مقالة منهجية

باستخدام المقايسة دوت لتحليل هجرة أوراق الخلية

6.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56451

⸱

ديسمبر 5, 2017

1Laboratory of Cellular and Molecular Biology, National Cancer Institute, National Institutes of Health

في هذه المقالة

ملخص

الهجرة الخلية أمر ضروري لتطوير وصيانة الأنسجة وإصلاح، توموريجينيسيس، ويخضع لعوامل النمو والمستقطبات السيتوكينات. ويصف هذا البروتوكول المقايسة دوت، مقايسة هجرة ثنائية الأبعاد، وغير المقيد لتقييم النمط الظاهري المهاجرة من أوراق خلية المرفقة، متماسك استجابة لمنبهات ميكرونفيرونمينتال.

الملخص

على الرغم من أن الكائنات الحية معقدة تبدو ثابتة، أنسجتها تحت دوران مستمر. كما خلايا العمر، يموت، وهي الاستعاضة عن خلايا جديدة، الخلايا تتحرك داخل الأنسجة بطريقة مدبرة محكم. أثناء تطوير الورم، تشعر بالانزعاج هذا التوازن، وترك ورم خلايا ظهارة المنشأ لغزو المكروية المحلية، بالسفر إلى مواقع بعيدة، وتشكل في نهاية المطاف الأورام المنتشر في مواقع بعيدة. المقايسة دوت مقايسة هجرة غير مقيدة بسيطة، ثنائي الأبعاد، لتقييم صافي حركة أوراق الخلية إلى منطقة خالية من الخلية، وتحليل معلمات الهجرة الخلية باستخدام التصوير بمرور الزمن. وهنا يتضح المقايسة دوت استخدام الإنسان الغازية، ومستعمرة الرئة تشكيل خط خلية سرطان الثدي، MCF10CA1a، لتحليل استجابة للخلايا المهاجرة لعامل نمو البشرة (لو)، الذي يعرف بزيادة إمكانات خبيث لخلايا سرطان الثدي و لتغيير النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا.

المقدمة

فحوصات الهجرة تستخدم على نطاق واسع لتقييم الإمكانات الغازية والمنتشر لورم الخلايا في المختبر. الأكثر شيوعاً، يستخدم بالجرح أو المقايسة الصفر لتقييم هجرة أوراق الظهارية في خلية بمسح منطقة1،2،3. لإجراء فحص الصفر، يتم مطلي الخلايا إلى أحادي الطبقة و "الصفر" أو منطقة خالية من خلية تم إنشاؤه باستخدام تلميح ماصة. مقايسة الصفر من السهل إعداد مع الإمدادات المتاحة عادة زراعة الأنسجة، ويمكن أن يؤديها في لوحات متعددة جيدا، مما يسمح لتجهيز عينات متعددة. ومع ذلك، كما هو الصفر، الخلايا يتم إزالتها فعلياً من أحادي الطبقة وغالباً الخضوع لموت الخلايا. وعلاوة على ذلك، غالباً ما تلف المصفوفة خارج الخلية التي تعلق على اللوحة خلال عملية الخدش. وبالمثل، إدراج استخدام السليكون (مثل الدوائر عبدي4) أو من الاستنسل5،،من67 يمكن أن يؤدي إلى اضطراب الميكانيكي للخلايا وإزالة جزئية من البروتينات المصفوفة تستخدم لطلاء لوحات. وثمة عيب آخر من فحوصات رصد إقفال الجروح أو الخدوش هو دورتهم الوقت المحدود، كما يمكن فقط تحليل الهجرة الخلية حتى يتم إغلاق الصفر.

في إجراء المقايسة دوت، هي مطلي الخلايا كمستعمرة تعميم على لوحة مغلفة أو غير المصقول8. والأساس المنطقي لهذه الاستراتيجية والطلاء هو الحصول على أوراق الخلية مع حواف محددة، يمكن ترحيل أو غزو في المناطق المحيطة بها خالية من الخلية دون الإخلال الثقافة بإزالة خلايا أو إدراج. والهدف العام للمقايسة دوت مراقبة الهجرة صحائف خلية مقاسا بحافة التشرد أو القطر مستعمرة، فضلا عن القيام بتصوير مرور الزمن لتحليل النمط الظاهري المهاجرة من الخلايا في أعلى القرار الزمانية.

