مقالة منهجية

نموذج تروفوبلست بشرية الأولية لدراسة تأثير التهاب المرتبطة بالسمنة الأمهات على تنظيم أوتوفاجي في المشيمة

DOI:

10.3791/56484

⸱

سبتمبر 27, 2017

 ,  , 
1Knight Cardiovascular Institute, Oregon Health and Science University, 2Department of Obstetrics and Gynecology, Oregon Health and Science University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدم هنا بروتوكول لأخذ عينات أنسجة فيلوس المشيمة البشرية متبوعاً بعزل سيتوتروفوبلاستس لثقافة الخلية الأولية. معاملة trophoblasts مع TNFα يجمل التهاب في البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة، ويسهل اكتشاف أهداف جزيئية ينظمها التهاب في المشيمة مع السمنة الأمهات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بدانة الأمهات يرتبط بزيادة خطر الإصابة بنتائج الفترة المحيطة بالولادة الضارة التي يرجح أن لعبت دور الوسيط فيها وظيفة المشيمية الخطر الذي يمكن أن يعزى إلى، في جزء منه، التقلبات أوتوفاجي. التغيرات الشاذة في التعبير عن أوتوفاجي المنظمين في المشيمة من الحمل يعانون من السمنة المفرطة قد ينظمها التحريضية العمليات المرتبطة بالسمنة والحمل. الموصوفة هنا بروتوكول لأخذ عينات أنسجة فيلوس وعزله فيلوس سيتوتروفوبلاستس من المشيمة البشرية مصطلح لثقافة الخلية الأولية. ويعقب ذلك طريقة لمحاكاة الوسط التحريضية في البيئة داخل الرحم السمنة بعلاج تروفوبلاستس الأولى من الحمل الهزيل مع سيتوكين proinflammatory التي هي مرتفعة في السمنة وعامل نخر الورم ألفا (TNFα)، الحمل. من خلال تنفيذ البروتوكول الموصوفة هنا، تبين أن التعرض للخارجية TNFα ينظم التعبير عن خطوة جريئة، منظم سلبية من أوتوفاجي، في تروفوبلاستس من الحمل الهزيل مع الأجنة الإناث. بينما تحتفظ مجموعة متنوعة من العوامل البيولوجية في البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة يمكن أن تعدل المسارات الحرجة في تروفوبلاستس، هذا النظام السابقين فيفو مفيدة بشكل خاص لتحديد إذا كان التعبير أنماط الملحوظ في فيفو في المشيمة البشرية مع الأمهات السمنة نتيجة مباشرة للإشارات TNFα. وفي نهاية المطاف، هذا النهج يتيح الفرصة لتحليل النتائج المترتبة على التنظيمية والجزيئية لالتهاب المرتبطة بالسمنة الأمهات أوتوفاجي وأخرى مسارات الخلوية حاسمة في تروفوبلاستس التي لها القدرة على التأثير وظيفة المشيمة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

السمنة حالة التهاب تتميز بالتهاب مزمن منخفض التخصيب، النابعة من الأنسجة الدهنية الزائدة وتوافر المغذيات. في السمنة، السيتوكينات proinflammatory مرتفعة في الأنسجة الأيضية وكذلك عناصره في الدورة الدموية. وقد أظهرت مجموعة قوية من الأدلة أن TNFα إلى حد كبير مرتفعة في الإعداد للسمنة مع الآثار في مقاومة الأنسولين والخلل الأيضي1. كما يساهم تنشيط TNFα إمراضية المرض في ظروف مثل السرطان والمناعة الذاتية، مما يجعل هدف علاجي جذاباً2.

ويتفاقم التهاب في السمنة قبل الحمل، وأيضا proinflammatory دولة3،4. لقد ثبت سابقا أن المشيمة TNFα المحتوى يزيد مع أديبوسيتي الأم في الحمل مع الأجنة الإناث. وعلاوة على ذلك، يمنع العلاج TNFα التنفس المتقدرية في الخلايا تروفوبلست الإناث ولكن ليس من الذكور، مما يوحي بأن TNFα تشارك في تنظيم الأيض المشيمية في ديمبرافيك جنسياً نحو5. بدانة الأمهات يرتبط بازدياد نسبة الإصابة بمجموعة متنوعة من مضاعفات أثناء الحمل، بما في ذلك حالات الاملاص، مع الأجنة الذكور يجري الأكثر عرضه3،،من67،8 . بسبب دورها الرئيسي في الواجهة الأم الجنين، التغيرات في القدرة الوظيفية للمشيمة في البيئة داخل الرحم السمنة استجابة لإشارات تحريضية قد تلعب دوراً مهما في التوسط لنتائج الحمل يعانون من السمنة المفرطة.

