ويرد وصف بروتوكول أساسية لتقييم سمية المواد الكيميائية في حيوان نموذج، ايليجانس كاينورهابديتيس،. الطريقة مريحة ومفيدة لتطوير المستحضرات الصيدلانية، وكذلك فيما يتعلق بتقييم المخاطر من الملوثات البيئية المختلفة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس "تأثير المواد الكيميائية" على النمو والتكاثر من ايليجانس كاينورهابديتيس
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقييم السمية أمر حاسم لفهم آثار المواد الكيميائية على الكائنات الحية في ميادين العلوم البيولوجية الأساسية والتطبيقية. طبقة من تربة غير الثدييات جولة دودة، ايليجانس كاينورهابديتيس، كائن نموذج قيمة لدراسات علم السموم نظراً للراحة وعدم وجود قضايا الأخلاقيات الحيوانات بالمقارنة مع نظم الحيوانات الثديية. ويرد في هذا البروتوكول، إجراء مفصل لتقييم السمية للمواد الكيميائية في C. ايليجانس . دواء السرطان سريرية، اتوبوسيدي، الذي يستهدف topoisomerase الإنسان الثاني، ويحول دون تكرار الحمض النووي من الخلايا السرطانية البشرية، اختيرت كنموذج اختبار مادة كيميائية. العمر-مزامنة C. ايليجانس البيض قد تعرضت إلى ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) أو اتوبوسيدي، وثم رصد نمو C. ايليجانس كل يوم لمدة 4 أيام من ملاحظة ستيريو المجهر. العدد الإجمالي للبيض أرسى من C. ايليجانس تعامل مع [دمس] أو كان يعول etoposide أيضا باستخدام المجهر ستيريو. العلاج Etoposide تأثرا كبيرا بالنمو والتكاثر من C. ايليجانس. بالمقارنة من العدد الإجمالي للبيض تضعه من الديدان مع فترات العلاج المختلفة للمواد الكيميائية، يمكن أن تكون قررت أن السمية الإنجابية للمواد الكيميائية على الاستنساخ C. ايليجانس عكسها أو لا رجعة فيها. قد يكون من المفيد لكل من التنمية من المخدرات المختلفة وتقييم المخاطر سميات البيئية هذه البروتوكولات.
المقدمة
تقييم السمية أمر ضروري لتطوير المستحضرات الصيدلانية، والمغذيات، وكوسميسيوتيكالس، فضلا عن تقييم المخاطر للسموم البيئية المختلفة. نموذج القوارض واحدة من الأكثر شعبية في فيفو التجريبية نظم هذا دراسة علم السموم؛ وبدلاً من ذلك، تستخدم على نطاق واسع أيضا الكائنات الحية غير الثدييات مثل C. ايليجانس . نماذج تقييم السمية في الثدييات عدم تعود بالفائدة بسبب القضايا الأخلاقية الحيوان أيضا راحتهم وفائدة النظر في الفعالية من حيث التكلفة والصيانة والسرعة وإمكانية تكرار نتائج1،2 ،،من34.
C. ايليجانس، تربة جولة دودة، واستغلت كحيوان نموذجية في البحوث الأساسية والتطبيقية والكيمياء وعلم الأحياء المختلفة. أنها طويلة 1 مم، ديدان أسطوانية شفافة، ويتم الاحتفاظ ببساطة في صلبة أو سائلة ديدان أسطوانية نمو وسائل الإعلام (NGM) التي تتغذى على سلالة البكتيريا الإشريكيّة القولونية OP50. C. ايليجانس لها دورة حياة قصيرة، ويضع N2 البرية من نوع C. ايليجانس حوالي 300 البيض. ولذلك، فإنه يتم نشر بسهولة لاستخدامها كمواد تجريبية3،،من45. C. ايليجانس كما تستخدم على نطاق واسع في الدراسات السمية للعديد من الأدوية والملوثات البيئية6،7،،من89.
نظراً لأن العديد من الأدوية السرطان تستهدف سرعة تقسيم الخلايا السرطانية، التي يمكن أن تلحق الضرر أيضا سرعة تقسيم الخلايا الطبيعية مثل نخاع العظام وظهاره الأمعاء وخلايا بصيلات الشعر. على سبيل المثال، topoisomerase المثبطة السرطان المخدرات تستهدف عملية النسخ المتماثل للحمض النووي لخلايا السرطان؛ ولذلك، أنها تمنع أيضا سرعة تقسيم الخلايا العادية. يحتوي كل كائن حي توبويسوميراسيس، وهذه topoisomerase مثبطات على الأرجح أثر النظم الإيكولوجية البيئية6،10،11. وهكذا، منصة تقييم سمية المخدرات حيوان نموذج باستخدام قيمة لكل من التنمية والأدوية وتقييم المخاطر البيئية.
