يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56508

⸱

فبراير 6, 2018

 ,  ,  , 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes, 2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology", 3CHU Nantes, France

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

يصف لنا طريقة لإنتاج أجسام مضادة بشرية محددة مستضد الاهتمام، بدءاً من الخلايا ب نادرة المتداولة في الدم البشري. جيل من هذه الأجسام المضادة الطبيعية بكفاءة وسرعة، والأجسام المضادة التي تم الحصول عليها يمكن أن تميز بين المستضدات المتصلة بدرجة عالية.

الملخص

[مونوكلونل] (مابس) أدوات قوية مفيدة لكلا من البحوث الأساسية، وفي الطب الحيوي. خصوصيتها العالية أمر لا غنى عنه عند الجسم يحتاج إلى التمييز بين الهياكل ذات الصلة العالية (مثلاً، بروتين عادي وتحور نسخة منه). الطريقة الحالية لتوليد مثل هذه مابس التمييزية ينطوي فحص واسعة النطاق متعددة الخلايا المنتجة لأب ب، ومكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء. ونحن نقترح هنا طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة لتوليد التمييزية، مابس البشرية الكامل بدءاً من الدم البشري تعميم لمفاوية ب. أصالة هذه الاستراتيجية سبب اختيار محددة مستضد ملزمة ب الخلايا جنبا إلى جنب مع التحديد مكافحة كافة الخلايا الأخرى، استخدام متاحة الطرفية الدم وحيدات النوى خلايا (ببمك). مرة واحدة محددة ب الخلايا المعزولة، يتم الحصول على تسلسلات كدنا (تكميلية الحمض الخلوي الصبغي) الترميز ماب المقابلة استخدام تكنولوجيا عكس النسخ-"تفاعل البوليميراز المتسلسل" (RT-PCR) خلية مفردة، وأعربت في وقت لاحق في الإنسان الخلايا. خلال أقل من شهر واحد، فمن الممكن تنتج ملليغرام من مابس البشرية عالية التمييزية ضد أي مستضد المطلوب الكشف عنها بطبيعة الحال بواسطة مرجع الخلية ب.

المقدمة

الأسلوب الموصوفة هنا يسمح إنتاج مونوكلونل البشرية الكامل (مابس) ضد مستضد المطلوب (Ag) السريع وتنوعاً. مابس أدوات لا غنى عنها في العديد من تطبيقات البحوث الأساسية في المختبر و في فيفو: التدفق الخلوي، وعلم الأنسجة، والتجارب الغربية النشاف، وحظر على سبيل المثال. وعلاوة على ذلك، مابس تستخدم أكثر فأكثر في الطب لعلاج أمراض المناعة الذاتية، السرطان، ومراقبة زرع الرفض1. على سبيل المثال، استخدمت مؤخرا مابس 4-مكافحة-كتلاً ومكافحة-PD-1 (أو مكافحة-PD-L1) كمثبطات محصنة ضد نقطة تفتيش في علاجات السرطان2.

مابس الأولى تم إنتاجها بواسطة الغلوبولين المناعي (Ig)-إفراز هيبريدوماس التي تم الحصول عليها من خلايا الطحال المحصنين الفئران أو الجرذان. ومع ذلك، يعوق الاستجابة المناعية القوية ضد مابس الفئران أو الجرذان استعمالها العلاجي في البشر، وسبب بهم التخليص السريع وتحريض محتمل من تفاعلات فرط الحساسية3. لمعالجة هذه المشكلة، استبدلت تسلسل البروتين الحيواني مابس جزئيا بالبشرية منها لإنشاء ما يسمى تشيميريك الإنسان الماوس أو أنسنة الأجسام المضادة. ومع ذلك، هذه الاستراتيجية جزئيا فقط يقلل الاستمناع، مع زيادة كبيرة في التكلفة والجدول الزمني للإنتاج. حل أفضل لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا ب البشرية وتتوافر استراتيجيات عدة لهذا. واحد منهم هو استخدام عرض بالعاثية أو الخميرة. وهذا ينطوي على عرض مجالات متغير من مكتبة اندماجي عشوائي Ig البشرية الثقيلة وسلاسل الضوء على فاجيس أو الخمائر، والقيام بخطوة اختيار استخدام مستضد معين من الفائدة. عيب رئيسي لهذه الاستراتيجية أن السلاسل الثقيلة والخفيفة وترتبط عشوائياً، مما أدى إلى زيادة كبيرة جداً في تنوع الأجسام المضادة التي تم إنشاؤها. الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها من المحتمل أن تقابل تلك التي ستنشأ عن استجابة جهاز المناعة طبيعية ضد أغ خاصة. وعلاوة على ذلك، طي البروتين البشري والتعديلات بوستترانسلاشونال لا بانتظام مستنسخة في بدائيات النوى، أو حتى في الخمائر. أسلوب إنتاج البشري ماب ثاني هو تخليد للخلايا البشرية الطبيعية ب، بعدوى فيروس ابشتاين-بار أو التعبير عن العوامل المضادة-apoptotic BCL-6 و BCL-XL4. ومع ذلك، هذا الأسلوب لا ينطبق إلا على خلايا الذاكرة ب وغير الفعالة، التي تتطلب فحص العديدة المنتجة للإنسان والمحيط الحيوي مخلدة ب الخلايا لتحديد المستنسخين ماب قليلة (أن وجدت) مع خصوصية مستضدي المرجوة. الأسلوب وبالتالي مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً على حد سواء.

ووصف مؤخرا بروتوكولا جديداً لإنتاج مابس البشرية من خلايا ب مفردة معزولة5. وهي تعتمد على محسن خلية واحدة عكس النسخ-"تفاعل البوليميراز المتسلسل" (RT-PCR) للتضخيم من كلا الثقيلة-والضوء-سلسلة ترميز شرائح من خلية واحدة بتم فرزها. وهذا يعقب بالاستنساخ والتعبير عن هذه الأجزاء في نظام تعبير حقيقية النواة، مما يسمح لتعمير ماب البشرية الكامل. وقد استخدم هذا البروتوكول بنجاح بدءاً من الخلايا ب من المانحين جرى تطعيمهم. كانت حصاد الخلايا بعد التطعيم للحصول على ترددات أعلى من الخلايا ب الموجهة ضد النائب العام المطلوب، وبالتالي الحد من الوقت اللازم لفحص6أسابيع عدة. كما تم إنتاج أخرى مابس البشرية الكامل من فيروس نقص المناعة البشرية+ (فيروس نقص المناعة البشرية) إصابة المرضى7 وسرطان الجلد المرضى8. وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، لا يزال هناك لا الإجراءات المتاحة التي تمكن من عزل خلايا ب Ag على حدة مستقلة عن النمط الظاهري الذاكرة أو التردد.