سيتوتروفوبلاستس وسينسيتيوتروفوبلاستس في الأنسجة فيلوس المشيمة حاسمة بالنسبة لإشارات الغدد الصماء وتبادل المغذيات والأكسجين بين الأم و الجنين النامي9. اضطرابات في القدرة الوظيفية في فيلوس سيتوتروفوبلاستس (يشار إليه فيما يلي trophoblasts) قد تعرض للخطر صحة الجنين والتنمية. يصف هذا البروتوكول وسيلة لأخذ عينات أنسجة فيلوس من المشيمة البشرية مصطلح بتشريح بعيداً من لوحات المشيمة والقاعدية جنبا إلى جنب مع إجراء أمثل لعزل تروفوبلاستس لثقافة الخلية الابتدائية. يتم اشتقاق هذا البروتوكول من المنهجيات المحددة التي تنطوي على الهضم الأنزيمي فيلوس الأنسجة لتحرير الخلايا في المصفوفة خارج الخلية متبوعاً بالطرد المركزي كثافة التفاضلية لعزل تروفوبلاستس10، 11،12. تفاصيل البروتوكول هذا نهج الذي تعامل trophoblasts الأولية من مشيمة من الحمل الهزيل مع وسائط الثقافة تستكمل مع TNFα محاكاة عنصر واحد من الوسط التحريضية المرتبطة بالسمنة الأمهات. وأخيراً، يرد وصف إجراءات بسيطة لحصاد ليساتيس خلية الإجمالي من تعامل TNFα trophoblasts تليها الغربية النشاف للكشف عن التغييرات في التعبير الجيني.

حين الخص هذا النموذج لا أوبيسوجينيك البيئة في الرحم في مجملها، يوفر نظام الخاضعة للرقابة أن يسمح أحد لتحليل خارج مساهمة فردية من التهاب بوساطة TNFα trophoblasts ' وردا على بدانة الأمهات. هذا النموذج يتيح الفرصة لاكتشاف أو تأكيد الأهداف الجزيئية التي تنظم مباشرة مما يشير إلى TNFα في تروفوبلاستس على حد سواء، فضلا عن يسمح أحد لاختبار ما إذا كانت التغيرات في أنماط التعبير الجيني لوحظت في فيفو في مشيمة مع الأمهات السمنة قد تكون نتيجة لالتهاب بوساطة TNFα.

تم تنفيذ النهج المذكور هنا لاختبار أثر وساطة TNFα التهاب على تنظيم أوتوفاجي في تروفوبلاستس البشرية. تروفوبلاستس من الحمل السمنة مع معرض الأجنة الذكور تعطل دوران أوتوفاجيك، أو أوتوفاجوسومي نضوج13. بروتين يسمى خطوة جريئة (تشغيل المجال البروتين التفاعل Beclin1 والغنية سيستين يحتوي على)، الذي هو مترجم إلى ليسوسوميس واندوسوميس الراحل، ومؤخرا وصفت بأنها "فرامل" في عملية دوران أوتوفاجيك لأنه يعمل كصورة سلبية منظم أوتوفاجوسومي نضوج14،15. في الواقع، هو خطوة جريئة مثال نادرة من البروتين الذي يقيد أوتوفاجي، مما يجعلها هدفا قيماً علاجية. يتوفر سوى القليل من المعلومات حول أهمية الفيزيولوجية المرضية لخطوة جريئة، باستثناء دورها في الاستجابة المناعية الفطرية للميكروبات16،17 وكارديوميوسيتي حماية18. باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا، أنها وجدت أن خطوة جريئة من أوبريجولاتيد في تروفوبلاستس الابتدائي الإناث في الاستجابة للعلاج مع زيادة تركيزات TNFα ما يصل إلى 250 بيكوغرام/مل. تنظيم خطوة جريئة قد تلعب دوراً في كيفية تشويه الأجنة أجرة أفضل من الذكور في حالات الحمل مع السمنة الأمهات. أتصدى التهاب المرتبطة بالسمنة الأمهات السابقين فيفو بتعريض البشرية تروفوبلاستس إلى TNFα خارجية توفر منبرا لدراسة أثر البيئة داخل الرحم يعانون من السمنة المفرطة بشأن تنظيم المسارات الحرجة في trophoblasts واستطراداً، وظيفة المشيمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مترافق جمعت من وحدة تسليم مستشفى الجامعة والعمل تحت بروتوكول أقرته المؤسسية استعراض المجلس لولاية أوريغون للصحة والعلوم في جامعة في بورتلاند، أوريغون، مع الموافقة المستنيرة من المرضى.