في هذه المقالة، نحن وصف بروتوكولات مفصلة لاختبار سمية اتوبوسيدي، وعامل السرطان سريرية أن أهداف topoisomerase الثاني، كنموذج المواد كيميائية سامة في C. ايليجانس. لهذا الغرض، ونحن سوف تصف طريقة قياس حجم الجسم وإجمالي عدد البيض تضعه في C. ايليجانس تعامل مع اتوبوسيدي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يجب إجراء هذه التجربة كاملة في مختبر معزولة نظيفة للإبقاء على 20 درجة مئوية مع الغبار المنخفضة والتقليل إلى أدنى حد من التلوث خلال دودة ومناولة البكتيرية. ولهذا الغرض، يجب إجراء تجارب تحت شعلة مصباح الكحول أو باستخدام منضدة نظيفة.
1-صون C. ايليجانس وإعداد البيض "اختبار المواد الكيميائية"
- N2 C. ايليجانس المحافظة على (var. بريستول) على صفيحة أجار NGM تتغذى على العيش OP50 كولاي عند 20 درجة مئوية 12 ، 13-
- تحضير البيض العمر متزامنة باستخدام أما التبييض الحل العلاج 5 أو الوقت بيضة زرع الأسلوب 6 ، ، من 14 15-
ملاحظة: قبل إعداد البيض، معطف لوحة NGM المحتوية على اتوبوسيدي مع الحرارة-إبطال OP50 كولاي كما هو موضح أدناه. الحرارة-معطل ه القولونية OP50 يستخدم لتقليل النشاط الأيضي 6 ، كولاي 16-
2. إعداد إبطال الحرارة كولاي OP50 آر جيم ايليجانس "أثناء اختبار السمية"
- إعداد 500 مل من الخميرة مزدوجة متوسطة تريبتوني (تضع لمساتها الأخيرة) كما هو موضح في الجدول 1، وتطعيم مستعمرة واحدة من OP50 كولاي المزروع في أغار لوريا بيرتاني (رطل) لوحة 5.
- احتضان OP50 كولاي في حاضنة تهتز ح 14 عند 37 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة-
- بعد الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 3,220 س ز و 20 درجة مئوية، إزالة جميع طافية تضع لمساتها الأخيرة المتوسطة، وإضافة خليط قبل 25 مل من المخزن المؤقت S وميليلتر 250 1 م MgSO 4 و 25 ميليلتر من الكوليسترول 5 ملغ/مل (الذائبة في الإيثانول). جميع هذه الحلول العقيمة.
- ريسوسبيند البكتيريا وتحويلها إلى أنبوب بلاستيك القابل للصرف 50 مل.
- للحرارة-المنظمة، احتضان ريسوسبينديد OP50 كولاي في حمام مائي لمدة 30 دقيقة في 65 ° C.
- باردة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. وهذا يمكن تخزينها لمدة تصل إلى شهر واحد.
3. إعداد NGM لوحات تتضمن أما 1% [دمس] أو مكم 750 اتوبوسيدي
- تحضير اثنين نظيفة 200 مل الزجاجات. إضافة 0.6 غ من كلوريد الصوديوم، غ 0.5 من ببتون، 3.4 غرام من 195 مل من الماء المقطر، أجار، ومحرض مغناطيسي إلى زجاجة واحدة. إضافة محرض مغناطيسي بزجاجة فارغة أخرى.
- زجاجات اﻷوتوكﻻف هذين لمدة 15 دقيقة في 121 درجة مئوية، ومن ثم يبرد الزجاجات في حمام مائي لمدة 30 دقيقة في 55 درجة مئوية.
- إضافة 0.2 مل كاكل 1 م 2، 0.2 مل من الكوليسترول 5 ملغ/مل، 0.2 مل من 1 م MgSO 4، ومل 5 م 1 مشرف 4 (جميع هذه الحلول عقيمة) وثم مزجها بإثارة المغناطيسية على صفيحة ساخنة في 55 درجة مئوية.