ووصف الإجراء هنا يؤدي إلى كفاءة السابقين فيفو عزل الخلايا ب تعميم البشرية استناداً إلى خصوصيتها في المركز، تليها إنتاج البشرية الكامل محددة مستضد مابس في عالية الغلة ومع وقت فحص منخفضة. الأسلوب لا يقتصر على الذاكرة ب الخلايا أو الخلايا ب إفراز الأجسام المضادة التي يسببها بعد استجابة مناعية، ولكن يمكن أيضا تطبيقها على مرجع الخلية بالسذاجه البشرية. أنه يعمل حتى بدءاً من الخلايا الخاصة بحج ب حاضرا في الترددات المنخفضة جداً مؤشر جيد لكفاءتها. ومبدأ الأسلوب كما يلي: ملطخة الخلايا وحيدات النوى الدم طرفية (PBMC) مع اثنين تيتراميرس عرض المستضد الفائدة، وبعضها يحمل فلوروتشرومي مختلفة (مثلاً، فيكوريثرين (PE) واللوفيكوسيانين (APC))، وأن تيترامير ثالث عرض مستضد وثيق صلة مترافق مع فلوروتشرومي ثالث (مثلاً، Brillant البنفسجي 421 (BV421)). لإثراء لخلايا مستضد ملزمة، ثم هي المحتضنة الخلايا مع حبات مغلفة بمكافحة-PE وتقاسم المنافع المضادة-آسيا والمحيط الهادئ، وفرزها في الخلية الفصل بين الأعمدة. يتم تحديد الكسر خلية APC PE+ + ، الملون مع مجموعة متنوعة من مابس المحددة لمختلف أنواع الخلايا ببمك للسماح بتحديد الخلايا ب، ويتعرض للتدفق الخلوي الخلية الفرز. خلايا ب PE+ والجيش الشعبي الكونغولي+، لكن "البنفسجي الرائعة"-، يتم عزل. هذه الخطوة تحديد مكافحة الخلايا التي ليست خلايا ب أو عدم ربط مستضد تيتراميريزيد، ولكن ربط إلى بي أو آسيا والمحيط الهادئ (ستكون هذه الخلايا PE+ الجيش الشعبي الكونغولي– أو PE– الجيش الشعبي الكونغولي+) أو إلى الجزء غير مستضد tetramers المستخدمة (وهذه وسوف تكون الخلايا BV421+). كما يتم تحديد الخلايا ب ليست محددة للغاية حانمه مصلحة مكافحة في هذه الخطوة (وستكون هذه الخلايا أيضا BV421+). وهكذا، هذا الأسلوب يمكن تنقية الخلايا ب محددة للغاية معربا عن مستقبلات الخلية ب (بكرس) قادرة على التمييز بين اثنين من مولدات المضادات ذات صلة وثيقة جداً. يتم جمع الخلايا ب محددة واحدة في أنابيب وعلى تضخيم PCR Ig كدناس (الأحماض منقوص الأكسجين التكميلية) المستنسخة وأعرب عنها خط خلية بشرية يفرز مفتش مابس.

كدليل على المفهوم، توضح هذه الدراسة كفاءة توليد مابس البشرية، التي تعترف ببتيد التي قدمها فئة histocompatibility رئيسية معقدة (MHC--أنا) جزيء ويمكن أن تميز بين هذا الببتيد وغيرها الببتيدات محملة على نفس MHC--أنا اليل. على الرغم من أهمية مستوى تعقيد هذا Ag، يسمح هذا الأسلوب (ط) الانتعاش عالية الغلة من مابس Ag على حدة؛ (ثانيا) إنتاج مابس قادرة على التمييز بين اثنين Ags هيكلياً الوثيق. هذا النهج يمكن تمديدها للمرضى الذين جرى تطعيمهم أو المصابة دون أي تعديل البروتوكول، ولديها أيضا الفعل نفذت بنجاح في نظام جرذ أنسنة9. وهكذا، تصف هذه الدراسة اتباع نهج مرنة وفعالة لتوليد مابس البشرية الكامل الذي يمكن استخدامه في البحوث الأساسية والعلاج المناعي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على عينات الدم الطرفية البشرية كافة من المانحين الكبار مجهول بعد الموافقة عن علم، وفقا للجنة الأخلاقيات المحلية (المؤسسة الفرنسية دو سانغ، EFS، نانت، الإجراء NTS بلير-2016-08).

1-عزل خلايا الدم الطرفية البشرية وحيدات النوى

ملاحظة: ابتداء من المواد يمكن أن يكون مجموع الدم المحيطي البشري أو عينات سيتافيريسيس. لا ينبغي أن يكون أقدم من ح 8 عينات وتستكمل مع مضادات التخثر (مثل، الهيبارين).

  1. تمييع الدم بحجم 2 (الدم المحيطي البشري) أو 5 وحدات التخزين (نموذج سيتافيريسيس) ربمي (معهد ميموريال بارك روزويل) متوسطة.
  2. طبقة 35 مل تعليق خلية المخفف على 15 مل من الكثافة المتوسطة التدرج في أنبوب 50 مل مخروطية بعناية. جعل العديد من الأنابيب اللازمة لتوزيع جميع الدم المخفف. الطرد المركزي في 1,290 س ز لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في دوار دلو يتأرجح مع الفرامل قبالة.
  3. عناية نضح طبقة الخلايا وحيدات النوى في الواجهة بين كثافة متوسطة الانحدار وطبقة البلازما، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد.
  4. ملء الأنبوب مع ربمي المتوسطة وخلط والطرد المركزي في 1,290 س ز لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعناية إزالة المادة طافية.
  5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 20 مل ربمي المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ س لمدة 10 دقيقة لإزالة الصفائح الدموية. بعناية إزالة المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  6. ريسوسبيند بيليه خلية في المتوسط ربمي مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS).
    ملاحظة: انتقل مباشرة إلى وسم تيترامير أو إبقاء الخلايا في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها في تركيز من 107 خلايا/مل.

