مقالة منهجية

فحص الآلي سريع جيوتاكسيس سلبية متكررة لتحليل سلوك التسلق الكبار في نموذج المورفولوجية نيوروديجينيريشن

DOI:

10.3791/56507

⸱

سبتمبر 12, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center for Translational Medicine, Tongji University School of Medicine, 2Key Laboratory of Arrhythmias of the Ministry of Education of China, Shanghai East Hospital, Tongji University School of Medicine, 3Department of Anatomy and Neurobiology, Tongji University School of Medicine, 4Shanghai Advanced Research Institute, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences, 5Sino-Danish College, University of Chinese Academy of Sciences, Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويحلل هذا البروتوكول خطوة بخطوة المورفولوجية جيوتاكسيس السلبية سلوك استخدام نظام اسطوانة متعددة يستضيف مئات ذباب ويزامن أعمالهم بمحرك كهربائي. عند المزامنة، هو جزيئي السلوك جيوتاكسيس السلبية يطير، المسجلة رقمياً، وتم تحليلها باستخدام البرمجيات رفليديتيكشن المصممة ذاتيا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أمراض الأعصاب ترتبط كثيرا فقدان تدريجي لقدرة الحركة وانخفاض العمر المتوقع نيوروديجينيريشن تعتمد على العمر. لفهم هذه الآلية الخلوية هذه الأحداث، وعلاقاتها السببية مع بعضها البعض، melanogaster المورفولوجية، مع أدوات الجينية متطورة ومميزات سلوكية متنوعة، تستخدم كنماذج المرض لتقييم تعمل الأعصاب. هنا يمكننا وصف أسلوب الفائق لتحليل سلوك الكبار جيوتاكسيس السلبية المورفولوجية ، كمؤشر لعيوب السيارات المرتبطة نيوروديجينيريشن. جهاز الآلي تم تصميمه وتطويره بالتزامن يطير محرك الأقراص باستخدام دفعة كهربائية أولية، في وقت لاحق مما يتيح تسجيل السلوك السلبي جيوتاكسيس وخلال ثوان إلى دقيقة. ثم تتم معالجة الصور من الفيديو المسجلة رقمياً مع برنامج رفليديتيكشن الذاتي المصممة لمعالجة البيانات الإحصائية. مختلفة من الإنزيم جيوتاكسيس السلبية التي تسيطر عليها يدوياً استناداً إلى ذبابة واحدة، يسمح هذا البروتوكول دقيقة وسريعة، والفائق الحصول على البيانات من أكثر من مئات ذباب في الوقت ذاته، توفير نهج فعالة للنهوض بموقعنا فهم في هذه الآلية الكامنة وراء العجز الحركي المرتبطة نيوروديجينيريشن.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعت مجموعة متنوعة من بروتوكولات وأساليب لتحليل سلوك التسلق الكبار المورفولوجية . بل شاقة، التحليل التقليدي معظمها ينطوي على وضع ذبابة واحدة قنينة فردية ويستخدم قوة يدوية للاستفادة من الذباب إلى أسفل لمزامنة1،2،3،4. هي شاقة وتستغرق وقتاً طويلاً، وغير ملائمة للدراسات العالية الإنتاجية الكبيرة، والاختلافات المحتملة للقوة اليدوية المستخدمة للاستفادة من انخفاض الذباب، فضلا عن القيود الأخرى. تحسين المقايسة، وضعت مقايسة جيوتاكسيس سلبية تكرارية سريع (الدائري) الذي يسمح تحليل الفائق على مدى العديد من الذباب في الوقت نفسه5. بيد الفحص لا يزال يتطلب قوة ممارسة يدوياً لمزامنة العمل يطير. لدينا نسخة التحليل الدائري، نقحت بناء على التحليل السابق، يتضمن قاعدة معدنية لاستضافة عدة قنينات المحتوية على الطاير تلقائياً يسيطر عليها محرك كهربائي محرك تزامن يطير6. عند التسجيل، حلل الطاير تسلق فورا بعد أن يتم تسجيل المزامنة ثم استخدام برمجيات مصممة ذاتيا. لدينا المقايسة خاتم الآلي إلغاء عملية شاقة وتتطلب عمالة مكثفة في جمع البيانات من ذبابة واحدة، واحدة في كل مرة، وتمكين عملية الحصول على البيانات لتكون أكثر كفاءة. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت مقايسة خاتم الآلي في عدد من الدراسات توضيح الآلية الكامنة وراء مرض الزهايمر ومرض باركنسون، التحقق من صحة النهج مع كفاءة عالية7،8،9 .

