Method Article

أساليب بديلة في المختبر لتحديد السلامة الهيكلية قفيصه الفيروسية

DOI:

10.3791/56444

⸱

November 16th, 2017

 ,  , 
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أساليب الكشف الروتيني استخدام الجينوم الفيروسي التضخيم مقيدة بعجزهم عن تميز المعدية من جسيمات غير معدية. والغرض من هذه المقالة توفير بروتوكولات مفصلة عن طرق بديلة للمساعدة على تمييز جزيئات نوروفيروس المعدية استخدام ابتمر ملزمة، وتشتت الضوء الديناميكي، ومجهر إلكتروني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوروفيروس البشرية ينتزع قدرا كبيرا من الصحة العامة والخسائر الاقتصادية في جميع أنحاء العالم. الناشئة في المختبر السلف زراعة غير قابلة حتى الآن للكشف الروتيني للفيروس. كشف الحالية وتقنيات القياس الكمي، والتي تعتمد بالدرجة الأولى على تضخيم الحمض النووي، لا تميز المعدية من الجسيمات الفيروسية غير المعدية. والغرض من هذه المقالة أن يقدم تفاصيل محددة بشأن التقدم الذي أحرز مؤخرا في التقنيات المستخدمة معا بغية الحصول على المزيد من المعلومات بشأن حالة العدوى الفيروسية الجسيمات. أسلوب واحد ينطوي على تقييم ملزم ابتمر ssDNA نوروفيروس إلى كابسيدس. الابتامرات ميزة يجري تصنيعه وتعديلها بسهولة، وهي غير مكلفة ومستقرة. تقنية أخرى, ديناميكية تناثر الضوء (DLS)، له ميزة مراقبة السلوك قفيصه في الحل. المجهر الإلكتروني يسمح للتصور السلامة الهيكلية كابسيدس الفيروسية. على الرغم من الوعد، هناك بعض العيوب لكل تقنية، مثل ابتمر غير محددة ملزمة لجزيئات مشحونة بشكل إيجابي من مصفوفات عينة، واشتراط قفيصه المنقي لدائرة الأراضي والمساحة، وضعف الحساسية للمجهر الإلكتروني. ومع ذلك، عندما تستخدم هذه التقنيات مجتمعة، نص البيانات المنتجة يوفر معلومات شاملة أكثر على سلامة قفيصه نوروفيروس التي يمكن استخدامها للاستدلال على العدوى، المعلومات التي من الضروري إجراء تقييم دقيق أساليب المنظمة أو تفسير للكشف عن الفيروسات. توفر هذه المقالة البروتوكولات لاستخدام هذه الأساليب لتميز جزيئات نوروفيروس البشرية المعدية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نوروفيروس البشرية المسؤولة عن عبئا كبيرا في مجال صحة العامة على الصعيد العالمي، تسبب الأمراض حوالي 685 مليون و 212,000 حالة وفاة سنوياً1، بتكلفة تقدر بمليارات الدولارات2،3في. واليوم، نوروفيروس الكشف والتحديد الكمي ينطوي التضخيم الجينوم و/أو الأنظمة الأساسية المستندة إلى يجند. الأول المفضل عموما كما أكثر حساسية، ويوفر المعلومات الكمية، وقد خطر أقل عموما من النتائج الإيجابية الكاذبة4. الأكثر شيوعاً نوروفيروس الكشف والتحديد الكمي الجينوم التضخيم هو التقنية المنتسخة العكسية الكمية تفاعل البوليميراز المتسلسل (RT-قبكر). لأنه يستهدف ويسهب شريحة صغيرة من الجينوم البشري نوروفيروس، الرايت-qPCR وحدها ليست قادرة على التمييز بين المعدية والجسيمات غير المعدية، كالجيش الملكي النيبالي الجينوم مجاناً، تضررت كابسيدس التي تحتوي على الجينوم، وكابسيدس مع قاتلة يمكن أن لا تزال تضخيم جينومات المتحولة باقتطاع من الرايت qPCR. بينما سجلت مؤخرا اثنين في المختبر زراعة تقنيات جديدة للبشرية نوروفيروس5،6 ، على حد سواء لا تزال تعتمد على الرايت qPCR للفيروس الكمي وليست أساليب مجدية الروتينية السريرية والبيئة اختبار للبشرية نوروفيروسيس. وهكذا، يبقى RT qPCR المعيار الذهبي للتجارب السريرية والبيئة.

وقد وضعت أساليب أخرى في المختبر في محاولة لتقدير أفضل حالة العدوى من جسيمات نوروفيروس. ويمكن تصنيف هذه الأساليب عموما كتلك التي تتناول سلامة قفيصه نوروفيروس، والقائمين بتقييم سلامة الجينوم. النهج السابق أكثر شعبية. هو أسلوب استخداماً رناسي المعالجة المسبقة قبل استخراج الحمض النووي الريبي الجينوم الفيروسي، ولكن هذا لا يفسر الجسيمات الفيروسية، لا تزال سليمة ولكنها تفتقر إلى القدرة على ربط المضيف مستقبلات/co-العوامل، فضلا عن الجسيمات الفيروسية أن تحور قاتلة أو اقتطاع أو تلف هامشيا الجينوم7. سلامة قفيصه يمكن أيضا تقييم يستند إلى قدرة الفيروس على ربط نوروفيروس البشرية المشارك-ريسيبتور/co-العوامل التي هي الكربوهيدرات المعروفة باسم histo-الدم مجموعة مولدات المضادات (هبجاس). هبجاس موجودة في الخلايا الظهارية المعوية المضيف كجزء من جليكوبروتينس أو جليكوليبيدس (بين متعددة الأنسجة الأخرى) وقد يفرز في سوائل الجسم مثل اللعاب. قد أظهرت أيضا البكتيريا المعوية التي تحتوي على مواد مثل هبجا على الأسطح لربط نوروفيروس البشرية8،،من910، وقد تشجع مثل هذه التفاعلات نوروفيروس العدوى5. أن المفهوم الأساسي لاستخدام الربط هبجا أن قادرة على ملزمة المفترضة المستقبلات/المشارك-فكتور الفيروسية الجسيمات فقط ستكون قادرة على إصابة الخلايا. دراسات متعددة تشير إلى أن أساس حبة هبجا الملزمة السابقة لتضخيم الحمض النووي وسيلة واعدة للعدوى التمييز11،،من1213،14، ،من 1516. تحديا كبيرا فيما يتعلق هبجاس أن لا واحد من نوع هبجا يمكنك ربط جميع الأنماط الجينية البشرية نوروفيروس. لمعالجة هذا الوضع، قد استخدمت الميوسين المعدة الخنزير، الذي يحتوي على هبجاس، بدلاً من الكربوهيدرات هبجا المنقي حرصا على سهولة التوليف والاتساق، وخفض التكلفة.