1-"جمع الأنسجة المشيمية"

  1. إعداد
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع المعدات التي واجه الأنسجة عقيمة.
    1. تعقيم المعدات تشريح بالتعقيم لمدة 60 دقيقة في 121 درجة مئوية.
    2. استخدام معدات الوقاية الشخصية (معدات الوقاية الشخصية): مختبر يدعك/المعاطف/العباءات وقفازات وقناع مع درع وجه أو نظارات.
    3. بدوره في حوض ماء ومجموعة إلى 37 درجة مئوية.
    4. الحارة اثنين 50 مل الأنابيب المخروطية، كل 25 مل تحتوي على وسائط كاملة (Iscove ' s دولبيكو التعديل ' المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS و 1% s البنسلين/ستربتوميسين، الجدول 3) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    5. مع موافقة المريض مستنيرة، الحصول على المشيمة الفور بعد الولادة بالعملية القيصرية.
    6. أصبحت مألوفة مع المشيمة. يتم إدراج الحبل السري على الجانب الجنين (لوحة المشيمة) ويمكن رؤية الأوعية الدموية يشع خارجاً من موقع الإدراج الحبل السري. الجانب الآخر هو جانب الأمهات، أو لوحة القاعدية. وتتضمن أوروبية والهياكل التي تحتوي على أشجار السفينة، ودعا كوتيليدونس-
  2. أخذ عينات الأنسجة فيلوس
    ملاحظة: ينبغي أخذ عينات الأنسجة فيلوس من المشيمة بعد التسليم، يفضل أن تكون في 30 دقيقة أو أقل وقت ممكن.
    1. مع لوحة المشيمة التي تواجه صعودا، الرسوم 2-3 كامل-سمك المقاطع (حوالي 2.5 سم × 2.5 سم في الحجم) 2-3 سم من محيط المشيمة في عشوائية، باستخدام الملقط، والمقص ( الشكل 1A).
      ملاحظة: تجنب أجزاء من المشيمة التي تبدو غير طبيعية (أي أبيض تكلسات)-
    2. تقليم بعيداً لوحات المشيمة والقاعدية والأوعية الدموية الكبيرة أي.
    3. مكان الأنسجة فيلوس الناتجة عن ذلك ( الشكل 1B، حوالي 80-120 غ المجموع) في وسائل الإعلام كاملة الحارة وتبدأ العزلة تروفوبلست داخل 30 دقيقة لأخذ العينات-
      ملاحظة: بعض الاختبارات النهائية والتطبيقات تتأثر بطول فترة الكمون بين التسليم وأخذ العينات، وعزل تروفوبلست. فمن الأفضل إبقاء هذه الفترات قصيرة كما ممكناً ومتسقا بين العزلة.
    4. باستخدام التقنيات الموضحة في الخطوات 1.2.1-1.2.2، عينة 5 أقسام عشوائية 1 × 1 سم من نسيج فيلوس عبر المشيمة (بما في ذلك المركز)-
    5. قص كل عينة الأنسجة فيلوس 1 سم × 1 سم إلى 4-5 قطع أصغر (حوالي 30 ملغ كل)، وضع في أنابيب ميكروسينتريفوجي 2 مل، وفلاش تجميد في سائل ن 2. مخزن في-80 درجة مئوية لاستخدامها في تحليل لاحق.

2. عزل تروفوبلاستس من "الأنسجة فيلوس"