2-تيترامير المرتبطة تخصيب المغناطيسي من الخلايا الخاصة بحج ب

  1. إعداد تيتراميرس Ag بإضافة أما PE أو المسمى APC قسط الصف ستريبتافيدين أو ستريبتافيدين المسمى BV421 بنسبة 1:4 إلى مونومرات مستضد بيوتينيلاتيد مولى. إضافة المقدار المناسب من المتقارن streptavidin في ثلاثة أجزاء منفصلة، مضيفاً قاسمة واحد كل 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  2. توزيع الخلايا (تصل إلى 3 × 108 كل أنبوب) في أنابيب مخروطية الشكل 15 مل والطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: البروتوكول التالي لأنبوب واحد.
  3. ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) مع 2% FBS. إضافة PE وآسيا والمحيط الهادئ، ومترافق BV421 تيتراميرس، كل إلى تركيز نهائي 10 ميكروغرام/مل. يخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تعد الخلية المثلج فصل المخزن المؤقت (SB) باستخدام برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 0.5% (ألبومين المصل البقري) ويدتا (حمض الإيثيلين) 2 مم.
  5. إضافة 10 مل خلايا SB. بيليه بالطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
  6. ريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من المثلج SB. إضافة 50 ميليلتر من مكافحة-PE و 50 ميليلتر من ميكروبيدس المغناطيسية المضادة-آسيا والمحيط الهادئ.
  7. يخلط جيدا واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. كرر الخطوة 2، 5 مرتين.
  9. إزالة المادة طافية بعناية أندريسوسبيند بيليه الخلية بتركيز 2 x 108 خلايا/مل في الجليد الباردة بينالي الشارقة.
  10. حجته عمود مغناطيسية كبيرة المتمركزة في مغناطيس مع 3 مل من س. ب.
  11. نقل تعليق خلية من 2.9 إلى أعلى العمود متوازن والسماح لاستنزاف تماما. الخطوة الحاسمة: تجنب التثاقل العمود، تمر الخلايا عبر نايلون 70 ميكرون.
  12. شطف الأنبوب الذي يتضمن الخلايا مع 3 مل من الجليد الباردة بينالي الشارقة ونقل المخزن المؤقت مباشرة على العمود (في حالة الترشيح، الشطف 70 ميكرون النايلون).
  13. عند المخزن المؤقت قد استنزفت تماما في العمود، إضافة آخر 3 مل من الجليد الباردة بينالي الشارقة للعمود.
  14. كرر الخطوة 2.13 لآخر 3 مل الغسيل.
  15. إزالة العمود من المغناطيس ومكان عبر أنبوب جمع مخروطية 15 مل.
  16. إضافة 5 مل من الجليد SB البارد على الجزء العلوي من العمود ومباشرة مسح الخلايا خارج العمود باستخدام المكبس. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  17. الطرد المركزي الخلايا المجمعة (التخصيب تيترامير ذات الصلة الإيجابية الخلية الكسر) في ز 460 x لمدة 5 دقائق والمضي قدما لتلطيخ جسم إضافية.
    ملاحظة: تجمع جمع الخلايا من جميع الأنابيب، إذا كان ذلك مناسباً.

3-تلطيخ الخلايا الخاصة بحج ب البشرية وفرز الخلايا

  1. ريسوسبيند بيليه الخلية مع مزيج أجسام مضادة الإنسان ضد CD3 (تمييع النهائي: 01:20)، CD19 (01:20)، CD14 (01:50)، CD16 (01:50)، و 7AAD (1: 1000) في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني مع 2% FBS. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  2. إضافة 10 مل من برنامج تلفزيوني لخلايا وأجهزة الطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق، والقضاء على المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. ريسوسبيند بيليه الخلية في 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، عامل التصفية على 70 ميكرون النايلون.
  3. المضي قدما لفرز الخلايا ب محددة على مستوى خلية مفردة في سيتوميتير فارز خلية مع فوهة 100 ميكرومتر وضغط 20 رطل/بوصة مربعة دون تجاوز الأحداث/s 1,0009.
    ملاحظة: يظهر النابضة الاستراتيجية المستخدمة في الشكل 1. كانت بوابات الخلايا أولاً على CD14–CD16 7AAD–– الخلايا لاستبعاد وحيدات، ناغورني كاراباخ، والخلايا الميتة (غير مبين في الشكل 1). ثم CD19+ ب تم تحديد الخلايا قبل النابضة في الخلايا الملون مزدوجة بي وآسيا والمحيط الهادئ ذات الصلة Ag-تيتراميرس. تم استبعاد الخلايا ب الخاصة بعدم النابضة في الخلايا السلبية BV421 (أونستينيد تيترامير Ag غير ذي صلة).
  4. جمع الخلايا ب واحد إلى 8-قطاع أنابيب PCR مليئة سابقا 10 ميليلتر من برنامج تلفزيوني x 1 و 10 وحدات من "مثبط رناسي" ووضعت على رف ل 96 microtubes. فورا تجميد أنابيب PCR في-80 درجة مئوية.
    ملاحظة: أقنعة الفرز المختارة في الصك cytometer قناع الغلة: 0, نقاء القناع: 32، وقناع المرحلة: 0. يمكن تعديل هذا الإيداع خلية واحدة للوحة بكر 96-384 جيدا أو إذا لزم الأمر. الخلايا ب واحد يجب أن تجمد بأقصى سرعة ممكنة، ويمكن تركها في-80 درجة مئوية لعدة أسابيع، إذا لزم الأمر.