منشور صدر مؤخرا من مور et al. 17 عرض مجموعة من التقنيات الجديدة لتقدير سلامة قفيصه نوروفيروس البشرية. بدلاً من هبجاس، مور et al. 17 التحقيق ملزم رد الفعل على نطاق واسع من الحمض النووي ابتمر (M6-2)18 و رد الفعل على نطاق واسع [مونوكلونل] جسم (NS14)19 إلى ردات كابسيدس نوروفيروس سيدني GII.4 (جسيمات شبيهة بالفيروس أو فلبس) ومقارنة هذا للربط إلى هبجاس الاصطناعية. الابتامرات الحمض النووي هي قصيرة (nt ~ 20-80) واحد الذين تقطعت بهم السبل الأحماض النووية (ssDNA أو الحمض النووي الريبي) إضعاف في هياكل ثلاثية الأبعاد فريدة من نوعها نتيجة تسلسلها وربط هدفا. بسبب وجود الأحماض النووية، فأقل تكلفة؛ كيميائيا بسهولة تصنيعه، النقي، وتم التعديل؛ ومستقرة للحرارة. توجد عدة تقارير عن الابتامرات ولدت ضد نوروفيروسيس، مع بعض منهم عرض تفاعلية واسعة لمجموعة متنوعة من السلالات18،20،،من2122. وعلى سبيل المثال، مور et al. 17 أظهرت أن ابتمر M6-2 منضم إلى نوروفيروس البشرية النقية، وتجميعها كابسيدس (فلبس)، وتصرفت على نحو مماثل إلى هبجا في الاعتماد على قفيصه الفيروسية للحفاظ على النظام (مثلاً، التعليم الثانوي والعالي) أعلى بروتين بنية ملزم تحدث. من ناحية أخرى، ظلت نسبة كبيرة من نوروفيروس عزام ملزمة لجسم NS14 بعد أن كانت كابسيدس التشويه والتحريف تماما. تقييم لربط نوروفيروس في دراسة مور et al. 17 تم استخدام طريقة بسيطة، والمستندة إلى لوحة شبيه أليسا، باستثناء أن الابتامرات تستخدم بدلاً من الأجسام المضادة (وبالتالي تم استدعاء الأسلوب العزة). تم استخدام هذا الأسلوب التجريبي إنتاجية عالية لتقييم آثار المعالجات المختلفة في قفيصه نوروفيروس، العمل الذي قيمة لفهم إليه المنظمة الفيروسية عند التعرض لعوامل الإجهاد الفيزيائية أو الكيميائية. ومع ذلك، هو عيب واحد إلى هذا الأسلوب أقل حساسية وعدم التسامح للملوثات المرتبطة بالمصفوفة في المستويات العليا التي تسبب غير محددة ملزمة الابتامرات.

مور et al. 17 استخدام أسلوب آخر، تناثر الضوء الحيوي (DLS)، لرصد تجميع الجزيئات الفيروسية في الاستجابة للمعالجة بالحرارة. يستخدم عادة لتقييم حجم تعليق نانوحبيبات DLS وامتد للبروتينات23،24 والفيروسات25،،من2627. كثافة الضوء المتناثرة من الجسيمات في حل يتقلب كدالة لحجم الجسيمات، مما يسمح لحساب معامل الانتشار، ومن ثم قطر الجسيمات باستخدام صيغ راسخة. يمكن التمييز بين تقنية DLS هيدرودينامية قطر الجسيمات المشتتة وصولاً إلى النانو، الذي يتيح الكشف عن الفيروسات مشتتة وبروتينات قفيصه الفردية أو dimers والمجاميع الفيروسات استناداً إلى حجم27. تجميع الفيروسات، تمثل زيادة في حجم الجسيمات، ويدل على فقدان سلامة قفيصه. كما قفيصه هو التشويه والتحريف وعطلت هيكلها، بقايا مسعور أصبح عرضه وتسبب الجسيمات عصا معا وتشكيل المجاميع. يمكن استخدام دائرة الأراضي والمساحة لقياس حجم الجسيمات بعد علاج محدد أو الحركية للتجميع في الوقت الحقيقي17،28. هذا الأسلوب له الميزة للسماح بمراقبة سلوك قفيصه في الحل ولكن يتطلب تركيزات عالية من قفيصه النقية، التي قد لا تكون ممثلة تماما للفيروس في حالته الطبيعية.