في هذه المقالة، نبدي المقايسة خاتم الآلي باستخدام DDC Gal4 مدفوعة [رني] الذباب. DDC-Gal4 خط Gal4 على وجه الخصوص معربا عن تتميز (دا) وهرمون السيروتونين من الخلايا العصبية، وبالتالي تمثل أداة عظيمة لتحليل تأثيرات الجينات المستهدفة المرتبطة بالعجز الحركي المرافقين نيوروديجينيريشن10. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا إدراج UAS-Dicer2، خط الطيران الذي يعزز كفاءة [رني]، لتوليد UAS-Dicer2؛ DDC-Gal4 أداة الخط. [رني] الذباب نختار لاستخدام هو أوكسيلين (aux) v16182 [رني] (عازر16182)، تطير جينات التي حددناها سابقا المعرض لها تأثير على النشاط الحركي8. أوكسجفب الذباب مستعدون أيضا لتحليل آثار aux overexpression. ونحن سوف تظهر كيفية استخدام التحليل الدائري الآلي لقياس يطير جيوتاكسيس السلبية وتقديم النتائج ومناقشة أي آثار تم الحصول عليها من النتائج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-"جمع يطير"

  1. الحفاظ على الذباب على الطعام يطير القياسية في 25 درجة مئوية، والرطوبة 70%، ودائرة ضوء/الظلام ح 12/12 ح.
  2. جمع UAS -Dicer2؛ DDC-GAL4 فيرجينسوندير يطير غاز ثاني أكسيد الكربون (CO 2) التخدير.
  3. عبور هذه العذارى للذباب الذكور البالغين 2 يوم من العمر يحمل الأنماط الوراثية التالية: UAS-mCD8GFP (المراقبة)، عازر 16182 (aux [رني]) ، أوكسجفب (aux overexpression)، و عازر 16182؛ أوكسجفب (الإنقاذ)، مع الذكور: الإناث نسبة 1:2.
  4. بشكل منفصل جمع حديثا اكلوسيد الذكور والإناث في قنينات 3 لكل مجموعة لكل تجربة، وضع الذباب 10 في كل قنينة الطيران العادية مع الغذاء القياسية في 25 درجة مئوية.
  5. اعتماداً على التجربة، الاحتفاظ جمع الذباب تصل إلى 35 يوما واستخدامها لتحليل الحلقة الآلي في يوم 5 و 15، 25 و 35-

2. الآلي المقايسة خاتم

  1. 10 نقل الذباب المجمعة (الجنسين) في النمط الوراثي في كل فيال، ثم تأمين القنينة مع المسمار. تحليل مراقبة الذباب والذباب يحمل الأنماط الجينية المختلفة معا لكل مجموعة من التجارب (ما يصل إلى 10 زجاجة في نفس الوقت، الذباب 10 في كل قنينة).
  2. تشغيل الكاميرا الرقمية التي توضع أمام الجهاز، وبدء تسجيل مرة واحدة الذباب جميع محملة وجاهزة-
  3. بعد السماح 1 دقيقة للذباب لتسوية في قارورة، قم بتشغيل وحدة تحكم الخطوة التي يتحكم السائق خطوة؛ وهذا يدفع محرك كهربائي صغير للتحكم في ذراع المرفقة حيث أن يرتفع تباعا وصنابير الجهاز 4 مرات في 2 ثانية. انظر الشكل 1.
    1. بعد التنصت، علما أن الذباب تبدأ بالصعود الجدار. ضمان استمرار تسجيل.
  4. تكرار التزامن كما هو موضح في الخطوة 2.3 في الفاصل الزمني 60-s للمحاكمات على التوالي 3 إلى 5-
  5. كرر التجربة 5، 15، 25، والذباب 35 يوم من العمر. إجراء تجارب مستقلة على الأقل 3 لكل مجموعة، وكل تجربة مع مالا يقل عن 30 المجمعة الذباب (3 قنينات).