4-وحيد الخلية RT-PCR

  1. الخلايا بتدفئة مباشرة العينات المجمدة في شرائط PCR عند 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حمام جافة.
  2. نقل الشرائط للجليد والشروع في عكس النسخ (RT) بإضافة 10 ميليلتر كل أنبوب 2 x ميكس الرئيسي المخزن المؤقت الذي يحتوي على دنتب 1 مم 25 ميكروغرام/مل oligod(T) الإشعال، 5 ميكرومتر عشوائي hexamers، 20 من مثبط رناسي، ووحدات 400 وحدة من المنتسخة العكسية.
    ملاحظة: بعد خلية ذوبان الجليد، الرايت يجب تنفيذها بسرعة لتجنب تدهور الجيش الملكي النيبالي.
  3. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح هيكساميرس عشوائي هجن، ثم احتضانها ح 1 عند 50 درجة مئوية، وينتهي حضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة التوقف عن رد فعل.
  4. المضي قدما في جولتين من التضخيم PCR المتداخلة لكل منطقة من مناطق الترميز لمتغير الثقيلة (vH) وكابا (vLκ) أو سلاسل خفيفة لامدا (vLλ).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، عينات RT يمكن المجمدة في-20 درجة مئوية والاحتفاظ بها لمدة أسبوع واحد.
    1. بالنسبة للجولة الأولى من بكر، إضافة 3 ميليلتر من كدنا لوحدة تخزين نهائي 40 ميكروليتر المحتوية على 1.5 مم مجكل2، دنتبس 0.25 مم، ووحدات 2.5 من بوليميريز الحمض النووي، و 200 نيوتن متر الإشعال الخارجي (انظر الشكل 2 و الجدول للمواد لمتواليات التمهيدي).
      ملاحظة: تكوين مزيج الإشعال الخارجي. لتضخيم السلسلة الثقيلة: 4 كبسولة تفجير (لفة ميكس 5 ') إلى الأمام، وعكس 2 كبسولة تفجير (CµCγ ميكس 3'). لتضخيم السلسلة الخفيفة كابا، قدما 3 كبسولة تفجير (5 'LV | ميكس) وعكس 1 التمهيدي (3' Cκ543-566). لتضخيم السلسلة الخفيفة لامدا، 7 إلى الأمام الإشعال (5 'مزيج لاتس لاتفي) وعكس 1 التمهيدي (3' Cl).
      ملاحظة: صممت كبسولة تفجير جانب تيلر وآخرون للتضخيم5جميع الأسرة جينات السلسلة الثقيلة والخفيفة.
    2. تنطبق الشروط التالية ركوب: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، تليها دورات 40 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 s في 58 درجة مئوية ل VH و VLκ (60 درجة مئوية، ل VLλ)، و 55 s في 72 درجة مئوية، مع استطالة نهائية خطوة في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    3. لبكر الجولة الثانية، استخدم 3 ميليلتر من التضخيم أول منتج لوحدة تخزين نهائي من 40 ميكروليتر المحتوية على 1.5 مم مجكل2، دنتبس 0.25 مم، ووحدات 2.5 من بوليميريز الحمض النووي، و 200 نانومتر كبسولة تفجير داخلية تحتوي على مواقع إنزيم التقييد للاستنساخ في التعبير ناقلات (انظر الشكل 2 و الجدول للمواد لمتواليات التمهيدي).
      ملاحظة: تكوين مزيج الإشعال الداخلية. لتضخيم السلسلة الثقيلة: 9 إلى الأمام الإشعال (5 'مزيج أجييفه)، وعكس 3 كبسولة تفجير (3' مزيج ساليجه). لتضخيم السلسلة الخفيفة كابا، الأمام 9 الإشعال (5 'عجيب | ميكس) وعكس 3 كبسولة تفجير (3' مزيج BsiWIJκ). لامدا الخفيفة سلسلة التضخيم، 6 إلى الأمام الإشعال (5 'مزيج أجيفل) وعكس 1 التمهيدي (3' إكسهويكل).
      ملاحظة: صممت كبسولة تفجير جانب تيلر et al.، لتضخيم جميع الأسرة جينات السلسلة الثقيلة والخفيفة5.
    4. تنطبق الشروط التالية ركوب: 94 درجة مئوية لمدة دقيقة 4، تليها دورات 40 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 s في 58 درجة مئوية ل VH و LCκ (60 درجة مئوية، ل LCλ)، و 45 s عند 72 درجة مئوية مع استطالة نهائية خطوة في 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
  5. تحديد الآبار الإيجابية بترحيل ميكروليتر 5 منتجات PCR vH و vLκ و vLλ على 1.5% [اغروس] هلام (500 bp المنتجات لقطاعات ترميز متغير السلسلة الثقيلة) ومنتج شركة بريتيش بتروليوم 350 لمتغير السلسلة الخفيفة ترميز شرائح.
  6. تنقية منتجات PCR ميليلتر 35 الباقية المتبقية من الآبار الإيجابية باستخدام الأغشية ultrafiltration مصممة لتنقية منتجات PCR.
  7. الوت منتجات PCR مع 60 ميليلتر من H2o.

5-التعبير استنساخ

  1. يعد إدراج
    ملاحظة: هضم 60 ميليلتر من كل بكر المنقي المنتج في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر الذي يحتوي على المخزن المؤقت إنزيم التقييد الملائمة.
    1. منتجات PCR vH، إضافة 50 وحدة من يجئ ووحدات 50 من سالي، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
    2. منتجات PCR vLλ، إضافة 50 وحدة من يجئ و 50 وحدة من إكسهوي، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
    3. VLκ بكر المنتجات، إضافة 50 وحدة من يجئ واحتضانها ح 1 في 37 درجة مئوية. تنقية النبذ استخدام 96 بكر الأغشية والوت مع 60 ميليلتر من ح2خلاصة O. النذرة ميليلتر 60 في وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر بسيوي إنزيم التقييد المخزن المؤقت، وإضافة وحدات 50 من بسيوي واحتضانها ح 1 في 55 درجة مئوية.
    4. إلغاء تنشيط الإنزيمات بتدفئة في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  2. إعداد للتعبير عن المتجهات
    ملاحظة: يتم استنساخ vH [بكر] منتوجات في متجه تعبير (HCγ1) التي تحتوي على سلسلة ثقيلة ثابتة Cγ1 IgG1. يتم استنساخ منتجات PCR vLκ في متجه تعبير (LCκ) التي تحتوي على السلسلة الخفيفة مستمرة Cκ. يتم استنساخ منتجات PCR vLλ في متجه تعبير (LCλ) التي تحتوي على السلسلة الخفيفة مستمرة Cλ.
    1. أداء ديجيسشنز التالية:
      1. ميكروغرام 1 مزيج التعبير ناقل HCγ1 مع 10 وحدات من يجئ و 10 وحدات من اندونوكليسيس سالي في إجمالي حجم 20 ميليلتر من تقييد المخزن المؤقت الذي أوصت به الشركة المصنعة، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية.
      2. ميكس 1 ميكروغرام من ناقلات التعبير LCκ مع 10 وحدات من إنزيم التقييد يجئ في إجمالي حجم 20 ميليلتر من تقييد المخزن المؤقت الذي أوصت به الشركة المصنعة، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية. إضافة 10 وحدات بسيوي إنزيم التقييد، واحتضان ح 1 في 55 درجة مئوية.
      3. ميكس 1 ميكروغرام من ناقلات التعبير LCλ مع 10 وحدات من يجئ و 10 وحدات من اندونوكليسيس زهوي في إجمالي حجم 20 ميليلتر من تقييد المخزن المؤقت الذي أوصت به الشركة المصنعة، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية
    2. الحرارة كل خليط الهضم عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لإلغاء تنشيط إنزيمات التقييد.
    3. إجراء عملية ربط من 5 ميليلتر من هضم PCR المنتج مع 2 ميليلتر (100 نانوغرام) من ناقلات التعبير خطية المقابلة في إجمالي حجم 20 ميليلتر من 1 × الحمض النووي ليجاسى المخزن المؤقت مع وحدة واحدة من الحمض النووي-ليجاسى T4 بالحضانة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: بدلاً من ذلك، يتم ربط ح 3 في 4 درجات مئوية.
  3. الاستنساخ
    1. اليكتروبوراتي 1 ميليلتر من خليط ربط ميليلتر 20 إلى 45 ميليلتر من اليكتروكومبيتينت محلية الصنع TOP10 كولاي (البروتوكولات الحالية في البيولوجيا الجزيئية، قسم 1.8.4-1.8.8). إضافة 500 ميليلتر من 2 X أي تي المتوسطة على الفور واحتضان في حمام مائي عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 انتشار تحول البكتيريا على 2 × لوحات الأمبيسلّين أي تي. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    2. لكل تحويل، شاشة المستعمرات الثماني ببكر.
      1. إعداد مواده رد فعل النحو التالي على الجليد: 45 ميليلتر من 5 × PCR المخزن المؤقت، 12 ميليلتر مجكل2 (25 مم)، 4 ميليلتر من دنتبس (من أسهم تحتوي على 10 مم لكل منهما)، 10 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (الأوراق المالية 10 ميكرومتر) التهجين إلى تسلسل المتجهات (التمهيدي Ab-مركزنا-إحساس) ، و 10 ميليلتر لعكس التمهيدي (الأوراق المالية 10 ميكرومتر) استهداف منطقة السلسلة الثقيلة أو الخفيفة مستمرة (انظر الجدول للمواد لمتواليات التمهيدي). على وحدة تخزين نهائي من 200 ميليلتر مع H2o. ثم إضافة 4 ميليلتر من إنزيم بوليميريز الحمض النووي (يو 5/ميليلتر).
      2. توزيع 25 ميليلتر من مواده رد فعل كل 8-قطاع بكر الأنبوبة على الجليد.
      3. استخدام مسواك عقيمة لالتقاط مستعمرات فردية. خط المسواك على صفيحة x TY الأمبيسلّين 2 تشكل لوحة نسخ متماثل وثم تراجع ذلك في أنبوب تفاعل PCR.
      4. إجراء فحص PCR تحت الظروف التالية ركوب: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها دورات 25 من 30 ثانية في 94 درجة مئوية، 30 s في 55 درجة مئوية، و 50 s عند 72 درجة مئوية.
      5. تحديد البكتيريا إيجابية بترحيل ميليلتر 5 منتجات PCR على 1.5% [اغروس] هلام.
        ملاحظة: تعطي مستعمرات إيجابيات منتج PCR حوالي 850 bp لناقل سلسلة ثقيلة و 600 شركة بريتيش بتروليوم لناقل سلسلة الخفيفة.
    3. تطعيم أربع مستعمرات إيجابية من لوحة نسخ متماثل إلى 2 مل متوسطة رطل واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز 200 لفة في الدقيقة.
    4. استخراج البلازميدات من الثقافات السائل باستخدام مجموعة أدوات تنقية بلازميد، كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.
    5. التحقق من الإدراج الصحيح المجالات متغيرة حسب سانغر التسلسل من البلازميدات مع التمهيدي Ab مركزنا-بمعنى.
      ملاحظة: يتم والبلازميدات مع إدراج الصحيح (ترميز المفوض السامي و LC المقابلة) كوترانسفيكتيد إلى 293A الخلايا لإفراز. هو جزيئي خصوصية صغيرة الحجم في إنتاج مابس بإليزا. ثم، يتم إنتاج كبير الحجم إذا كان ذلك ممكناً.