- تقسيم المتوسطة NGM مختلطة زجاجتين بنفس الحجم (100 مل في كل). بعد ذلك، أضف 1 مل من [دمس] إلى زجاجة واحدة، المزيج مرة أخرى باستخدام التحريك المغناطيسي. تخزين زجاجة أخرى في حمام مائي عند درجة 55 درجة مئوية حتى الخطوة التالية. اليكووت 3 مل من المتوسطة المحتوية على [دمس] لكل 35 × 10 مم 2 طبق بيتري. ويمكن إجراء حوالي 33 NGM المحتوية على [دمس] لوحات من هذه الخطوة.
- ميكس زجاجة أخرى استخدام التحريك المغناطيسي وإضافة 1 مل etoposide 75 مم (الأسهم حله في [دمس]) وتخلط مرة أخرى وكرر الإجراء اليكووت (الخطوة 3، 4). اتوبوسيدي حوالي 33 (750 ميكرومتر)-تتضمن لوحات NGM يمكن أن تكون مصنوعة من هذه الخطوة.
ملاحظة: في ترتبط السابق ورقة 6، نحن اختبار 0، 250، 500، وميكرومتر 1,000 من etoposide. استناداً إلى هذه البيانات، اخترنا في هذه الورقة ميكرومتر 750 جرعة etoposide- - باردة أسفل لوحات NGM المحتوية على المواد الكيميائية بدرجة حرارة الغرفة التي تركها في درجة حرارة الغرفة لحوالي 3 ساعات، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى استخدام.
ملاحظة: في حالة المواد الكيميائية الحساسة للضوء وحجب الضوء إلى أدنى حد من التحلل الناجم عن الضوء.
ملاحظة: بشكل اختياري، جعل لوحة NGM عادي دون المواد الكيميائية للبيض زرع المقايسة، التي يمكن أن يؤديها باستخدام شرطين المعالجة الكيميائية المختلفة كما هو موضح أدناه. - إضافة 100 ميليلتر من الحرارة-إبطال OP50 كولاي (كما هو موضح في القسم 2) وانتشرت في كل لوحة NGM. السماح الجافة بين عشية وضحاها في حاضنة C. ايليجانس في 20 درجة مئوية ل test. الكيميائية
4. قياس النمو C. ايليجانس
- نقل البيض ومزامنة العمر C. ايليجانس لوحة NGM تكملة مع [دمس] 1% أو 750 ميكرون etoposide-
- إينكوباتي C. ايليجانس في حاضنة في 20 درجة مئوية لمدة 4 أيام. مراقبة الديدان استخدام مجهر ستيريو، وتأخذ الصور المجهرية كل يوم. 20 X التكبير (عدسة الهدف X 1، 2 X التكبير التكبير، وعدسة العدسة X 10) عادة مناسبة لرصد النمو C. ايليجانس. كما تأخذ صورة مجهرية ميكرومتر مرحلة مجهر لمعايرة حجم الدودة.
ملاحظة: الجوع يؤثر على اختبار السمية. ولذلك تغذية مع البكتيريا كافية أو ضبط المنقول C. ايليجانس البيض أرقام في البداية. مراقبة حتى 3 أيام لاستبعاد إمكانية المجاعة. - قياس طول الجسم C. ايليجانس تعامل مع [دمس] أو اتوبوسيدي في كل نقطة وقت استخدام البرمجيات إيماجيج.
ملاحظة: لكل قياس عينة، الديدان 50 كافية للتحليل الإحصائي.- "في إيماجيج"، فتح الصورة ميكرومتر المرحلة المجهر (' ملف ' → ' فتح ')-
ملاحظة: صورة ميكرومتر وصور دودة (الخطوة 4، 2) يجب أن يكون التكبير نفسه. - اسحب خط من 1,000 ميكرومتر على الصورة معايرة ميكرومتر باستخدام ' "خط مستقيم" ' أداة.
- انقر فوق ' تحليل ' → ' "ضبط مقياس" ' وإدخال 1000 وميكرومتر في ' يعرف المسافة ' مربع و ' وحدة طول ' مربع، على التوالي. تحقق من ' العالمي '، وانقر فوق ' موافق '.
- فتح الصور دودة (' ملف ' → ' فتح '). رسم خط على طول السمة لكل دودة باستخدام ' "الخط اليدوي" ' أداة. الحصول على بيانات ذات طول الجسم بواسطة النقر فوق ' تحليل ' → ' قياس '.
- كرر هذه الخطوات للديدان 50-
- "في إيماجيج"، فتح الصورة ميكرومتر المرحلة المجهر (' ملف ' → ' فتح ')-
5. C. ايليجانس "البيض بزرع الإنزيم"
البيض- إينكوباتي العمر متزامنة في NGM لوحة تحتوي على [دمس] أو اتوبوسيدي ح 64 (قبل الولادة الأولى) حتى مرحلة الشباب البالغين في 20 درجة مئوية.