  1. إعداد
    ملاحظة: استخدام معدات معقمة وتنفيذ الإجراءات التي تنطوي على خلايا في غطاء الاندفاق الصفحي. التدرجات كثافة المجمدة أربع
    1. ذوبان الجليد (الجدول 1، انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) في 4 درجات مئوية في الليلة التي سبقت وصول المشيمة.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، كثافة التدرجات يمكن إجراء اليوم من العزلة.
    2. بدوره على أجهزة الطرد المركزي ومجموعة إلى 20 درجة مئوية.
      ملاحظة: جميع الخطوات الطرد المركزي في أقصى تسارع وتباطؤ، ما لم يحدد خلاف ذلك-
    3. تحضير 1 × مخزنة حبيس الملح الحل (حبس) تستكمل مع Ca + 2 و Mg + 2 (الجدول 3)-
    4. التربسين الحارة إلى 37 درجة مئوية.
    5. "الدناز تمييع" لحوالي 2720 كيلونيتس/مل في العقيمة تستكمل حبس.
    6. دافئ 50 مل من مصل العجل الوليد (NCS) إلى 37 درجة مئوية.
    7. الحارة وسائط كاملة إلى 37 درجة مئوية.
    8. الحارة تجميد وسائل الإعلام (90% FBS، 10% [دمس]، الجدول 3) إلى 37 درجة مئوية.
      تنبيه: [دمس] سامة ويجب أن تعالج مع القفازات.
    9. الهضم إعداد المخزن المؤقت (الجدول 2 و 3) بخلط مل 308 من استكمال حبس، 50 مل التربسين (3751.7 بيي وحدة/مل)، و 0.5 مل الدناز (379.4 كيلونيتس/mL) في زجاجة معقمة.
      ملاحظة: هو الوقت التقريبي المطلوب لعزل الخلايا من الأنسجة فيلوس 7 h.
  2. تجهيز "الأنسجة فيلوس"
    1. شطف كل قطعة من الأنسجة فيلوس في أنبوب 50 مل مخروطية مليئة بالفوسفات درجة حرارة الغرفة مخزنة المالحة (PBS). كرر ويحل محل برنامج تلفزيوني كاللازمة حتى تتم إزالة الدم الزائد (شطف برنامج تلفزيوني سيكون الضوء الأحمر أو الوردي عندما الأنسجة هي تشطف جيدا)-
    2. مكان الأنسجة فيلوس في طبق بتري معقم وإزالة العديد من الأوعية الدموية ممكن بلطف كشط قبالة فيلوس الأنسجة اللينة من السفن باستخدام شريحة مجهر.
    3. فرم ناعما الأنسجة فيلوس الناتجة باستخدام مقص.
  3. فيلوس الأنسجة الهضم وعزل النفط الخام من تروفوبلاستس
    1. بنقل الأنسجة فيلوس مفروم إلى زجاجة معقمة مع الحل الهضم وفقا لوحدات التخزين محسوب استناداً إلى نشاط معين من التربسين والدناز (165 مل، الجدول 2).
      2. إمالة الزجاجة الهضم على جانبها
    2. بعد 35 دقيقة من الحضانة في حمام مائي 37 درجة مئوية مع الهز في ثورات 70 في الدقيقة (لفة في الدقيقة)، والسماح للقطع عسر الهضم من الأنسجة تسوية في الجزء السفلي من الزجاجة. رسم بعناية حتى المادة طافية مع ماصة مصلية، تجنب الأنسجة المستقرين.
    3. الاستغناء عن المادة طافية من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر التساوي بين أنابيب مخروطية 50 مل.
      ملاحظة: توفيرا للوقت، من المستحسن أن تبدأ الثانية تسوى الهضم عن طريق إضافة الحل الهضم (110 مل، الجدول 2) إلى بقية الأنسجة واستئناف الحضانة كما هو موضح في الخطوة 2.3.2.
    4. بلطف طبقة 3-5 مل من سي إس تحت المادة طافية المتوترة بصرفها ببطء من ماصة مصلية في الجزء السفلي من الأنبوب. ينبغي أن يكون غضروف بين المادة طافية المتوترة (التي تحتوي على تروفوبلاستس) والنيجيرية مرئية ( الشكل 2A).
    5. الطرد في supernatants المركزي على سي إس في غ س 1,250 لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية. وستشمل بيليه الناتجة عن خلايا الدم الحمراء في الطبقة السفلي-معظم تليها طبقة بيضاء تحتوي على خلايا تروفوبلست ( الشكل 2)-
    6. كرر الخطوات 2.3.2-2.3.5 لكل من ديجيسشنز الثانية والثالثة (إضافة 110 مل و 83.5 م، على التوالي، حل الهضم لزجاجة الأنسجة، الجدول 2).
    7. مرة واحدة قد تم طرد جميع سوبيرناتانتس، ريسوسبيند كل بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام كاملة دافئة، وثم تجميع أن الإيقاف.
    8. تقسيم تعليق خلية التساوي بين اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 1,250 س ز لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية.
    9. إزالة المادة طافية بلطف وريسوسبيند كل من الكريات خلية في 6 مل كومبل الحارةوسائط ات-
  4. كثافة استخدام الطرد المركزي
    1. تقسيم تعليق خلية التساوي بين أربعة كثافة التدرجات (3 مل في كل) ببطء وعناية طبقات تعليق خلية أعلى كثافة التدرجات مع بيبيت نقل-