يمكن أن تتأثر الهجرة الخلية بالعديد من الإشارات ميكرونفيرونمينتال مثل المستقطبات، السيتوكينات، وعوامل النمو مثل مماثلة. لو هو عامل النمو التي تمارس إثارة البيولوجية عن طريق ربط لمستقبلات لها، لو مستقبلات9، ويزيد من السلوك الغازية والمنتشر من ورم الخلايا4،،من910. هنا، يتم استخدام المقايسة دوت لدراسة مماثلة وحفز الهجرة الخلية في مستعمرة الرئة بشرية الغازية، تشكيل الثدي سرطان الخلية خط (MCF10CA1a)8،،من1112.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-طلاء أطباق (1 يوم)

ملاحظة: تأكد من عدم ترك بصمات الأصابع أو الاوساخ على الجزء السفلي من اللوحة عند التعامل مع الأمر.

  1. ذوبان الجليد الماوس الكولاجين الرابع على الجليد، وتمييع مع 50 ملم HCl (pH 1.3) لإعداد 3 مل من 10 ميكروغرام/مل الكولاجين الحل الرابع.
    ملاحظة: سوف يعجل بالكولاجين عند 37 درجة مئوية. ولذلك من المهم أن تبقى الحل الكولاجين عند درجة حرارة منخفضة بينما ذوبان الجليد والعمل معها. تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة بإعداد مختبرين حجم مناسب وتخزينها في-80 درجة مئوية.
  2. إضافة 250 ميليلتر الكولاجين الرابع الحل لكل بئر من لوحات أسفل الزجاج 12-جيدا ووضعها في علبة بلاستيكية حجم مناسب، ومحكم الإغلاق. ضع منشفة ورقية رطبة أكثر وحول لوحات لتصنيع دائرة رطبة وإغلاق المربع. احتضان لوحات بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: فقط منطقة النمو يجب أن تكون مغلفة, أنها كافية لتغطي فقط بكشف الغطاء، الذي هو تعلق على الجزء السفلي من اللوحة، مع حل الكولاجين (انظر الشكل 1أ وب لتخطيطي للوحة).
  3. صباح اليوم التالي، شطف اللوحات مع منزوع ح2س مرتين لإزالة عدم استيعاب الكولاجين والمخزن المؤقت. توجيه الماء إلى حافة اللوحة جيدا، لا إلى الحافة التي شكلتها أسفل اللوحة وساترة (إذا كان هو بيبيتيد المياه في هذا المجال سوف دفقة). أيردري اللوحات في هود الاندفاق الصفحي. استخدام لوحات فورا أو تخزين عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام.
    ملاحظة: قد تتطلب خطوط الخلايا مختلفة مختلفة طلاء، مثل فيبرونيكتين أو الكولاجين أنا.

2-طلاء المقايسة دوت (اليوم 2)