الأسلوب النهائي يستخدمها مور et al. وكان 17 مجهر إلكتروني (TEM). على الرغم من أن هذا الأسلوب يفتقر إلى الحساسية ولا تنتج بيانات كمية، فإنه يسمح لتصور آثار العلاجات المختلفة في هيكل قفيصه الفيروسية. على الرغم من أن ليست مثالية بعد لإعدادات السريرية والبيئة، استخدام هذه الأساليب في تركيبة قيمة في فهم المنظمة نوروفيروس البشرية. والغرض من هذه المقالة توفير بروتوكولات متعمقة مقايسة الربط القائم على لوحة (العزة)، دائرة الأراضي والمساحة، واستخدام أساليب إعداد تيم للتحقيق في آثار المعالجات الحرارية في قفيصه نوروفيروس في سياق الآثار العلاجات في قفيصه سلامة كما عرضت في مور et al. 17.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المستندة إلى لوحة "الفحص ملزمة" "تقييم الخسائر من أعلى ترتيب نوروفيروس قفيصه هيكل"

ملاحظة: بروتوكول العزة مشابهة جداً لتلك المقدمة هنا قد نشرت 29، وفحوصات العزة مماثلة أفيد سابقا كجزء من بحوث المواد في أماكن أخرى 17 ، ، من 18 22-

  1. المعالجة الحرارية للبشرية نوروفيروس سيدني GII.4 كابسيدس
    1. الحصول على نوروفيروس البشرية تنقية البروتين قفيصه الرئيسية (VP1) سيدني GII.4 (الانضمام: JX459908) المجتمعين في كابسيدس-
      ملاحظة: تم الحصول على كابسيدس في الدراسة من باب المجاملة R. اتمار (كلية طب بايلور، هيوستن، تكساس)-
    2. ديلوت كابسيدس إلى 50 ميكروغرام/مل في 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS، الرقم الهيدروجيني 7.2) إلى وحدة تخزين الحد أقصى من 15 ميليلتر في أنابيب PCR توج الفردية. تأكد من أن الأنبوب يحتوي على مالا يقل عن 600 نانوغرام قفيصه. التأكد من أن هناك 600 نانوغرام قفيصه كل تركيبة العلاج-يجند.
    3. يسخن cycler الحرارية للمعالجة الحرارية المطلوبة.
      ملاحظة: لأغراض هذا البروتوكول، العلاج في 68 درجة مئوية لأوقات مختلفة (0-25 دقيقة) واختير.
    4. يسخن cycler حرارية إضافية إلى 4 درجة مئوية للتبريد الفوري. إضافة أنابيب مع الحل قفيصه إلى cycler الحرارية للوقت المطلوب. نقل على الفور إلى cycler يبرد قبل 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق بعد التدفئة. علاج
      1. تشمل 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق كعنصر تحكم قفيصه التشويه والتحريف. وتشمل الحلول قفيصه غير المعالجة (23 درجة مئوية) كعنصر إيجابي. وتشمل برنامج تلفزيوني مع لا قفيصه كعنصر تحكم سلبية إضافية.
    5. تدور بإيجاز إلى أسفل في أجهزة الطرد مركزي للحصول على جميع قطرات إلى الجزء السفلي من الأنبوب وتمييع الحلول قفيصه المعالجة في برنامج تلفزيوني إلى 3 ميكروغرام/مل. التأكد من أن هناك على الأقل 200 ميليلتر من قفيصه المخفف، والمعالجة (100 ميليلتر في البئر).
  2. تطبيق 100 ميليلتر من قفيصه حل لكل بئر، ضمان هناك على الأقل بئرين للعلاج. بالإضافة إلى ذلك، تشمل آبار مراقبة 2 مع برنامج تلفزيوني ميليلتر 100 لكل يجند؛ وهذا يوفر امتصاص الخلفية للمقايسة. تغطية اللوحة مع غطاء، وختم الحواف مع البارافين الفيلم إلى تخفيض التبخر، وترك بين عشية وضحاها في حاضنة تهتز عند 4 درجة مئوية أو ح 2 في درجة حرارة الغرفة-
  3. إعداد المخزن المؤقت حظر بجعل المواد الصلبة في اللبن المقشود 5% (w/v) في برنامج تلفزيوني مع 0.05% 20 توين (ببست)-
    4. إزالة
  4. الحلول قفيصه المعالجة من اللوحة. إضافة من المخزن المؤقت حظر 200 ميليلتر/جيدا. احتضانها ح 2 في درجة حرارة الغرفة أو بين ليلة وضحاها، أغلقت في 4 ° C.
  5. تحضير يجند ملزمة الحلول ابتمر بيوتينيلاتيد M6-2 18 ، 29 وبيوتينيلاتيد الاصطناعية هبجا الدم A أو بيوتينيلاتيد نوع ه.
    1. ديلوت ابتمر بيوتينيلاتيد إلى 1 ميكرومتر في المياه خالية من نوكلاس. التأكد من أن هناك حل ما يكفي ميليلتر 200 المجموع لكل معاملة. تمييع بيوتينيلاتيد المختار هبجا إلى 30 ميكروغرام/مل في المخزن المؤقت لحظر. التأكد من أن هناك حل ما يكفي ل 200 ميليلتر الحجم الإجمالي لكل معاملة.
      ملاحظة: لاستخدام أقل هبجا، 10 ميكروغرام/مل من هبجا في اللبن المقشود 0.25%-ببست يمكن أن تكون بديلاً. تم مسبقاً الأمثل تركيزات بيوتينيلاتيد M6-2 وهبجا وذكرت-
  6. إزالة المخزن المؤقت حظر وغسل الأطباق 3 مرات مع 200 ميليلتر/بئر ببست. بات لوحة رأسا على مناشف ورقية معقمة لتجفيف الرطوبة المتبقية.
  7. من يجند إضافة 100 ميليلتر/جيدا حلول ملزمة، التأكد من وجود آبار 2 الواحدة والجمع بين المعالجة بالحرارة-يجند. احتضان لوحة مغطاة بغطاء على شاكر مدارية حوالي 60 لفة في الدقيقة ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: تأكد من تضمين الآبار 2 كل كابسيدس غير المعالجة والتشويه والتحريف تماما كابسيدس لكل من يجند كعناصر إيجابية وسلبية، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك، تشمل 2 " لا قفيصه " آبار لكل من يجند كاللوحة خلفية عنصر التحكم.
    8. إزالة الحلول يجند
  8. وغسل الآبار 3 مرات مع 200 ميليلتر/بئر ببست. بات اللوحة رأسا على مناشف ورقية معقمة لتجفيف الرطوبة المتبقية.
  9. إضافة 100 ميليلتر/جيدا لحل 0.2 ميكروغرام/مل ستريبتافيدين-الفجل البيروكسيديز في برنامج تلفزيوني. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف على شاكر مداري.
    ملاحظة: سوف يكون مختلف streptavidin-الفجل البيروكسيديز يصرف تركيزات مختلفة. استشارة المستخدم ' s دليل لمجموعة مثالية من تركيزات للتطبيقات أليسا إنزيم وتأكد من أنها الأمثل.
  10. إزالة الحل المتقارنة. أغسل 3 مرات مع 200 ميليلتر/بئر ببست. بات اللوحة رأسا على مناشف ورقية معقمة لتجفيف الرطوبة المتبقية.
    11. إضافة 100 ميليلتر/بئر 3,3
  11. '، 5,5 '-تيتراميثيلبينزيديني (TMB) الركيزة، والسماح للون لتطوير آبار المراقبة السلبية مراقبة 5-15 دقيقة لأي لون ومن المؤكد أن استمرار وضع في نفس الوقت بين لوحات تكرار. يكون على بينه من مدى امتصاص القارئ اللوحة المستخدمة، كذلك-
    ملاحظة: قد تختلف أوقات النامية استناداً إلى نوعية يغاندس/والكواشف المستخدمة.
  12. وقف تطوير التفاعل مع حامض الفوسفوريك م 1 ميليلتر/بئر 100. فورا قراءة اللوحة في 450 نانومتر. حفظ البيانات-
    ملاحظة: الأخذ بالحامض عموما يبطئ رد فعل جذري لكن عدم وقفها تماما. لا تترك لوحة الإيقاف لكمية موسعة من الوقت قبل القراءة امتصاص.