    2. الطرد المركزي التدرجات الكثافة في 1,250 س ز لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية مع الحد الأدنى من التسارع والتباطؤ. وهذا ينبغي أن تنتج نطاقات مميزة من الخلايا رسابة (الجدول 4).
    3. ببطء وبعناية إزالة الطبقات العليا من كثافة وسائل الإعلام التدرج (محكمة أمن الدولة) حتى يتم التوصل إلى band(s) غير شفاف يحتوي على خلايا تروفوبلست (بين 35-50% DGM) (الجدول 4).
    4. تحويل العصابات تروفوبلست إلى اثنين من أنابيب مخروطية 50 مل وملء مع وسائل الإعلام كاملة دافئة.
    5. برفق عكس أنابيب 3-6 مرات لخلط والطرد المركزي في 1,250 س ز لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية.
      6. إزالة المادة طافية
    6. وريسوسبيند كل خلية بيليه في 5 مل من وسائل الإعلام كاملة دافئة. الجمع بين تعليق خلية، وحساب عدد الخلايا قابلة للتطبيق باستخدام هيموسيتوميتير وتريبان الأزرق (أو خلية المفضل عد الأسلوب).
  5. عد الخلايا مع هيموسيتوميتير
    1. مزيج تعليق خلية بيبيتينج صعودا وهبوطاً مع بيبيت مصلية أو برفق عكس الأنبوبة عدة مرات.
    2. الجمع بين أجزاء متساوية من تعليق خلية وتريبان الأزرق (أي 20 ميليلتر كل) في أنبوب منفصل وتخلط بلطف.
    3. إينكوباتي لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
    4. برفق الاستغناء عن 15-20 ميليلتر من الخلية-تريبان الأزرق خليط ما بين ساترة وهيموسيتوميتير وتسمح للخلايا لنشرها عبر الشبكة بعمل شعري.
    5. عد خلايا قابلة للحياة (وسوف تكون الخلايا الميتة الملون أزرق) في كل من الأرباع الأربعة 4 × 4 مع عداد تالي. تستخدم نظاما للعد لضمان لا يتم حساب الخلايا أكثر من مرة (أي لا عد الخلايا التي تعمل باللمس أو الحدود اليسرى السفلي).
      ملاحظة: يجب أن تحتوي على كل رباعي 4 × 4 بين 50-150 الخلايا. خلايا كثيرة جداً أو قليلة جداً يمكن أن يؤدي إلى التقليل من عدد الخلايا أو أكثر.
    6. ضرب متوسط الخلية إجمالي التهم من كل من الأرباع 4 × 4، 10 4، ومن ثم قم بضرب معامل التخفيف (تعليق خلية تريبان الأزرق) لحساب عدد الخلايا كل مل.
    7. تضاعف عدد الخلايا كل مل بالحجم الإجمالي لتعليق خلية لحساب العائد خلية الإجمالي-
      ملاحظة: من المتوقع حوالي 100 مليون الخلايا من العزلة بدءاً من 80-120 غ أنسجة فيلوس.
  6. الخلايا تصفيح
    1. لوحة 3 مليون خلايا/البئر (3.3 × 10 5 خلايا كل سم 2) في لوحة 6-جيدا (2 مل تعليق كل بئر) ولطف الصخور ذهابا وإيابا وجنبا إلى جانب لتوزيعها بالتساوي الخلايا.
      ملاحظة: تتطلب Trophoblasts لوحات زراعة الأنسجة المعالجة إلى التقيد بشكل صحيح. مطلوب أحادي الطبقة خلايا لتعزيز سينسيتياليزيشن.
    2. ترك الخلايا مطلي في هود الاندفاق الصفحي لحوالي 30 دقيقة السماح بتوزيع بالتساوي، وتسوية، والبدء في الانضمام إلى الجزء السفلي من الآبار قبل وضع في الحاضنة الخلايا.
    3. خلايا الثقافة لتصل إلى 72 ح (مع التغيرات اليومية في وسائل الإعلام) في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO 2 و 95% رطوبة.
      ملاحظة: دراسة تروفوبلاستس تحت مجهر في 10-20 x كل 24 ساعة للثقافة. تتكاثر لا تروفوبلاستس ولا باساجيد. خلال 72 ساعة من الثقافة، الصمامات trophoblasts الفردية جولة لتشكيل سينسيتيوم ( الشكل 3 ألف وباء).
  7. تجميد خلايا
    1. بيليه الخلايا غير المستخدمة بالطرد المركزي في 1,250 س ز لمدة 10 دقائق في 20 درجة مئوية.
    2. نضح وسائل الإعلام قدر ممكن من بيليه.
    3. بيليه في تجميد وسائل الإعلام (الجدول 3) ريسوسبيند-
    4. تجميد مختبرين في-80 درجة مئوية في تجميد حاوية مليئة بالكحول 100%. نقل مختبرين المجمدة للسائل ن 2 وفي اليوم التالي للتخزين على المدى الطويل.
      ملاحظة: يمكن استزراع الخلايا بعد تجميد.
  8. ذوبان الخلايا
    1. إزالة قاسمة الخلايا المجمدة وذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية بينما يحوم. إزالة قاسمة من حمام الماء فقط قبل قد إذابة تماما لسائل-
    2. نقل الخلايا المذابة فورا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. بدأ يتباطأ في البداية، أضف 10 مل وسائط كاملة مع خلط متقطعة.
    3. قلب الأنبوبة عدة مرات لخلط-
    4. أجهزة الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 10 دقائق في 20 درجة مئوية.
    5. نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 2-5 مل من وسائل الإعلام كاملة دافئة.
    6. عد الخلايا ولوحة كما تم وصفه سابقا-