3. تحليل بيانات

  1. استيراد الفيديو المسجلة إلى الكمبيوتر-
  2. أخذ لقطة من الفيديو في 6 s بعد التنصت، لكل محاكمة.
  3. استيراد الصورة اللقطة إلى البرنامج رفليديتيكتيون (انظر الشكل 2)، باستخدام ' ملف ' القائمة.
  4. تعيين خطوط الأساس العلوي والسفلي من القنينة تحديداً باستخدام رمز خط على شريط الأدوات، ثم استخدام المؤشر لوضع علامة على خطوط الأساس العلوي والسفلي في الصورة-
  5. إدخال عدد الذباب كل قنينة (مثلاً، 10 هنا) في ' الذباب في المستطيل ' طول الحقل والقنينة (مثلاً، هنا 14 سم) في ' "ارتفاع أنبوب" ' الميدانية داخل شريط الإعدادات.
    1. علما بأن المواقف يطير الفردية التي تم الكشف عنها والمسمى بالنقاط على الشاشة لكل قنينة.
      ملاحظة: يشير الرقم 2 إلى مواقف جميع نقرات زر القائمة-
  6. علما بأن البرنامج يحدد مسافة التسلق لكل ذبابة تلقائياً ويعرض القيم متوسط من الذباب 10 في كل قنينة في جدول على اللوحة اليمنى. (انظر الشكل 2)
  7. عملية عدد التسلق مع البرامج الإحصائية (مثلاً، المنشور) لمزيد من التحليل الإحصائي-
  8. هذا يعني البيانات ك ± sem.
  9. حساب فقيم ذات أهمية (يشار إليه بعلامات نجمية، * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001) استخدام ANOVA أحادي الاتجاه مع بونفيروني متعددة مقارنة test.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوضح هذا المقال استخدام مقايسة خاتم الآلي في تقييم سلوك الذبابة جيوتاكسيس السلبية. خلافا للمقايسة الحلقة السابقة، يتضمن المقايسة لدينا جهاز الآلي الذي يوفر قوة كهربائية لمزامنة العمل يطير ويحلل تصل إلى مئات ذباب في وقت واحد (الشكل 1). تحليل Dicer2 ؛ DDC > عازر16182 أظهرت الذباب انخفاض العمر تعتمد على مسافة التسلق في غضون فترة زمنية 6-s للذباب الذكور والإناث على حد سواء، مما يوحي بأن التعبير aux في الخلايا العصبية دا أمر بالغ ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مقايسة خاتم الآلي الموصوفة هنا يتيح تحليلاً الفائق للسلوك جيوتاكسيس السلبية يطير لمئات ذباب في وقت واحد. سابقا تنطوي الاستراتيجيات القائمة لتحليل تسلق الكبار ملاحظات ذبابة واحدة في قنينة فردية، والكشف عن موقف يطير يدوياً بواسطة العين. في بعض الأحيان قد يسبب هذه العملية شاقة بدلاً من قراءة خاطئة أو التفسير الخاطئ للبيانات، فضلا عن عمل كثيفة العمالة. لدينا المقايسة خاتم الآلي يبدأ بنقرة بسيطة، ومزامنة الجهاز تلقائياً، ويقيم قدرة التسلق من الذباب تصل إلى 100. تزامن الكهربائية يوفر وسيلة أكثر دقة لمراقبة الوقت وغيرها من المع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر مركز الأسهم بلومينغتون و المورفولوجية فيينا مركز [رني] مخزونات يطير. البراءة للجهاز الدائري الذي ينتمي إلى معهد "البحوث المتقدمة في شانغهاي"، الأكاديمية الصينية للعلوم. طلبات للبرامج رفليديتيكشن ينبغي أن هوانغ دي فو (انظر قائمة مقدم البلاغ). بتأييد هذا العمل من المنح المقدمة من "الوطنية الأساسية البحث البرنامج الصيني" (2013CB945602 برنامج 973) و "الوطنية الطبيعية مؤسسة العلوم الصينية" (31270825 و 31171043). ونشكر أعضاء المختبر هو للمناقشة والتعليقات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Forma Environmental ChamberThermo3949
Carbon dioxide cylindersFuLian GAS TechnologyGB/T6052
HDR-CamcorderSONYHDR-CX220E
Binocular stereomicroscopeXin ZhenSMZ-168BL
Electronic scalesMinQiaoSL1002N
RefrigeratorHaierSC-350
Agar-agar powderSinopharm10000561
GlucoseSinopharm10010518
Corn mealSinopharm5464654
Brown sugarLiuCaiYuan45467936
Instant dry yeastAB MAURI20886
AuxR16182VDRC7187
UAS-Dicer2Bloomington24650
UAS-mCD8GFPBloomington32185
DDC-Gal4هدية من Fude Huang
AuxGFPهدية من Henry Chang

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. (49), (2011).
  2. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J Vis Exp. (61), (2012).
  3. Madabattula, S. T., et al. Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders. J Vis Exp. (100), e52741(2015).
  4. Podratz, J. L., et al. An automated climbing apparatus to measure chemotherapy-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 7 (3), 187-192 (2013).
  5. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
  6. Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31 (5), 541-549 (2015).
  7. Shen, Y., et al. SH2B1 is Involved in the Accumulation of Amyloid-beta42 in Alzheimer's Disease. J Alzheimers Dis. 55 (2), 835-847 (2017).
  8. Song, L., et al. Auxilin Underlies Progressive Locomotor Deficits and Dopaminergic Neuron Loss in a Drosophila Model of Parkinson's Disease. Cell Rep. 18 (5), 1132-1143 (2017).
  9. Zhang, X., et al. Downregulation of RBO-PI4KIIIα Facilitates Aβ42 Secretion and Ameliorates Neural Deficits in Aβ42-Expressing Drosophila. J Neurosci. 37 (19), 4928-4941 (2017).
  10. Riemensperger, T., et al. A single dopamine pathway underlies progressive locomotor deficits in a Drosophila model of Parkinson disease. Cell Rep. 5 (4), 952-960 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila RING RflyDetection

مقالات ذات صلة