2. تحليل "نتائج التحليل" القائم على لوحة

  1. حفظ البيانات الخام امتصاص في برنامج جدول بيانات. إنتاج أبسوربانسيس متوسط لكل زوج جيد مع معاملة خاصة ويجند. استخدم هذه المتوسطات لجميع التحاليل اللاحقة-
    ملاحظة: مقارنة كلا أبسوربانسيس جيدا للتأكد من أنه لا يوجد أزواج من الآبار تحتوي على قيم متباينة إلى حد كبير-
  2. لتحليل سلامة قفيصه المطلق (كل ملزمة)، طرح امتصاص الخام " لا قفيصه " التحكم من كل قيمة امتصاص العينة الأخرى.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، فقدان ملزم بسبب فقدان ترتيب أعلى الهيكل (الثانوي، والتعليم العالي، رباعي) يمكن مباشرة تحليلها. بدلاً من طرح امتصاص سلبية (لا قفيصه) عنصر التحكم، قم بطرح قيمة عنصر التحكم قفيصه التشويه والتحريف تماما. يزيل هذا ربط جميع الإشارات سبب ملزم للجهاز غير محدد كذلك ملزمة بسبب تسلسل قفيصه. عرض هبجا وابتمر M6-2 ملزمة قليلاً إلى قفيصه التشويه والتحريف تماما، حيث الأسلوب أما تنتج نتائج مماثلة. إشارة إيجابية كاذبة تنسب إلى ربط ابتمر غير محدد يجب مراعاتها عند اختيار أي تحليل لاستخدام-
  3. مع السلبية أو التشويه والتحريف تعديل عنصر التحكم أبسوربانسيس، تقسيم معاملة أبسوربانسيس بإيجابية على كل منهما (أي علاج) التحكم في أبسوربانسيس، ومضاعفة 100. وهذا يوفر النسبة المئوية لإشارة قفيصه المعالجة بالنسبة لعنصر التحكم غير المعالجة-
    4. طرح
  4. لتقدير درجة إشارة ملزمة لكل من يجند تعزى إلى تسلسل قفيصه، " لا قفيصه " السلبية التحكم من أبسوربانسيس الأولى، وتأخذ امتصاص المعدلة من قفيصه التشويه والتحريف. هذه القسمة على امتصاص المعدلة من إشارة التحكم الإيجابي، واضربها في 100. وهذا يعطي النسبة المئوية الظاهر لإشارة سبب ملزم يجند لتسلسل التشويه والتحريف قفيصه/قفيصه.

3. دائرة الأراضي والمساحة للكشف عن الفيروس التجميع بعد المعالجة بالحرارة

ملاحظة: قد تكون الخطوات التالية الخاصة بالبرمجيات وصك المستخدمة، ولكن يمكن تكييفها وتطبيقها على أجهزة مشابهة.