3. علاج Trophoblasts الأولية مع TNFα ومجموعة من الخلايا ليساتيس، والغربية النشاف

  1. إعداد
    1. الحارة وسائط كاملة إلى 37 درجة مئوية.
    2. جعل رصيد 10 ميكروغرام/مل من TNFα في وسائل الإعلام كاملة ومخزن في-20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام-
      3. جعل
    3. 1 ميكروغرام/مل العامل رصيد TNFα في وسائل الإعلام كاملة عندما تكون جاهزاً لعلاج الخلايا. المسلسل تضعف الأسهم العامل TNFα إلى 10 4 بيكوغرام/مل 3 10 بيكوغرام/مل، 500 بيكوغرام/مل، 250 بيكوغرام/مل و 125 بيكوغرام/مل في وسائل الإعلام كاملة-
      ملاحظة: تركيز TNFα 10 4 بيكوغرام/مل اعتدال السامة للخلايا. التكيف لتركيزات TNFα اختبار سيتوقف على تفاصيل التطبيقات النهائية المرجوة.
  2. علاج الخلايا مع TNFα
    1. بعد 24 ساعة ثقافة، نضح وسائط الثقافة من الخلايا واستبدال مع 2 مل TNFα تستكمل وسائل الإعلام الواحدة وكذلك على لوحات 6-جيدا (الآبار اثنين على الأقل للعلاج والمركبات التحكم)-
    2. بعد 24 ح TNFα-التعرض (48 ح للثقافة)، استبدال وسائل الإعلام TNFα تكملة مع وسائل الإعلام كاملة-
  3. حصاد الخلايا والبروتين الكلي
    1. بعد 72 ساعة ثقافة (24 ح في الماضي إزالة TNFα)، نضح وسائط الإعلام وشطف الخلايا مع درجة حرارة الغرفة برنامج تلفزيوني بلطف وإضافة ميليلتر 80 من الجليد الباردة الإنزيم راديويمونوبريسيبيتيشن المخزن المؤقت (RIPA) التي تتضمن طازجة إضافة مثبطات البروتياز والفوسفاتيز (الجدول 3) مباشرة لكل بئر.
    2. إزالة الخلايا من اللوحة مع كاشطة لخلية. نقل الخلايا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل، تجميع الآبار داخل مجموعات العلاج.
    3. الخلايا من فورتيكسينج الأنابيب في عالية لفترات ثلاث على الأقل من 15 س.
    4. احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية مع هزاز ل 15 دقيقة
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، بعد الخطوة 3.3.3.، يمكن المحتضنة الخلايا في الثلج لمدة 15 دقيقة مع الانفعال المتقطع خلال يسددها الأنبوب، فورتيكسينج، أو بيبيتينج يصل وهلwn.
    5. كرر الخطوة 3.3.3.
    6. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 10,000 س ز لمدة 5 دقائق عند درجة 4 مئوية بيليه الحطام الخلوية.
    7. نقل المادة طافية (التي تحتوي على البروتين الخلوي) إلى 1.5 مل الجديدة ميكروسينتريفوجي الأنبوبة ومخزن في-80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف هنا البروتوكول واستأنفت في وقت لاحق. من المستحسن جعل مختبرين عدة عينات البروتين الخلوي لتجنب دورات تجميد أذاب متعددة.
    8. تحديد تركيز البروتين الكلي بطريقة مفضلة، مثل مقايسة حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي، انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية)-
  4. الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والغربية النشاف لخطوة جريئة أو البروتين الفائدة
    ملاحظة: "الغربية اتبع" النشاف بروتوكولات وفقا للشركة المصنعة ' s تعليمات استخدام نظام مختبر مفضل.
    1. تحميل بين 20-40 ميكروغرام من البروتين الكلي في المخزن المؤقت للعينة (الجدول 3) كل بئر على اكريلاميد 12% جل. فصل البروتينات بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة في تشغيل المخزن المؤقت (الجدول 3)-
    2. الرطب ونقل البروتينات من الجل لغشاء ثنائي الفلوريد (PVDF) الفينيليدن وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s في نقل المخزن المؤقت (الجدول 3).
    3. احتضان الغشاء في مسحوق الحليب 5% في "تريسبوفيريد المالحة" مع 0.1% 20 توين (تبسة، الجدول 3) على الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز.
    4. احتضان الغشاء في جسم الأولية خطوة جريئة (انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) في 1: 500 1% مسحوق الحليب في تبسة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع هزاز.
    5. برفق يغسل الغشاء 3 x 5 دقيقة في تبست و 1 × 5 دقائق في تبس في درجة حرارة الغرفة مع هزاز.
    6. احتضان الغشاء في 1:2000-بينها جسم الثانوي (المتقارن مرئية مرتبطة ببرنامج الصحة الإنجابية أو المفضلة، انظر جدول الإمدادات الأساسية، والمواد الكاشفة، والمعدات، والمواد التكميلية) في 5% مسحوق الحليب في تبسة على الأقل 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز.
    7. تصور وصمة عار مع الركازة (أي تشيميلومينيسسينت) تصور مناسب على نظام تصوير وكرر الإجراء الغسيل المذكورة في الخطوة 3.4.5.
    8. كرر الإجراء الغسيل المذكورة في الخطوة 3.4.5 والتحقيق الغشاء β أكتين أو عنصر تحكم تحميل مفضل وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-
    9. في البرنامج تحليل الصور المفضلة، تحليل التعبير من خطوة جريئة بالقياس الكمي اليدوي لامتصاص (كثافة الفرقة)، مراقبة الطرح لامتصاص الخلفية، والتطبيع لتحميل المقابلة كثافات الفرقة. إجراء التحليلات الإحصائية حسب الاقتضاء لاختبار تغييرات يعتد به إحصائيا في مستويات البروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مصطلح مشيمة الآدمي من العجاف (مؤشر كتلة الجسم قبل الحمل (BMI) < 25) جمعت الأمهات ذوات الحمول غير المصحوبة بمضاعفات حمل ذرية الإناث وأخذ عينات منها خلال 15 دقيقة الولادة بالعملية القيصرية (لا العمل). وبحثت في المشيمة لعدم وجود تكلسات والتنمية النموذجية: وزنها بين 300-600 غرام مع الحبل السري والأغشية إزالتها، جولة في الشكل، بين 15-25 سم في القطر، وإدراجها في المنتصف الحبل السري المشيمة. وكان تشريح الأنسجة فيلوس بعيداً عن الصفائح القاعدية والمشيمة في 2-3 عينات من عبر المشيمة (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المشيمة، المسؤولة عن تنظيم نمو الجنين، يسلك الدالة الشبهة في البيئة السمنة6. على الرغم من مطالب الأيضية العالية تروفوبلاستس، يحمل مشيمة مع السمنة الأمهات التنفس المتقدرية مختلة6،19. التغييرات في استقلاب المشيمة قد تسهم في ازدياد نسبة الإصابة بالمضاعفات والنتائج الضائرة الجنين في الحمل السمنة3،،من67. أوتوفاجي هو أيضا يتعرض للخطر في مشيمة مع السمنة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون النساء الذين تبرعوا مشيمة لهذه الدراسة. ونشكر أيضا بتسليم إدارة OHSU والأم والجنين من فريق البحث والعمل لتنسيق جمع مشيمة. نحن ممتنون لاريك وانغ، دكتوراه، وكيلي كو، العضو المنتدب للدعم والمساعدة بطرق تجريبية والتحسين.