ملاحظة: واختياري استخدام الديدان من تجارب قياس النمو. أنها ملائمة للقيام بقياس النمو والبيض المقايسة زرع معا.
لوحات - 5 نقل الديدان الكبار إلى NGM جديدة دون المواد الكيميائية (الشرط 1، العلاج الكيميائي خلال فترة معينة من الزمن، من البيض إلى مرحلة الشباب البالغين) أو لوحات NGM الجديدة التي تتضمن المعالجة الكيميائية نفسها (شرط 2، التعرض المستمر المواد الكيميائية من خلال الفترة التجريبية عموما)، وثم احتضانها لهم عن 24 h.
ملاحظة: من المستحسن جعل replicates استخدام لوحات NGM 3-5 لكل معاملة؛ يمكن أن تستخدم هذه replicates للتحليل الإحصائي- - نقل إلى لوحة NGM جديدة كما هو موضح أعلاه، وحساب عدد البيض كل يوم. عد الديدان زحف قبالة، وتوفي، وكانت داخليا هاتشاد
- كرر هذه الخطوات حتى الديدان الإباضة لا أكثر، عادة في 5 أيام-
- حساب عدد البيض تضعه كل دودة من كل لوحة، ومجموع هذه القيم كل يوم لمدة 5 أيام لتحديد إجمالي عدد البيض تضعه.
ملاحظة: استبعاد عدد الديدان التي زحف قبالة وداخلياً فقست من الحساب-
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
علاج اتوبوسيدي (ح 24-96) إلى حد كبير المتخلفين نمو C. ايليجانس. بعد 96 ساعة حضانة، نما etoposide--علاج الديدان إلى 0.86 مم في طول الجسم، بينما نما الديدان المعالجة بالسيارة إلى 1.04 ملم (الشكل 1). ولوحظ تأخر النمو أيضا على ما يبدو تحت المجهر ستيريو الملاحظة (الشكل 2). أننا بدأنا نرى البيض من الديدان المعالجة بالمركبات في 72 ساعة حضانة. من ناحية أخرى، لوحظ البيض بعد 96 ساعة معاملة اتوبوسيدي. من هذه البيانات، ونحن تكهن بأن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه المقالة، يصف لنا تقييم سمية المواد الكيميائية في C. ايليجانس، ديدان أسطوانية تربة، باستخدام اتوبوسيدي كمثال السمية. ولهذا الغرض، استخدمنا شرطين التجريبية. في المجموعة الأولى، C. ايليجانس كانت تزرع في اتوبوسيدي الذي يتضمن لوحات من البيض إلى مرحلة البالغين الشباب، ومن ثم سمح للديدان بوضع البيض على لوحات NGM العادي دون المواد الكيميائية. في المجموعة التجريبية الثانية، C. ايليجانس يعاملون بشكل مستمر مع etoposide طوال فترة تجريبية كاملة. مقارنة الأرقام البيض بين الشرطين التجريبية، يمكننا أن ن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
أيد هذه الدراسة المنح البحثية الداخلية معهد كوريا للعلوم والتكنولوجيا (2E27513)، وفي عالية القيمة المضافة الغذائية تكنولوجيا التنمية برنامج (IPET) الممولة من وزارة الزراعة والأغذية والشؤون الريفية (315067-03).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Agar | Affymetrix ، الولايات المتحدة الأمريكية | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans < / em> N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) النوع | ||
| البري من الكوليسترول | سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية | C3045 | |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية | D2650 < | |
| em> الإشريكية القولونية < / em>OP50 | مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma ، الولايات المتحدة الأمريكية | E1383 | |
| Image J software (الإصدار 1.4) | معهد Natinoal للصحة ، الولايات المتحدة الأمريكية | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| كاميرا المجهر | Jenopitk ، Progress Gryphax ، ألمانيا | ||
| Peptone | Merck ، الولايات المتحدة الأمريكية | 107213 | |
| 35 & 10 ملم طبق بتري | SPL علوم الحياة ، كوريا الجنوبية | 10035 | |
| 90 & 15 ملم طبق بتري | SPL علوم الحياة ، كوريا الجنوبية | 10090 | |
| مجهر ستيريو | نيكون ، اليابان | SMZ800N | |
| مستخلص الخميرة | بيكتون ديكنسون ، الولايات المتحدة الأمريكية | 212750 |
المراجع
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667(2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293(2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152(2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563(2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445(2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919(2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321(2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