  1. إنشاء حجم جديد سوب في دائرة الأراضي والمساحة الصك باستخدام البرمجيات: المواد البروتين، ديسبيرسانت = = برنامج تلفزيوني، درجة الحرارة = 25 درجة مئوية، وقت الموازنة = 0 ثانية، نوع الخلية = ومبومو المتاح (حجم صغير، ZEN0040)، قياس زاوية = 173 درجة تشتت ارتدادي، مدة القياس = تلقائي، عدد من القياسات = 3، تأخير بين القياسات = 0 ثانية، معالجة البيانات: نموذج تحليل = الغرض العام (جودة عادية). استخدام الإعدادات الافتراضية لكافة المعلمات الأخرى.
  2. حدد السهم الأخضر التشغيل داخل البرنامج، واسم العينة.
  3. اتبع الخطوات 1.1.1 من خلال 1.1.4 لعلاج الحرارة فلبس-
    4. تعامل
  4. ديلوت الحرارة فلبس 01:10 1 x برنامج تلفزيوني لتركيز نهائي من 5 ميكروغرام/مل. (اختياري) تصفية العينة مع حجم مسام ميكرومتر 1 لإزالة ذرات الغبار؛ DLS حساس جداً للغبار، كما مبعثر جزيئات كبيرة أكثر بكثير من الضوء من جسيمات صغيرة-
    5. ومبومو
  5. نقل 50 ميليلتر من فلبس المخفف المتاح إلى حجم صغير. إدراج في ومبومو في قاعة عينة الصك.
  6. بدء التشغيل، واستخدم ' كوريلوجرام '، ' تناسب كومولانتس '، و ' "مشورة الخبراء" ' علامات التبويب لتقييم نوعية البيانات.
    1. أثناء التشغيل، تحقق من أن قيمة مؤشر polydispersity أقل من 0.3، تمثل جودة القياس. في ‘ عرض متعددة ’ علامة التبويب، تأكد من أن معامل الارتباط هو ثابت وقريبة، ولكن ليس أكثر من 1، في وقت قصير، ويسقط قبالة حادا إلى 0 في وقت لاحق، مميزة لحجم الجسيمات. استخدام ‘ "المشورة الخبيرة" ’ علامة التبويب لتغذية مرتدة بشأن نوعية البيانات خلال القياسات.
    2. بعد الانتهاء، من القياس التحقق مرة أخرى أن قيمة مؤشر polydispersity أقل من 0.3. تأكد من أن كومولانتس تناسب السطر التالي تشير البيانات عن كثب في ‘ كومولانتس تناسب ’ التبويب
  7. أخذ متوسط قطرها الجسيمات ض متوسط ذكرت لكل قياس حجم الجسيمات لكل عينة. مؤامرة القطر في شمال البحر الأبيض المتوسط مقابل درجة الحرارة بدرجة مئوية.

4. دائرة الأراضي والمساحة "الكشف عن الفيروس التجميع" في الوقت الحقيقي

ملاحظة: الخطوات التالية قد تكون محددة لبرنامج وأداة المستخدمة، ولكن يمكن تكييفها وتطبيقها على أجهزة مشابهة.

  1. إنشاء حجم جديد سوب في دائرة الأراضي والمساحة الصك باستخدام البرمجيات: المواد = البروتين، ديسبيرسانت = برنامج تلفزيوني، درجة الحرارة = وقت الموازنة المرجوة، = 0 ثانية، نوع الخلية = ومبومو الكوارتز، قياس زاوية = 173 درجة تشتت ارتدادي، قياس المدة = التلقائي، عدد من القياسات = 50 (قد يكون معدل زيادة أو نقصان اعتماداً على التجميع)، تأخير بين القياسات = 0 ثانية، معالجة البيانات: نموذج تحليل = ضيقة وسائط متعددة (عالية الدقة). استخدام الإعدادات الافتراضية لكافة المعلمات الأخرى.
  2. حدد السهم التشغيل داخل البرنامج لفتح واسم نموذج جديد، وتسمح هذه الوسيلة للوصول إلى توازن درجة الحرارة-
  3. تعليق فلبس في برنامج تلفزيوني X 1 في أنبوب ميكروسينتريفوجي بتركيز 5 ميكروغرام/مل وحجم بين 200-500 ميليلتر. دوامة التعليق.
  4. معين باستمرار تعليق عزام ل s 5-10 في منضدية للطرد مركزي الغاز دي. وهذا يساعد على منع تكوين فقاعة أثناء المعالجة الحرارية الذي يتداخل مع قياسات الحجم.
    5. ومبومو-تجنب فقاعات تعليق
  5. نقل عزام إلى كوارتز صغيرة حجم و "الماصة؛" ببطء ضد الجدار ومبومو. بعد الصك وصلت درجة حرارة التوازن، إدراج ومبومو في قاعة عينة-
    6. S
  6. 10 الانتظار لدرجة حرارة العينة حجته، ثم بدء التشغيل. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت في بدء التشغيل. إيقاف جهاز ضبط الوقت في نهاية القياس الأولى. تأخذ هذه المرة كالنقطة المرة الأولى. الحصول على النقاط الزمنية اللاحقة من مرات القياس المسجلة بالبرنامج-
  7. بدء التشغيل، ورصد كوريلوجرام وتوزيع ملائمة، ومشورة الخبراء لتقييم جودة البيانات.
    ملاحظة: حزب النضال الديمقراطي الإندونيسي بالضرورة لن أقل من 0.3 لهذه القياسات كالعينة من المتوقع أن يكون بوليديسبيرسي أثناء التجميع.
    1. تأكد من أن معامل الارتباط هو ثابت وقريبة، ولكن ليس أكثر من 1 في وقت قصير، وتنخفض انخفاضا حادا في مرة واحدة أو أكثر بعد، المميزة لحجم الجسيمات.
    2. تأكد من تناسب التوزيع نقاط البيانات عن كثب وتتبع خط-
  8. تحليل البيانات حجم.
    1. تحديد وقت كل نقطة من الفارق الزمني بين كل قياس والنقطة الزمنية الأولية. قياس المدد الزمنية ليست كلها بالضبط نفس.
    2. تستخدم توزيع كثافة، سجل حجم القمم مع مجالات أكبر لكل نقطة القياس/الوقت-
    3. ارسم أقطار ذروتها في شمال البحر الأبيض المتوسط مقابل الوقت في الحد الأدنى