  1. إعداد تعليق خلية
    1. لإعداد تعليق خلية، استخدم الخلايا التي قد نمت في طبق استنبات الأنسجة 60 ملم في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 5% إلى 80% التقاء
    2. شطف الخلايا مع دولبيكو خالية من الكالسيوم والمغنيزيوم الفوسفات مخزنة المالحة (دببس) مرة واحدة وإضافة 500 ميليلتر التربسين-يدتا (درجة حرارة الغرفة)، واحتضان الخلايا لمدة 3-5 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية، ونسبة 5% CO2، جو هوميديفيد.
    3. تعليق الخلايا المنفصلة في 4.5 مل الثقافة المتوسطة لوقف نشاط التربسين والتعويل 20 قاسمة ميليلتر من تعليق خلية في هيموسيتوميتير.
    4. بيليه الخلايا المتبقية في أنبوب مخروطي 15 مل بالطرد المركزي في 200 غ س لمدة 3 دقائق ونضح المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في المتوسط 3 × 106 خلايا/مل والثقافة.
      ملاحظة: لطلاء ركائز أخرى و/أو خطوط الخلايا، يجب إنشاء كثافة الخلية المثلى في سلسلة تمييع. ويوصي 3 × 106 خلية/مل كنقطة انطلاق.
  2. طلاء الخلايا
    1. مكان قطره 10 ميليلتر من تعليق خلية في مركز كل كشف الغطاء الكولاجين الرابع مغلفة بالزجاج 12-جيدا أسفل لوحة دون لمس أو خدش الطلاء (الشكل 1أ، ب). احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، جو هوميديفيد، للسماح للخلايا إرفاق. تحقق في مجهر مقلوب أن الخلايا موصولة.
      ملاحظة: هذا يمكن أفضل رؤية عند الحافة من الانخفاض، حيث يمكن ملاحظة تشكيل أحادي الطبقة (الشكل 1ج). إذا لزم الأمر، احتضان اللوحة يصل إلى حاء 3 يجب التأكد من أن نسبة الرطوبة في الحاضنة عالية بما يكفي كما القطرات يمكن أن تجف بسرعة. إذا لوحظ انخفاضا في حجم قطره أثناء هذه الخطوة، إضافة برنامج تلفزيوني للمسافات بين الآبار زيادة الرطوبة.
    2. غسل الآبار مع 1 مل من الثقافة المتوسطة مرتين لإزالة الخلايا غير مرفقة بلطف. أضف 1 مل الثقافة المتوسطة لكل بئر. تحقق في مجهر مقلوب أن الخلايا العائمة لا تبقى، إلا تغسل الآبار مرة أخرى. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2، جو هوميديفيد، للحصول على أوراق خلية محددة تحديداً جيدا.
      ملاحظة: من المحتمل إعادة إرفاق إلى اللوحة وتشكل مستعمرات الخلايا غير المرغوب فيها الخلايا العائمة.

3-تحفيز الخلايا (اليوم الثالث)

  1. التحقق من جميع الآبار باستخدام مجهر معكوس للتأكد من أن الخلية المستعمرات قد نمت بشكل صحيح. إذا لزم الأمر، وضع علامة على الآبار غير مناسب ولا يستخدمونها.
  2. قم بتسمية كل من لوحة على نحو ملائم لكل شرط التحقيق جيدا. قم بتشغيل كل شرط في تكرار أو ثلاث نسخ.
  3. تغيير على المديين المتوسط وتجويع الخلايا في DMEM/F12 المحتوية على مصل الحصان 0.1% (متوسط يتضورون جوعاً) ح 3 قبل أن يتم تحفيز الخلايا.
  4. حفز الخلايا بالإضافة لمماثلة (تركيز النهائي 5 نانوغرام/مل) أو الوسطاء الآخرين المطلوب وتخلط بلطف المتوسطة استخدام ميكروبيبيتور 1 مل أو بواسطة يحوم اللوحة.
  5. احتضان بلايت 1-4 أيام لمراقبة حافة التشرد وكفاف الحافة كما هو موضح في القسم 4.1 أو إجراء تصوير مرور الزمن كما هو موضح في الجزء 4-2.