تم تمويل هذا العمل من قبل HD076259A المعاهد الوطنية للصحة (صباحا) واها GRNT29960007 (ص).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10X HBSSGibco14185-052
CaCl2 (anhyd.)سيجما ألدريتشC1016-100G
MgSO4 (أنهيد.)سيجما ألدريتشM7506-500G
هيبسفيشر ساینتفيكBP310-500
التربسينجيبكو15090-046
DNAseWorthington Biochemical Corp.LS002139
مثبطات البروتياز / الفوسفاتيزThermofisher Scientific88668
Tris HClInvitrogen15506-017
EDTAInvitrogen15576-028
NaClSigma-AldrichS7653-1KG
SDSFisher ScientificBP166-600
ديوكسي كولات الصوديوم.AAJ6228822العلمي
تريتون X-100سيجما ألدريتشX100-500ML
Iscove s Dulbecco المعدل ' s متوسط (IMDM)جيبكو12440-046
مصل الأبقار الجنينية (FBS)كورنينج35-010-CV
مصل ربلة الساق حديثي الولادة (NCS)جيبكو26010-074
البنسلين / الستربتومايسين (قلم / بكتيريا)جيبكو15140-122
10٪ فورمالينفيشر ساینتفيك23-427-098
DMSOسيجما ألدريتشD2650-100ML
TNF &alpha ؛Sigma-AldrichSRP3177-50UG
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Gibco70013-032
K2< / sub>EDTA أنابيب جمع الدم بالفراغBD366450
Percoll (وسائط التدرج الكثافة، DGM) GEHealthcare17-0891-01
6 ألواح آبار مصافيخلاياCorning 353046
فيشر ساينتفيك22363549
إيبندورف أنابيب القفل الآمن 2.0 مل ،22363352فيشر ساينتفيك
تريبان بلوكورنينج25-900-Cl
Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra SystemBio-Rad1658001FC
Bio-Rad Mini Trans-Blot CellBio-Rad1658033
TGX FastCast Acrylamide Kit ، 12٪ Bio-Rad1610175
Mini-Protean 3 غرفةمتعددة الصب Bio-Rad1654112
4X Laemmli Sample BufferBio-Rad1610747
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM3148-100ML
GlycineBio-Rad1610718
Tween-20Sigma-AldrichP7949-500ML
القرنفلالفوري الخالي من الدسم
(D9F7) تقنية إشارات خلية الأرانبmAb 8465S
أحادي النسيلة المضاد للبيتا الأكتين المنتج في الفأرSigma-AldrichA2228-100UL
المضاد للأرانب IgG ، تقنية إشارات خلايا الأجسام المضادة المرتبطة بHRP 7074S
المضادة للفأر IgG ، الجسمالمضاد المرتبط ب HRPتقنية إشارات الخلية7076S
SuperSignal West Pico PLUS الركيزة الكيميائيةالمضيئة الحرارية العلمية34578
فيشر طبيعي روبيكون