5. إعداد عينة تيم

  1. الحصول على الكربون الدعم السينمائي (النيكل) الشبكات المصممة لل-
    ملاحظة: استشارة مع مرفق الأساسية على الكواشف الموصى بها ومعالجة للاستخدام مع المجهر مرفق. تأكد من تخزين الشبكات في صندوق يحتوي على ديسيككانت أو فراغ غرفة لتقليل التعرض للرطوبة-
  2. المسيل للدموع حوالي 5 سم × 5 سم في قطعة من ورق الترشيح. الحصول على أطباق بيتري الزجاج وذاتية الإغلاق السليم عكس ملاقط المصممة للاستخدام في الفحص المجهري.
  3. قص حوالي 2.5 سم × 5 سم في قطعة من الفيلم البارافين. على benchtop.
    4. المعالجة بالحرارة من نوروفيروس سيدني GII.4 كابسيدس
    2. اتبع الإجراء المعالجة الحرارية بالضبط كما هو موضح أعلاه في خطوات 1.1.1-1-1-5 باستثناء: استخدام 10 ملم حبيس (درجة الحموضة 7.4) للعلاج بدلاً من برنامج تلفزيوني ولا تضعف كذلك كابسيدس وبعد العلاج (الحل يبقى في 50 ميكروغرام/مل). "الماصة؛" إسقاط كامل ~ 15 ميليلتر من محلول قفيصه المعالجة على الفيلم البارافين.
  4. الاستيلاء على حافة الشبكة مع ملاقط، السماح لهم بإغلاق على حافة عقد الشبكة، ووضع الشبكة الكربون الجانب-لأسفل على رأس قطره الحل المعالجة. اسمحوا احتضانها لمدة 10 دقيقة للسماح قفيصه تعلق على الشبكة-
    1. اعتماداً على نقاء إعداد قفيصه، إضافة يغسل الحل حبيس 10 ملم إذا لزم الأمر في شكل 10-15 ميليلتر قطرات وضعها في السطر بعد الحبرية المعالجة قفيصه.
    2. بعد 10 دقيقة، تلتقط الشبكة مع الحبرية. مكان الشبكة عمودي تقريبا على قطعة من ورق الترشيح الفتيل بعيداً الحبرية. التقاط الحبرية من 10-15 ميليلتر حبيس المخزن المؤقت مع الشبكة، وعقد ل 30 ثانية، ثم الفتيل بعيداً مع قطعة أخرى من الورق مرشح لواشنطن
  5. مكان معالجة تجميعية 15 ميليلتر من 2 ٪ خلات اليورانيل على الفيلم البارافين في منطقة فارغة.
    1. تلتقط الحبرية خلات اليورانيل مع الشبكة وعقد الفتيل س. 45 بعيداً خلات اليورانيل، يجري التأكد من إزالة معظم من الحل. ضع الجانب الكربون الشبكة حتى على قطعة من ورق الترشيح، مع الحرص على أن الشبكة لا " عصا " للرطوبة في الملقط. ضع ورق الترشيح مع الشبكة على أنها في زجاج مفتوحة طبق بيتري.
      ملاحظة: لا تستخدم البلاستيك بيتري الأطباق، كما الشبكات الكهربية الاستاتية جذبت إليها وتصبح عالقاً للطبق.
  6. تكرار لجميع العلاجات. ضع النصفين طبق بيتري مع الشبكات في مجفف بين عشية وضحاها لتجف قبل الاحتفال مع تيم-
  7. راجع المرفق مجهرية في المؤسسة المعنية فيما يتعلق بمراقبة الشبكات المعدة. بعض مرافق تسمح للمستخدم لتدريبهم على تشغيل مرفق بها ' s الصك. تفاصيل محددة بشأن الإعداد والمراقبة مجهر محددة بايوند نطاق هذه المادة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تقييم السلامة الهيكلية للبشرية نوروفيروس سيدني GII.4 كابسيدس (فلبس) باستخدام عدة أساليب الرواية كما قدمها مور et al. 17-أولاً، تم تجربة في التي كانت سلامة كابسيدس كدالة لقدرتها على ربط المفترضة مستقبلات/المشارك-فكتور (هبجا) أو ssDNA ابتمر (M6-2) مقارنة (الشكل 1). عرض النتائج ولقد قدمت سابقا مور et al. 17، وتثبت أن السلوك الملزمة ابتمر M6-2-قفيصه كانت مماثلة لتلك التي ملزمة هبجا الفيروس عند ا...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول والأساليب الموصوفة هنا يوفر وسيلة لتقييم نوروفيروس البشرية قفيصه السلامة/وظيفة. هذه الأساليب يمكن استخدامها للحصول على آليا إلى التبصر في آثار المعالجات المنظمة ضد الفيروس، ويمكن أن تكمل يحتمل أن تكون أساليب تقييم المنظمة أكثر تقليدية مثل المقايسة RT-قبكر أو اللوحة. على سبيل المثال، يوفر تقييم المنظمة الكيميائية أو الفيزيائية بمقايسة البلاك وحدها مقياسا لدرجة من المنظمة الفيروس ولكن لا الآلية الأساسية لهذه المنظمة. أيضا، يمكن أن يؤدي إلى التقليل عيار التجميع الفيروس ولذلك المبالغة في تقدير مدى فعالية العلاج