6-إنتاج مابس

  1. الإنتاج على نطاق صغير للتحقق من خصوصية
    1. قبل يوم من تعداء، بذور 15,000 الكلي الجنينية البشرية 293A (HEK 293A) الخلايا في 200 ميليلتر من تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو) وتستكمل مع 10% FBS كل بئر في لوحات 96-جيدا. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (5% CO2) عند 37 درجة مئوية.
    2. كوترانسفيكت الخلايا 293A في دميم المتوسطة التي تحتوي على نسبة 10% باستخدام مشتق بولييثيلينيميني خطية ككاشف تعداء FBS.
      ملاحظة: إجراء تعداء في تريبليكاتيس. البروتوكول التالي واحد من لوحة مسطحة القاع 96-جيدا جيدا.
      1. تمييع 0.5 ميليلتر من الحمض النووي تعداء الكاشف إلى 10 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. تمييع ميكروغرام 0.125 من vH وميكروغرام 0.125 من ناقلات داء الليشمانيات الحشوي إذ تعرب عن إلى 10 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. دوامة كل تمييع لمدة 10 ق.
      2. إضافة 10 ميليلتر المخفف كاشف تعداء الحمض النووي إلى الحل الحمض النووي 10 ميليلتر. S دوامة 15 واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة مزيج 20 ميليلتر دروبويسي على خلايا 293A، وتخلط بلطف يحوم اللوحة.
    3. استبدال ح 16 متوسطة بعد تعداء وخلايا الثقافة لمدة 5 أيام في المتوسط خالية من المصل.
      ملاحظة: استخدم المتوسطة خالية من المصل لتجنب المصل Igs تلوث الأجسام المضادة المنتجة.
    4. القضاء على الخلايا والحطام بالطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
    5. حصاد سوبيرناتانتس بتطلع مع ماصة متعدد القنوات وتحويلها إلى لوحة 96 الخامس-أسفل بئر.
    6. معطف Ag ذات الصلة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في 100 ميليلتر الواحدة من المعاد تشكيلها أليسا/السبت طلاء جيدا المخزن المؤقت 1 x بتركيز نهائي 2 ميكروغرام/مل في لوحات أليسا 96-جيدا. راجع الأمثلة في 9.
    7. كتلة الآبار مع 10% FBS دميم المتوسطة ح 2 في 37 درجة مئوية
    8. إضافة 50 ميليلتر من سوبيرناتانتس transfected 293A الخلايا من الخطوة 6.1.5، واحتضان ح 2 في الرايت
    9. إضافة 100 ميليلتر الإنسان المضادة مترافق Ab مفتش لأنزيم البيروكسيديز (HRP) الفجل في 1 ميكروغرام/مل واحتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. إضافة 50 ميليلتر اللونية الركازة (TMB)، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
    10. قراءة الكثافة البصرية في 450 نانومتر على جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: مابس محددة التي كشف عنها تحليل إليزا يمكن زيادة إنتاجها على نطاق واسع وتنقيته على البروتين عمود عرض انجذاب لمفتش البشرية.
  2. الإنتاج على نطاق كبير وتنقية مابس محددة
    1. قبل يوم من تعداء، البذور 6 × 106 الكلي الجنينية البشرية 293A (HEK 293A) الخلايا إلى 175 سم2 قوارير تحتوي على 25 مل دميم وتستكمل مع 10% FBS. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة2 CO (5% CO2) عند 37 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا روافد 70% عند ترانسفيكتيد.
    2. كوترانسفيكت الخلايا 293A في دميم المتوسطة التي تحتوي على نسبة 10% باستخدام مشتق بولييثيلينيميني خطية ككاشف تعداء FBS.
      1. تمييع 50 ميليلتر من الحمض النووي تعداء الكاشف إلى 450 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. تضعف من 10 ميكروغرام من vH وميكروغرام 10 ناقلات داء الليشمانيات الحشوي إذ تعرب عن إلى 500 ميليلتر من 150 مم كلوريد الصوديوم. S دوامة 10 إضعاف كل.
      2. إضافة كاشف تعداء الحمض المخفف للحل الحمض النووي. S دوامة 15 واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إضافة هذا المزيج 1 مل دروبويسي للخلايا، وتخلط بلطف يحوم في قارورة.
    3. استبدال ح 16 متوسطة بعد تعداء وخلايا الثقافة لمدة 5 أيام في المتوسط خالية من المصل.
    4. حصاد المتوسطة التي يسفط مع ماصة 25 مل.
    5. القضاء على الخلايا والحطام بالطرد المركزي في 460 x ز لمدة 5 دقائق.
    6. تنقية الأجسام المضادة باستخدام عمود 1 مل مغلفة بروتين A على نظام بروتين سريعة لوني سائل (فبلك) في 4 درجات مئوية.
      1. حجته البروتين عمود سيفاروسي مع المخزن المؤقت للفوسفات 20 مم (pH 7).
      2. تصفية مستنبت الخلية من 6.2.5 باستخدام عامل تصفية 1.22 ميكرومتر، ثم عامل تصفية 0.45 ميكرومتر.
      3. تحميل المتوسطة التي تمت تصفيتها على العمود.
      4. يغسل مع المخزن المؤقت للفوسفات 20 مم (pH 7) والوت مع عازلة سترات 0.1 M (pH 3.5).
      5. قراءة الكثافة البصرية في 280 نانومتر على جهاز المطياف الضوئي امتصاص على الفور وتحييد الكسور التي تحتوي على البروتين مع 1 "م تريس" العازلة (pH 9).
    7. دياليزي Ab المنقي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في كاسيت مع وزن الجزيئي 3.5 ك استقطاع ضد برنامج تلفزيوني المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4).
    8. تعقيم بنقاء الترشيح وتحكم 0.2 ميكرون بحجم الاستبعاد اللوني، كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بدءاً من ببمك من المانحين صحية، وهذا يعرض مشروع توليد مابس البشرية، التي تعترف الببتيد Pp65495 (Pp65، من الفيروس المضخم للخلايا البشرية) المقدمة من الفئة الرئيسية histocompatibility معقدة أنا (MHC--أنا) جزيء (هلا-A * 0201 HLA-A2). هذه مابس يمكن أن تميز بين هذا المجمع ومجمعات يمثلون الببتيدات الأخرى حملت MHC نفس--أنا جزيء.