4-التصور مستعمرات الخلايا والهجرة الخلية

  1. الهيماتوكسيلين-ويوزين (أنه) تلطيخ لقياس نمو مستعمرة (يوم 4-7)
    1. إصلاح الخلايا في الإيثانول 70% (1 مل/جيد) ~ 2 دقيقة.
    2. وصمة عار الأنوية مع الهيماتوكسيلين (1 مل/جيد)، ~ 2 دقيقة.
    3. خلايا أغسل بماء الصنبور (1 مل/جيد) حتى الأنوية الأزرق، 5-10 دقيقة.
    4. السيتوبلازم وصمة عار مع ويوزين (1 مل/جيد)، ~ 2 دقيقة.
    5. شطف بالمياه (1 مل/جيد).
      ملاحظة: يمكن جمع حلول الهيماتوكسيلين ويوزين واستخدامه عدة مرات إلى تلطيخ تصبح باهتة.
    6. لوحة أيردري.
    7. الوجه اللوحة وقياس قطر دوت مع مسطرة. وبدلاً من ذلك، التقاط صور اللوحة مع كاميرا، وتحليل قطر دوت في إيماجيج.
  2. الوقت الفاصل بين الفحص المجهري (3 اليوم)
    1. التبديل في المجهر حاضنة وضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية. ملء المرطب مع dH2ضبط O. CO2 إلى 5%. تأكد من أن الدائرة الحاضنة هو هوميديفيد وأن المرحلة الآلية التي يمكن أن تتحرك بحرية. إغلاق الدائرة الحاضنة والسماح بالمجهر لضبط إلى 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: استخدام المجهر (انظر الجدول للمواد) هنا يجب تسخينها إلى 37 درجة مئوية على الأقل 3 ح قبل الخلايا يتم تصويرها لتجنب الانجراف من التركيز.
    2. ضع اللوحة في مرحلة المجهر حاضنة وقم بإعداد قائمة بالمرحلة. حواف الصورة المتعارضة اثنين ومركز كل خلية نقطة (الشكل 1أ).
    3. التقاط صور كل 3 دقائق، ح 15-24 باستخدام هدف X 10. تنزيل البيانات والمضي قدما في تحليل الصورة في برنامج للاختيار، مثلاً، إيماجيج أو مطلب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم إجراء المقايسة دوت المعروضة هنا (الشكل 1) باستخدام الغازية، مستعمرة الرئة تشكيل خلايا سرطان الثدي (MCF10CA1a) كنظام نموذجي. المقايسة دوت غلة النقاط خلية استنساخه بشدة حتى في اليد للمبتدئين، يجعلها مريحة وسهلة لتنفيذ المقايسة (الشكل 1د). المقايسة دوت جنبا إلى جنب مع أنه يلطخ، أو الوقت الفاصل بين التصوير والجسيمات اللاحقة صورة فيلوسيميتري (PIV) يسمح لدراسة مختلف البارامترات الهجرة بما في ذلك التشرد حواف الظهارية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أثناء تطور الخلايا السرطانية يهاجر بعيداً عن الأنسجة الأصلية غزو الأنسجة المحيطة والسرطاني إلى مواقع بعيدة15. ويمكن ملاحظة هجرة خلايا بعيداً عن مستعمرة خلية في المقايسة دوت. ويتجلى المقايسة دوت هنا، تحليل النمط الظاهري المهاجرة من خلايا سرطان الثدي البشرية استجابة لمماثلة.

للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار في العديد من الخطوات في إنشاء النقطة فحوصات الحاسمة. أولاً، تحدد طلاء اللوحة إذا وكيف الخلايا قوية يمكن أن تنضم إلى اللوحة وكان ترحيل الخلايا. ينبغي الحرص أن طلاء...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

شكر وتقدير

المؤلف يود أن يشكر بهاجاوات سوبرامانيان، تشانغ يي (جايسون)، بول Randazzo، والأصل كارول للقراءة والتعليق على هذه المخطوطة. هذا العمل كان يدعمها برنامج البحوث الداخلية للمعهد الوطني للسرطان، "المعاهد الوطنية للصحة".