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل أيده بالزراعة والأغذية البحوث مبادرة تنافسية منحة رقم 2011-68003-30395 من وزارة الزراعة في الولايات المتحدة، والمعهد الوطني للأغذية والزراعة من خلال مشروع نوروكوري. تم توفير التمويل للوصول المفتوح المسؤول "وزارة الزراعة في الولايات المتحدة". ونود أن أشكر روبرت اتمار (كلية طب بايلور، هيوستن، تكساس) يرجى تزويدنا كابسيدس المنقي وفاليري أفام لمساعدتها مع الصور ال. ونود أيضا أن أشكر فرانك أ. باري لمساعدتنا على بدء التجارب التي عرضت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
< قوي > مقايسة ربط قائم على اللوحة لتقييم فقدان هيكل قفيصة نوروفيروس عالي الترتيب < / قوي
96 جيدا ، متوسط الارتباط من البوليسترين EIAصفيحة فيشر (كوستار)07-200-36
غطاء للوحة 96 بئرثيرمو فيشر3098
فيلم بارافين (بارافيلم)ثيرمو فيشرPM999
1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.2)Life Technologies20012-050
Polysorbate 20Sigma-AldrichP9416
1x PBS (درجة الحموضة 7.2) + 0.05٪ بولي سوربات 20N / AN /
قفيصة نوروفيروس البشرية GII.4 المنقاة والمجمعةN / AN /
أنابيب PCR فردية 0.2 ملGenesee Scientific22-154G
2 thermocyclersBio-Rad1861096
أجهزة الطرد المركزي الصغيرة المنضديةفيشر Scientific12-006-901
المواد الصلبة من الحليب الخالي من الدسمThermo FisherLP0031B
مجموعة الدم النسيجية الاصطناعية من النوع A ثنائي السكاريد ، البيوتينيلGlycotech01-017
البيوتينيل أبتامر M6-2 (تركيز المخزون 100 & micro; M في ماء خال من النوكلياز): 5'- / 5Biosg / AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3 'تقنيات الحمض النووي المتكاملةN / A
Streptavidin - الفجل بيروكسيداز المترافق (درجة ELISA) ، نحن نستخدم Life Technologies SNN2004Life TechnologiesSNN2004
3،3 '، 5،5'-tetramethylbenzidine (TMB) الركيزة ، درجة حرارة الغرفةThermo Fisher50-76-00
1 M حمض الفوسفوريكN / AN / A
قارئ Microplate قادرة على قراءة 450 نانومترTecanInfinite m200 Pro
NameCompanyCatalog NumberComments
تحليل نتائج الفحص المستندة إلى اللوحة
Microsoft Excel أو برنامج مشابهN / AN / A
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
Dynamic Scattering Experiments
Zetasizer ZSP، أو أداة تحليل حجم الجسيمات المماثلةMalvern InstrumentsN / A
Vortexفيشر ساينتيفك02-215-365
كوارتزهيلما104-002-10-40
كوفيت صغير الحجم يمكن التخلص منه (لتقليل استخدام VLP)Malvern InstrumentsZEN0040
NameCompanyCatalogComments
<قوي> الإرسال المجهري إلكتروني تحضير العينة< / قوي >
شبكات المجهر الإلكتروني من النيكل مع فيلم دعم الكربونLadd Research10880-100
ملاقط المجهرية الإلكترونية العكسية ذاتية الإغلاقتيد بيلا5372-NM
ورق ترشيح نوعيسيجما ألدريتش (واتمان)WHA1002055
زجاج أطباق بتريسيجما ألدريتشBR455743
100 ملي مولار محلول هيبس (درجة الحموضة 7.2)N / AN / A
2٪ أسيتات اليورانيلN / A N / AN / A
> A A كوفيت

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirk, M. D., et al. World Health Organization estimates of the global and regional disease burden of 11 foodborne bacterial, protozoal, and viral diseases, 2010: A data synthesis. PLOS Med. 12 (12), e1001920(2015).
  2. Scharff, R. L. Economic burden from health losses due to foodborne illness in the United States. J. Food Prot. 75 (1), 123-131 (2012).
  3. Lee, B. Y., Mcglone, S. M., Bailey, R. R., Zachary, S., Umscheid, C. A., Muder, R. R. Economic impact of outbreaks of norovirus infection in hospitals. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 32 (2), 191-193 (2011).
  4. Law, J. W. -F., Ab Mutalib, N. -S., Chan, K. -G., Lee, L. -H. Rapid methods for the detection of foodborne bacterial pathogens: principles, applications, advantages and limitations. Front. Microbiol. 5, 770(2015).
  5. Jones, M. K., et al. Enteric bacteria promote human and mouse norovirus infection of B cells. Science. 346 (6210), 755-759 (2014).
  6. Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell - derived human enteroids. Science. 5211, (2016).
  7. Moore, M. D., Goulter, R. M., Jaykus, L. -A. Human norovirus as a foodborne pathogen: challenges and developments. Annu. Rev. Food Sci. Technol. 6 (1), 411-433 (2015).
  8. Miura, T., et al. Histo-blood group antigen-like substances of human enteric bacteria as specific adsorbents for human noroviruses. J. Virol. 87 (17), 9441-9451 (2013).
  9. Almand, E. A., et al. Human norovirus binding to select bacteria representative of the human gut microbiota. Plos One. 12 (3), e0173124(2017).
  10. Rubio-del-Campo, A., et al. Noroviral P-Particles as an in vitro model to assess the interactions of noroviruses with probiotics. PLoS ONE. 9 (2), e89586(2014).
  11. Hirneisen, K. A., Kniel, K. E. Comparison of ELISA attachment and infectivity assays for murine norovirus. J. Virol. Methods. 186 (1-2), 14-20 (2012).
  12. Dancho, B. A., Chen, H., Kingsley, D. H. Discrimination between infectious and non-infectious human norovirus using porcine gastric mucin. Int. J. Food Microbiol. 155 (3), 222-226 (2012).
  13. Li, X., Chen, H. Evaluation of the porcine gastric mucin binding assay for high-pressure-inactivation studies using murine norovirus and Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 81 (2), 515-521 (2015).
  14. Lou, F., et al. High-pressure inactivation of human norovirus virus-like particles provides evidence that the capsid of human norovirus is highly pressure resistant. Appl. Environ. Microbiol. 78 (15), 5320-5327 (2012).
  15. Wang, D., Tian, P. Inactivation conditions for human norovirus measured by an in situ capture-qRT-PCR method. Int. J. Food Microbiol. 172, 76-82 (2014).
  16. Wang, D., Xu, S., Yang, D., Young, G. M., Tian, P. New in situ capture quantitative (real-time) reverse transcription-PCR method as an alternative approach for determining inactivation of Tulane virus. Appl. Environ. Microbiol. 80 (7), 2120-2124 (2014).
  17. Moore, M. D., Bobay, B. G., Mertens, B., Jaykus, L. Human norovirus aptamer exhibits high degree of target conformation-dependent binding similar to that of receptors and discriminates particle functionality. mSphere. 1 (6), e00298-e00216 (2016).
  18. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Jaykus, L. -A. Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain. J. Biotechnol. 209, 41-49 (2015).
  19. Kitamoto, N., et al. Cross-Reactivity among Several Recombinant Calicivirus Virus-Like Particles (VLPs) with Monoclonal Antibodies Obtained from Mice Immunized Orally with One Type of VLP. J. Clin. Microbiol. 40 (7), 2459-2465 (2002).
  20. Giamberardino, A., et al. Ultrasensitive norovirus detection using DNA aptasensor technology. PloS one. 8 (11), e79087(2013).
  21. Beier, R., et al. Selection of a DNA aptamer against norovirus capsid protein VP1. FEMS Microbiol. Lett. 351 (2), 162-169 (2014).
  22. Escudero-Abarca, B. I., Suh, S. H., Moore, M. D., Dwivedi, H. P., Jaykus, L. -A. Selection, characterization and application of nucleic acid aptamers for the capture and detection of human norovirus strains. PloS one. 9 (9), e106805(2014).
  23. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential - What they are and what they are not? Journal Control. Release. 235, 337-351 (2016).
  24. Khodabandehloo, A., Chen, D. D. Y. Particle sizing methods for the detection of protein aggregates in biopharmaceuticals. Bioanalysis. 9 (3), 313-326 (2017).
  25. Mattle, M. J., et al. Impact of virus aggregation on inactivation by peracetic acid and implications for other disinfectants. Environ. Sci. Technol. 45, 7710-7717 (2011).
  26. Samandoulgou, I., Fliss, I., Jean, J. Zeta potential and aggregation of virus-like particle of human norovirus and feline calicivirus under different physicochemical conditions. Food Environ. Virol. 7 (3), 249-260 (2015).
  27. Mertens, B. S., Velev, O. D. Soft matter norovirus interactions. Soft Matter. 11, 8621-8631 (2015).
  28. Panyukov, Y., Yudin, I., Drachev, V., Dobrov, E., Kurganov, B. The study of amorphous aggregation of tobacco mosaic virus coat protein by dynamic light scattering. Biophys. Chem. 127 (1-2), 9-18 (2007).
  29. Moore, M. D., Escudero-Abarca, B. I., Jaykus, L. -A. An Enzyme-Linked Aptamer Sorbent Assay to Evaluate Aptamer Binding. Methods in Molecular Biology. 1575, 291-302 (2017).
  30. Langlet, J., Gaboriaud, F., Gantzer, C. Effects of pH on plaque forming unit counts and aggregation of MS2 bacteriophage. J. Appl. Microbiol. 103, 1632-1638 (2007).
  31. Manuel, C. S., Moore, M. D., Jaykus, L. A. Destruction of the Capsid and Genome of GII.4 Human Norovirus Occurs during Exposure to Metal Alloys Containing Copper. Appl. Environ. Microbiol. 81 (15), 4940-4946 (2015).
  32. Warnes, S. L., Summersgill, E. N., Keevil, C. W. Inactivation of murine norovirus on a range of copper alloy surfaces is accompanied by loss of capsid integrity. Appl. Environ. Microbiol. , (2014).
  33. Manuel, C., Moore, M. D., Jaykus, L. -A. Efficacy of a disinfectant containing silver dihydrogen citrate against GI.6 and GII.4 human norovirus. J. Appl. Microbiol. 122 (1), 78-86 (2017).
  34. Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
  35. Kingsley, D. H., Vincent, E. M., Meade, G. K., Watson, C. L., Fan, X. Inactivation of human norovirus using chemical sanitizers. Int. J. Food Microbiol. 171, 94-99 (2014).
  36. Tian, P., Yang, D., Quigley, C., Chou, M., Jiang, X. Inactivation of the Tulane virus, a novel surrogate for the human norovirus. J. Food Prot. 76 (4), 712-718 (2013).
  37. Li, D., Baert, L., Van Coillie, E., Uyttendaele, M. Critical studies on binding-based RT-PCR detection of infectious noroviruses. J. Virol. Methods. 177 (2), 153-159 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human NorovirusViral CapsidLigand BindingDynamic Light ScatteringTransmission Electron MicroscopyAptamer BindingCapsid IntegrityHeat TreatmentVirus InactivationCapsid Aggregation

Related Articles