanics of proplatelet elaboration. J Thromb Haemost. 5, Suppl 1. 18-23 (2007).
    17. Matsunaga, T., et al. Ex vivo large-scale generation of human platelets from cord blood CD34+ cells. Stem cells. 24 (12), Dayton, Ohio. 2877-2887 (2006).
    18. Sullenbarger, B., Bahng, J. H., Gruner, R., Kotov, N., Lasky, L. C. Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds. Exp Hematol. 37 (1), 101-110 (2009).
    19. Proulx, C., Boyer, L., Hurnanen, D. R., Lemieux, R. Preferential ex vivo expansion of megakaryocytes from human cord blood CD34+-enriched cells in the presence of thrombopoietin and limiting amounts of stem cell factor and Flt-3 ligand. J. Hematother. Stem Cell Res. 12 (2), 179-188 (2003).
    20. Bornstein, R., Garcia-Vela, J., Gilsanz, F., Auray, C., Cales, C. Cord blood megakaryocytes do not complete maturation, as indicated by impaired establishment of endomitosis and low expression of G1/S cyclins upon thrombopoietin-induced differentiation. Br. J. Haematol. 114 (2), 458-465 (2001).
    21. Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. Drug-induced Immune Thrombocytopenia. Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).
    22. Stasi, R., et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management. Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    الوسوم

    CD34
    Megakaryocyte التمايز وتكوين الصفائح الدموية من الإنسان الحبل CD34 المستمدة من الدم الخلايا+
    اتصل بنا
    أوصِ بها للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.