كانت ملطخة ببمك هلا-A2/Pp65-PE وهلا-A2/Pp65-آسيا والمحيط الهادئ، وهلا-A2/MelA2-BV421 تيتراميرس كم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

البروتوكول المقترح وسيلة قوية لتوليد مابس البشرية مباشرة من الخلايا الخاصة بحج ب المتداولة في الدم. فهو يجمع بين ثلاثة جوانب هامة: (ط) استخدام المرتبطة تيترامير المغناطيسي تخصيب اليورانيوم، الذي يسمح لعزل السابقين فيفو نادرة حتى ب Ag ملزم الخلايا؛ (ثانيا) استراتيجية النابضة يستخدم ثلاثة تيتراميرس Ag (اثنين منها ذات الصلة وواحدة واحدة ذات صلة) المسمى مع ثلاثة فلوروتشروميس مختلفة لعزل، بالتدفق الخلوي، فقط الخلايا ب التعبير عن بنك معين للنائب العام المنشود؛ (ثالثا) إعادة إعمار كدناس ماب المؤتلف المقابلة من الرايت-ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

ونحن نشكر المرفق الخلوي "سيتوسيل" (الصحة فرنك سويسري، بيوجينويست، نانت) لخبراء المساعدة التقنية. ونشكر أيضا جميع موظفي إنتاج البروتين المؤتلف (P2R) ومنصات الأثر (INSERM 1232، الصحة فرنك سويسري، بيوجينويست، نانت) لتقديم الدعم التقني لهم. ونحن نشكر ستيت إيمانويل وريتشارد بريثناتش للتعليقات البناءة على المخطوطة. وأيد هذا العمل ماليا سيستي رامي المشروع الممول من قبل برنامج "الحكومة الفرنسية" «يشرف دعفينير»، تمكنت من الفرنسية الوطنية بحوث الوكالة (ANR-10-إيبهو-005). رامي-سيستي المشروع تدعمه أيضا نانت متروبول وضمور يدفع de la Loire. وأدرك هذا العمل في سياق البرنامج IGO لابيكس تدعمها الوكالة الوطنية للبحوث عن طريق استثمار البرنامج مستقبلا ANR-11-لابكس-0016-01.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HEK 293A خط خليةThermo Fisher العلميR70507
DMEM (1X) Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco by Life Technologies21969-035(+) 4,5 جم / لتر D-Glucose
0,11 جم / لتر بيروفات الصوديوم
(-) L-Glutmine
RPMI medium1640 (1X)Gibco by life technologies31870-025
Fibro Serum Albumine (BSA) PAAK45-001
Nutridoma-SPRoche11011375001100X Conc
PBS-Phosphate محلول ملحي مخزن (10X) درجة الحموضة 7,4AmbionAM9624
EDTA (حمض الإيثيلين ديامين tetraacetic) 0,5M درجة الحموضة = 8Invitrogen by Life Technologies15575-020
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Dominique DutscherS1810-500
Ficoll - فصل الخلايا الليمفاوية متوسطEuroBioCMSMSL01-01كثافة 1،0777 +/- 0،001
ستربتافيدين R-phycoerythrin المترافقInvitrogen من Life TechnologiesS21388premiun grade 1mg / ml يحتوي على 5 ملي من أزيد الصوديوم
ستريبتافيدين ، مترافق ألوفيكوسيانينInvitrogen بواسطة thermoFisher scientificS323621mg / ml
2 ملي أزيد درجة ممتازة
بنفسجي لامع 421 ستربتافيدينBiolegend405225conc: 0,5 ملغ / مل
MicroBeads المغناطيسي المترافق المضاد لPE Miltenyi Biotec130-048-801
MicroBeads المغناطيسي المترافق المضاد لAPC Miltenyi Biotec130-090-855
MidiMACs أو فاصل QuadroMACSMiltenyi Biotec130-042-302 / 130-090-976
أعمدة LSMiltenyi Biotec130-042-401
CD3 BV510 BD horizonBD Pharmingen / BD Biosciences563109التخفيف المستخدم 1:20
CD19 FITCBD Pharmingen / BD Biosciences345788التخفيف المستخدم 1:20
CD14 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences561116التخفيف المستخدم 1:50
CD16 PerCPCy5.5BD Pharmingen / BD Biosciences338440التخفيف المستخدم 1:50
7AADBD Pharmingen / BD Biosciences51-68981E (559925)التخفيف المستخدم 1: 1000
FACS ARIA III فارز الخلايا مقياس الخلويBD Biosciences
أنابيب PCR ذات 8 شرائطAxygen321-10-061
رفوف ل 96 أنبوبا دقيقادومينيك دوتشر45476
RNAseOUT مثبط ريبونوكلياز (مؤتلف)Invitrogen بواسطة thermoFisher Scientific10777-019الكمية: 5000U (40U / ul)
الماء المقطر Dnase / Rnase FreeGibco10977-035
Oligod (T) 18 mRNA PrimerNew England BioLabsS1316S5.0 A260unit
hexamers عشوائيةInvitrogen بواسطة thermoFisher N8080127 العلميةالكمية: 50uM ، 5nmoles
Superscript III Reverse TranscriptaseInvitrogen بواسطة thermoFisher scientific18080-044الكمية: 10000U (200U / ul)
GoTaq G2 Flexi DNA polymerasePromegaM7805
dNTP Set ، درجة البيولوجيا الجزيئيةThermo ScientificR01824 * 100umol
5LVH1EurofinsACAGGTGCCC
CCCAGGTGCAG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الخارجية - Forward Prmers
5LVH3EurofinsAAGGTGTCCAGTG
TGARGTGCAG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - البادئات الخارجية - البرامرز الأمامي
5LVL4_6EurofinsCCCAGATGGGTCC
TGTCCCAGGTGCAG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الخارجية - Prmers الأمامي
5LVH5EurofinsCAAGGAGTCTGTT
CCGAGGTGCAG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الخارجية - البرامرز
الأمامي3HuIgG_const_antiEurofinsTCTTGTCCACCTT
GGTGTTGCT		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الخارجية - بادئات عكسية للبكتيريا البشرية - فحص PCR للبكتيريا
3CuCH1EurofinsGGGAATTCTACA
GGAGACGA		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الخارجية - بادئات عكسية للإنسان Ig
5AgeIVH1_5_7EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
GAGGTGCAGCTGGTGCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - البادئات الأمامية
5AgeIVH3EurofinsCTGCAACCGGTGTACCT
GAGGTGCAGCTGGTGGAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - الاشعال الأمامية
5AgeIVH3_23EurofinsCTGCAACCGGTGTACTTACCT
GAGGTGCAGCTGTTGGAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - الاشعال الأمامية
5AgeIVH4EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCTGCAGGAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5AgeIVH4_34EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTGCAGCAGCTACAGCAGTG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - الاشعال الأمامية
5AgeIVH1_18EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTTCAGCTGGTGCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5AgeIVH1_24EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCC
CAGGTCCAGCTGGTACAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5AgeIVH3__9_30_33EurofinsCTGCAACCGGTGTACTTACCT
GAAGTGCAGCTGGTGGAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5AgeIVH6_1EurofinsCTGCAACCGGTACTCcc
CAGGTACAGCTGCAGCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
3SalIJH1_2_4_5EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - الاشعال العكسية
3SalIJH3EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAAGAGGGTGACCATTG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - الاشعال العكسية
3SalIJH6EurofinsTGCGAAGTCGACG
CTGAGGAGACGGTGACCGTG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الثقيلة - الاشعال الداخلية - الاشعال العكسية
5 ' LVk1_2EurofinsATGAGGSTCCCYG
CTCAGCTGCTGG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الخارجية - بادئات أمامية
5'LVk3EurofinsCTCTTCCTCCTGC
TACTCTGGCTCCCAG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الخارجية - بادئات أمامية
5'LVk4EurofinsATTTCTCTGTTGC
TCTGGATCTCTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الخارجية - البادئات الأمامية
3'Ck543_566EurofinsGTTTCTCGTAGTC
TGCTTTGCTCA		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الخارجية - الاشعال العكسية - فحص PCR للبكتيريا
5'AgeIVk1EurofinsCTGCAACCGGTACCT
GACATCCAGATGACCCAGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - بادئات إلى الأمام
5'AgeIVk1_9_1&ndash ؛ 13EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTGTAC
ATTCAGACATCCAGTTGACCCAGTCT		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeIVk1D_43_1_8EurofinsCTGCAACCGGTGTACTTGT
GCCATCCGGATGACCCAGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeIVk2EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
الجولة		الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة k - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeIVk2_28_2_30EurofinsCTGCAACCGGTGTACATGGG
GATATTGTGATGACTCAGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeVk3_11_3D_11EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGAATTGTGTTGACACAGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeVk3_15_3D_15EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCA
GAAATAGTGATGACGCAGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeVk3_20_3D_20EurofinsTTGTGCTGCAACCGGTAC
ATTCAGAAATTGTGTTGACGCAGTCT		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - البادئات الأمامية
5'AgeVk4_1EurofinsCTGCAACCGGTGTACATTCG
GACATCGTGATGACCCAGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - الاشعال الأمامية
3'BsiWIJk1_2_4EurofinsGCCACCGTGTT
TGATYTCCACCTTGGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - الاشعال الأمامية
3'BsiWIJk3EurofinsGCCACCGTACGTT
TGATATCCACTTTGGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة ك - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
3'BsiWIJk5EurofinsGCCACCGTACGTT
TAATCTCCAGTCGTGTC		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم سلاسل الضوء ك - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'LVl1EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGTGCTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة &lambda ؛ - الاشعال الخارجية - البادئات الأمامية
5'LVl2EurofinsGGTCCTGGGCCCA
GTCTGCCCTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & لامدا ؛ - الاشعال الخارجية - الاشعال الأمامية
5'LVl3EurofinsGCTCTGTGACCTC
CTATGAGCTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة &lambda ؛ - الاشعال الخارجية - إلى الأمام بادئات
5'LVl4_5EurofinsGGTCTCTCTCSCA
GCYTGTGCTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & لامدا ؛ - الاشعال الخارجية - بادئات أمامية
5'LVl6EurofinsGTTCTTGGGCCAA
TTTTATGCTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & لامدا ؛ - الاشعال الخارجية - بادئات أمامية
5'LVl7EurofinsGGTCCAATTCYCA
GGCTGTGGTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & لامدا ؛ - الاشعال الخارجية - البادئات الأمامية
5LVl8EurofinsGAGTGGATTCA
GACTGTGGTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & لامدا ؛ - الاشعال الخارجية - بادئات أمامية
3'ClEurofinsCACCAGTGTGGCC
TTGTTGGCTTG		الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة &lambda ؛ - الاشعال الخارجية - إلى الأمام بادئات
5'AgeIVl1EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGTGCTGACKCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة λ - الاشعال الداخلية - بادئات إلى الأمام
5'AgeIVl2EurofinsCTGCTACCGGTTCCTGGGCC
CAGTCTGCCCTGACTCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & لامدا; - الاشعال الداخلية - بادئات إلى الأمام
5'AgeIVl3EurofinsCTGCTACCGGTTCTGTGACC
TCCTATGAGCTGACWCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة λ - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeIVl4_5EurofinsCTGCTACCGGTTCTCTCS
CAGCYTGTGCTGACTCA		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & - الاشعال الداخلية - بادئات إلى الأمام
5'AgeIVl6EurofinsCTGCTACCGGTTCTTGGCC
AATTTTATGCTGACTCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة λ - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
5'AgeIVl8EurofinsCTGCTACCGGTTCCAATCY
CAGRCTGTGGTGACYCAG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & لامدا ؛ - الاشعال الداخلية - بادئات أمامية
3'XhoIClEurofinsCTCCTCACTCGAG
GGYGGGAACAGAGTG		الجولة الثانية من تفاعل البوليميراز المتسلسل - تضخيم السلاسل الخفيفة & lambda ؛ - الاشعال الداخلية - الاشعال العكسية - فحص PCR للبكتيريا
Ab-vec-senseEurofinsGCTTCGTTAGAAC
GCGGCTAC		بكتيريا PCR
فحص QA Agarose-TM ، علم الأحياء الجزيئي من الدرجةMP BioAGAH0500
NucleoFast 96 PCRلوحة Macherey Nagel743.100.100
Enzyme Age I HFNew England BiolabsR3552L20000U / ml
إنزيم SalI HFنيو إنجلاند بيولابسR3138L20000U / مل
إنزيم Xho Iنيو إنجلاند بيولابسR0146L20000U / مل
إنزيم BSIWIنيو إنجلاند بيولابسR0553L10000U / مل
HCg1 (رقم انضمام بنك الجين FJ475055) LCk
(رقم انضمام بنك الجين FJ475056) LCl
(انضمام بنك الجنرال رقم FJ517647)
T4 DNA ligaseInvitrogen بواسطة thermoFisher Scientific15224.017100U (1U / ul)
2X YT متوسطسيجما ألدريتشY1003-500ML
أمبيسلينسيجما ألدريتش10835242001
مرق LB (لوريا بيرتاني) (لينوكس)سيجما ألدريتشL3022-250G
نيوكليوسبين البلازميد الحمض النووي الريبي و تنقية البروتينMacherey Nagel740588.250
كاشف تعداء الحمض النووي النفاث PEIPolyPlus101-40
قاع مسطح 96 بئر صفيحةفالكون353072
V-bottom 96 بئر لوحةNunc / Thermofisher055142
Nunc سهلة 175 سم 2 قواريرNunc / Thermofisher12-562-000
ELISA / ELISPOT طلاء عازلةeBiosciences00-0044-59
Nunc maxisorp قاع مسطح 96 بئر لوحات ELISANunc / Thermofisher44-2404-21ملزمة عالية البروتين
مضادة للإنسان IgG Ab مترافقة مع بيروكسيداز الفجل الحار (HRP) BDPharmingen / BD Biosciences55788
TMB الركيزةBD Biosciences555214
StreptavidinSigmaS0677
1 مل-HiTrap بروتين A HP عمودGE Healthcare17-0402-01
& Auml ؛ KTA FPLCGE للرعايةالصحية 18190026
Superdex 200 10/300 GL عمودGE Healthcare17517501
NGC Quest 10 Plus نظام الكروماتوغرافياBioRad7880003

المراجع

  1. Buss, N. A., Henderson, S. J., McFarlane, M., Shenton, J. M., de Haan, L. Monoclonal antibody therapeutics: history and future. Curr Opin Pharmacol. 12 (5), 615-622 (2012).
  2. Park, J., Kwon, M., Shin, E. C. Immune checkpoint inhibitors for cancer treatment. Arch Pharm Res. 39 (11), 1577-1587 (2016).
  3. Pendley, C., Schantz, A., Wagner, C. Immunogenicity of therapeutic monoclonal antibodies. Curr Opin Mol Ther. 5 (2), 172-179 (2003).
  4. Kwakkenbos, M. J., et al. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat Med. 16 (1), 123-128 (2010).
  5. Tiller, T., et al. Efficient generation of monoclonal antibodies from single human B cells by single cell RT-PCR and expression vector cloning. J Immunol Methods. 329 (1-2), 112-124 (2008).
  6. Franz, B., May, K. F., Dranoff, G., Wucherpfennig, K. Ex vivo characterization and isolation of rare memory B cells with antigen tetramers. Blood. 118 (2), 348-357 (2011).
  7. Morris, L., et al. Isolation of a human anti-HIV gp41 membrane proximal region neutralizing antibody by antigen-specific single B cell sorting. PLoS One. 6 (9), e23532(2011).
  8. Iizuka, A., et al. Identification of cytomegalovirus (CMV)pp65 antigen-specific human monoclonal antibodies using single B cell-based antibody gene cloning from melanoma patients. Immunol Lett. 135 (1-2), 64-73 (2011).
  9. Ouisse, L. H., et al. Antigen-specific single B cell sorting and expression-cloning from immunoglobulin humanized rats: a rapid and versatile method for the generation of high affinity and discriminative human monoclonal antibodies. BMC Biotechnol. 17 (1), 3(2017).
  10. Kerkman, P. F., et al. Identification and characterisation of citrullinated antigen-specific B cells in peripheral blood of patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. , (2015).
  11. Hamilton, J. A., et al. General Approach for Tetramer-Based Identification of Autoantigen-Reactive B Cells: Characterization of La- and snRNP-Reactive B Cells in Autoimmune BXD2 Mice. J Immunol. 194 (10), 5022-5034 (2015).
  12. Sanjuan Nandin, I., et al. Novel in vitro booster vaccination to rapidly generate antigen-specific human monoclonal antibodies. J Exp Med. , (2017).
  13. Bowers, P. M., et al. Mammalian cell display for the discovery and optimization of antibody therapeutics. Methods. 65 (1), 44-56 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح


Formal Correction: Erratum: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood
Posted by JoVE Editors on 4/01/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood.

The Affiliations section was corrected from:

Marie-Claire Devilder1,2, Mélinda Moyon1,2, Xavier Saulquin1, Laetitia Gautreau-Rolland1
1Centre Régional de Recherche en Cancérologie et Immunologie Nantes/Angers, INSERM 1232, LabEx IGO, Université de Nantes
2CHU Nantes

to:

Marie-Claire Devilder1,2,3, Mélinda Moyon1,2,3, Xavier Saulquin1,2, Laetitia Gautreau-Rolland1,2 
1CRCINA, Inserm, CNRS, Université d'Angers, Université de Nantes
2LabEx IGO, "Immunotherapy, Graft, Oncology"
3CHU, Nantes, France

الوسوم

الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطيتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي للخلية الواحدةفرز القياس التدفق الخلويرباعيات HLA-A2/Pp65الفصل بالخرزات المغناطيسية الدقيقةمقايسة الإنزيم المرتبط المناعيرنين البلازمون السطحيتضخيم جين الغلوبيولين المناعي
جيل من التمييزية مونوكلونل البشرية من خلايا نادرة محددة مستضد ب المتداولة في الدم
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.