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا MCF10CA1aأبحاث كارمانوسالخلايا N / Aالمستخدمة لفحص
كولاجين الفأر IVBD Biosciences354233تستخدم لطلاء الألواح
التربسين / EDTAThermo Fisher25300054تستخدم لإزالة الخلايا من ألواح زراعة الأنسجة
DPBS & nbsp ؛تستخدم Mediatech21-031-CVلغسل الخلايا
DMEM / F12Thermo Fisher11320082كمصل
متوسط للخيولتستخدم 26050088 Thermo Fisherلتكملة متوسط الثقافة
12 بئر صفيحة سفلية زجاجيةMatTekP12G-1.5-14-Fتستخدم لزراعة الخلايا لتصوير
EGF (عامل نمو البشرة ، المؤتلف البشري)PeprotechAF-100-15تستخدم لتحفيز الخلايا
خالية من الأحماض الدهنية BSASigmaA8806-1Gالمستخدمة لعمل مخزن مؤقت ل EGF
hematoxylinSigmaHHS32المستخدمة في تلطيخ المستعمرات
اليوزينعلوم المجهر الإلكتروني26051-10المستخدمة في تلطيخ المستعمرات
37 & # 176; ج ، 5٪ CO2< / sub> حاضنةSanyoنموذج MCO-18AIC (UV)
Zeiss AxioObserver مع غرفة حاضنة ومرحلة آليةنموذج ZeissAxio Observer.Z1المستخدمة لتصوير الفاصل الزمني
ORCA Flash LT كاميرا sCMOSBioVisionC11440-42U-KITالمستخدمة للتصوير بفاصل زمني بالاشتراك مع Zeiss AxioObserver
MetamorphBioVisionMMACQMICالبرنامج المستخدم للتصوير بفاصل زمني
المجهر المقلوبأوليمبوسنموذج IX70يستخدم لحساب الخلايا وفحص المستعمرات في صندوق بلاستيكي لزراعة
الأنسجة Lock& قفلN / Aيستخدم كغرفة رطبة (يمكن استخدام أي صندوق بلاستيكي محكم الإغلاق يناسب الألواح)
معهد

المراجع

  1. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).
  2. Peplow, P. V., Chatterjee, M. P. A review of the influence of growth factors and cytokines in in vitro human keratinocyte migration. Cytokine. 62 (1), 1-21 (2013).
  3. Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
  4. Weiger, M. C., Vedham, V., et al. Real-time motion analysis reveals cell directionality as an indicator of breast cancer progression. PLOS ONE. 8 (3), 58859(2013).
  5. Poujade, M., Grasland-Mongrain, E., et al. Collective migration of an epithelial monolayer in response to a model wound. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (41), 15988-15993 (2007).
  6. Sunyer, R., Conte, V., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  7. Bazellières, E., Conte, V., et al. Control of cell-cell forces and collective cell dynamics by the intercellular adhesome. Nat Cell Biol. 17 (4), 409-420 (2015).
  8. Stuelten, C. H., Busch, J. I., et al. Transient tumor-fibroblast interactions increase tumor cell malignancy by a TGF-Beta mediated mechanism in a mouse xenograft model of breast cancer. PLOS ONE. 5 (3), 9832(2010).
  9. Normanno, N., De Luca, A., et al. Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer. Gene. 366 (1), 2-16 (2006).
  10. Harrison, S. M. W., Knifley, T., Chen, M., O'Connor, K. L., HGF, LPA, HGF, and EGF utilize distinct combinations of signaling pathways to promote migration and invasion of MDA-MB-231 breast carcinoma cells. BMC Cancer. 13, 501(2013).
  11. Santner, S. J., Dawson, P. J., et al. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Research and Treatment. 65 (2), 101-110 (2001).
  12. Tang, B., Vu, M., et al. TGF-beta switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J Clin Invest. 112 (7), 1116-1124 (2003).
  13. Lee, R. M., Stuelten, C. H., Parent, C. A., Losert, W. Collective cell migration over long time scales reveals distinct phenotypes. Convergent science physical oncology. 2 (2), 025001(2016).
  14. Lee, R. M., Kelley, D. H., Nordstrom, K. N., Ouellette, N. T., Losert, W. Quantifying stretching and rearrangement in epithelial sheet migration. New J Phys. 15 (2), (2013).
  15. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  16. Grada, A., Otero-Vinas, M., Prieto-Castrillo, F., Obagi, Z., Falanga, V. Research techniques made simple: analysis of collective cell migration using the wound healing assay. J Invest Dermatol. 137 (2), 11-16 (2017).
  17. Rosen, P., Misfeldt, D. S. Cell density determines epithelial migration in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4760-4763 (1980).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EGF H and E 4 MCF10CA1a

مقالات ذات صلة