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregor, M. F., Hotamisligil, G. S. Inflammatory mechanisms in obesity. Annu. Rev. Immunol. 29, 415-445 (2011).
  2. van Horssen, R., Ten Hagen, T. L. M., Eggermont, A. M. M. TNF-alpha in cancer treatment: molecular insights, antitumor effects, and clinical utility. Oncologist. 11 (4), 397-408 (2006).
  3. Yogev, Y., Catalano, P. M. Pregnancy and obesity. Obstet. Gynecol. Clin. North Am. 36 (2), 285-300 (2009).
  4. Basu, S., et al. Pregravid obesity associates with increased maternal endotoxemia and metabolic inflammation. Obesity (Silver Spring). 19 (3), 476-482 (2011).
  5. Muralimanoharan, S., Guo, C., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in miR-210 expression and mitochondrial dysfunction in the placenta with maternal obesity. Int J Obes (Lond). 39 (8), 1274-1281 (2015).
  6. Myatt, L., Maloyan, A. Obesity and placental function. Semin. Reprod. Med. 34 (1), 42-49 (2016).
  7. Aune, D., Saugstad, O. D., Henriksen, T., Tonstad, S. Maternal body mass index and the risk of fetal death, stillbirth, and infant death: a systematic review and meta-analysis. JAMA. 311 (15), 1536-1546 (2014).
  8. Eriksson, J. G., Kajantie, E., Osmond, C., Thornburg, K., Barker, D. J. P. Boys live dangerously in the womb. Am. J. Hum. Biol. 22 (3), 330-335 (2010).
  9. Kliman, H. J. Trophoblast to human placenta. Enc. Reprod. Knobil, E., Neill, J. D. 4, Academic Press. San Diego. 834-846 (1999).
  10. Kliman, H. J., Nestler, J. E., Sermasi, E., Sanger, J. M., Strauss, J. F. Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology. 118 (4), 1567-1582 (1986).
  11. Bax, C. M., et al. Ultrastructural changes and immunocytochemical analysis of human placental trophoblast during short-term culture. Placenta. 10 (2), 179-194 (1989).
  12. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  13. Muralimanoharan, S., Gao, X., Weintraub, S., Myatt, L., Maloyan, A. Sexual dimorphism in activation of placental autophagy in obese women with evidence for fetal programming from a placenta-specific mouse model. Autophagy. 12 (5), 752-769 (2016).
  14. Matsunaga, K., et al. Two Beclin 1-binding proteins, Atg14L and Rubicon, reciprocally regulate autophagy at different stages. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 385-396 (2009).
  15. Zhong, Y., et al. Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex. Nat. Cell. Biol. 11 (4), 468-476 (2009).
  16. Yang, C. -S., et al. Autophagy Protein Rubicon Mediates Phagocytic NADPH Oxidase Activation in Response to Microbial Infection or TLR Stimulation. Cell Host & Microbe. 11 (3), 264-276 (2012).
  17. Yang, C. -S., et al. The Autophagy Regulator Rubicon Is a Feedback Inhibitor of CARD9-Mediated Host Innate Immunity. Cell Host & Microbe. 11 (3), 277-289 (2012).
  18. Zi, Z., et al. Rubicon deficiency enhances cardiac autophagy and protects mice from lipopolysaccharide-induced lethality and reduction in stroke volume. J. Cardiovasc. Pharmacol. 65 (3), 252-261 (2015).
  19. Mele, J., Muralimanoharan, S., Maloyan, A., Myatt, L. Impaired mitochondrial function in human placenta with increased maternal adiposity. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 307 (5), E419-E425 (2014).
  20. Mor, G., Cardenas, I., Abrahams, V., Guller, S. Inflammation and pregnancy: the role of the immune system at the implantation site. Ann N Y Acad Sci. 1221 (1), 80-87 (2011).
  21. Resi, V., et al. Molecular inflammation and adipose tissue matrix remodeling precede physiological adaptations to pregnancy. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 303 (7), E832-E840 (2012).
  22. Levine, B., Mizushima, N., Virgin, H. W. Autophagy in immunity and inflammation. Nature. 469 (7330), 323-335 (2011).
  23. Virgin, H. W., Levine, B. Autophagy genes in immunity. Nat. Immunol. 10 (5), 461-470 (2009).
  24. Sagrillo-Fagundes, L., et al. Human Primary Trophoblast Cell Culture Model to Study the Protective Effects of Melatonin Against Hypoxia/reoxygenation-induced Disruption. JoVE. (113), (2016).
  25. Segovia, S. A., Vickers, M. H., Gray, C., Reynolds, C. M. Maternal obesity, inflammation, and developmental programming. Biomed. Res. Int. , 418975(2014).
  26. Komatsu, M., et al. Tumor necrosis factor-alpha in serum of patients with inflammatory bowel disease as measured by a highly sensitive immuno-PCR. Clin. Chem. 47 (7), 1297-1301 (2001).
  27. Matsunaga, K., Noda, T., Yoshimori, T. Binding Rubicon to cross the Rubicon. Autophagy. 5 (6), 876-877 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة