Method Article

الجمع بين الخلية الانقسامية المزامنة وعالية الدقة [كنفوكل] الفحص المجهري لدراسة دور البروتينات المتعددة الوظائف دورة الخلية أثناء الانقسام

DOI:

10.3791/56513

⸱

December 5th, 2017

 , 
1Department of Cell and Molecular Biology, Feinberg School of Medicine, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم بروتوكولا للتزامن thymidine مزدوجة من خلايا هيلا متبوعاً بالتحليل باستخدام دقة عالية [كنفوكل] مجهرية. هذا الأسلوب هو المفتاح للحصول على عدد كبير من الخلايا التي تشرع شكل متزامن من مرحلة ثانية للانقسام، تمكين الدراسات المتعلقة بأدوار الانقسامية من البروتينات المتعددة الوظائف التي تمتلك أيضا مهام الطور البيني.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتقدم الدراسة مختلف الأحداث التنظيمية لدورة الخلية بطريقة تعتمد على مرحلة فهم واضح حول نمو الخلايا وشعبة. تزامن السكان خلية في مراحل معينة من دورة الخلية قد وجد أن تكون مفيدة جداً في مثل هذه المساعي التجريبية. المزامنة للخلايا بالعلاج بالمواد الكيميائية التي نسبيا أقل سمية يمكن أن تكون مفيدة عبر استخدام العقاقير الدوائية المثبطة لدراسة دورة الخلية ما يترتب عليها من أحداث، والحصول على إثراء محددة المراحل الانقسامية المحدد. هنا، يمكننا وصف البروتوكول لمزامنة الخلايا البشرية في مراحل مختلفة من الخلية دورة، بما في ذلك على حد سواء في مرحلة ثانية وم مع كتلة thymidine مزدوجة والإصدار الداخلي لدراسة الأداء الوظيفي للبروتينات الانقسامية في محاذاة كروموسوم والعزل. هذا البروتوكول كانت مفيدة للغاية لدراسة أدوار الانقسامية من البروتينات المتعددة الوظائف التي تملك وظائف ثابتة الطور البيني. في حالتنا، الانقسامية دور Cdt1، بروتين حاسمة بالنسبة للنسخ المتماثل الترخيص الأصلية في المرحلة G1، يمكن دراسة فعالية إلا عندما يمكن أن تنضب Cdt1 G2/M-محددة. ونحن تصف البروتوكول مفصلاً لاستنفاد Cdt1 G2/M-خاصة باستخدام المزامنة thymidine مزدوجة. ونحن أيضا تفسير البروتوكول لتثبيت الخلية، ويعيش تصوير الخلية استخدام الفحص المجهري [كنفوكل] عالية الدقة بعد الإفراج عن thymidine. الأسلوب أيضا مفيدة لتحليل وظيفة البروتينات الانقسامية في ظل الظروف الفسيولوجية والقلق على حد سواء كما هو الحال ل Hec1، مكون من Ndc80 المعقدة، كما أنها تمكن واحد للحصول على أحجام عينات كبيرة من الخلايا الانقسامية للخلايا الثابتة ويعيش تحليل كما نعرض هنا.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دورة الخلية، الخلايا الخضوع لسلسلة من الأحداث عالية التنظيم والتي تسيطر عليها وقتيا لازدواجية دقيقة للجينوم والانتشار. في الثدييات، تتألف من الطور البيني والمرحلة م دورة الخلية. في الطور البيني، الذي يتكون من ثلاث مراحل-G1, S، و G2، الخلية التكرارات الجينوم ويخضع النمو اللازمة لدورة الخلية العادية التقدم1،2. في المرحلة م، الذي يتألف من الانقسام (الطور الأول، بروميتافاسي، الطورية، طور الصعود والطور النهائي) وسيتوكينيسيس، تنتج خلية أبوية خليتين ابنه متطابقة وراثيا. في الانقسام، الأخت شقاً الصبغي للجينوم المكررة مكثف (الطور الأول)، ويتم التقاطها في كينيتوتشوريس واسطة microtubules المغزل التفتلي المجمعة (بروميتافاسي)، أن يدفع اتساقها في لوحة الطورية (الطورية) تليها بهم يساوي التفرقة عند الأخت انقسام تجاه شقاً الصبغي ونقلها إلى محور الدوران المعاكس أعمدة (طور الصعود). يتم فصل الخليتين ابنه جسديا بنشاط على أساس أكتين الهوس عصابة (الطور النهائي و cytokinesis). Kinetochore البنية البروتينية متخصصة التي تجمع في منطقة سينتروميريك من شقاً الصبغي وتكون بمثابة مواقع الحجز المغزل microtubules. وظيفتها الرئيسية هي محرك التقاط كروموسوم، والمحاذاة، والمساعدة في تصحيح مرفق microtubule شوكي غير لائق، بينما الوساطة الحاجز الجمعية المغزل للحفاظ على الإخلاص كروموسوم الفصل3،4.

تقنية التزامن الخلية بمثابة أداة مثالية لفهم الأحداث الجزيئية والهيكلية تشارك في تقدم دورة الخلية. وقد استخدمت هذا النهج إثراء سكان الخلية في مراحل محددة لأنواع مختلفة من التحليلات، بما في ذلك إنشاء تشكيل جانبي للتعبير الجيني، تحليلات للعمليات الكيميائية الحيوية الخلوية، والكشف عن التعريب سوبسيلولار من البروتينات. يمكن استخدام خلايا الثدييات متزامنة لدراسة المنتجات الجينات الفردية، بل أيضا للنهج التي تنطوي على تحليل الجينوم كله بما في ذلك تحليل الجينات التعبير5، ميرنا أنماط التعبير6، ميكرواري تنظيم متعدية الجنسيات7، وتحليل البروتين البروتين التعديلات8. يمكن أيضا استخدام المزامنة دراسة آثار التعبير الجيني أو البروتين تدق لأسفل أو المغلوب، أو المواد الكيميائية على تقدم دورة الخلية.

يمكن مزامنة الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية. الوسائل المادية والكيميائية تستخدم على نطاق واسع لتزامن الخلية. أهم المعايير لتزامن الخلية أن التزامن نونسيتوتوكسيك وعكسها. بسبب العواقب الخلوية الضارة المحتملة لمزامنة الخلايا وكلاء الدوائية، أساليب تعتمد على المواد الكيميائية يمكن أن تكون مفيدة لدراسة الأحداث الرئيسية الخلية دورة. على سبيل المثال، هيدروكسيوريا، أمفيديكولين، ميموسيني، ولوفاستاتين، يمكن استخدامها لمزامنة الخلية في المرحلة G1/S ولكن بسبب أثرها على المسارات البيوكيميائية التي تمنع، تفعيل آليات تفتيش دورة الخلية وتقتل هام جزء من ال9،الخلايا10. من ناحية أخرى، يمكن القبض على تثبيط التغذية المرتدة من تكرار الحمض النووي عن طريق إضافة thymidine إلى وسائط النمو، المعروفة باسم "كتلة thymidine"، دورة الخلية في بعض النقاط11،،من1213. يمكن أيضا مزامنة الخلايا في المرحلة G2/M بالتعامل مع نوكودازولي و9،رو-330614. وقد نوكودازولي، مما يمنع الجمعية ميكروتوبولي، سيتوتوكسيسيتي عالية نسبيا. وعلاوة على ذلك، يمكن إرجاع القبض على نوكودازولي الخلايا الطور البيني بريكوسيوسلي بانزلاق الانقسامية. ضعف thymidine كتلة القبض على الخلايا في المرحلة G1/S وبعد الإفراج عنهم من الكتلة، تم العثور على خلايا المضي في شكل متزامن عن طريق G2 وإلى الانقسام. ويمكن ملاحظة التقدم العادي لدورة الخلية للخلايا من كتلة thymidine تحت المجهر [كنفوكل] عالية الدقة قبل تثبيت الخلية أو تصوير حية. يمكن دراسة أثر اضطراب البروتينات الانقسامية على وجه التحديد عند إدخال الخلايا والمضي قدما من خلال الانقسام بعد الإفراج عنهم من كتلة thymidine مزدوجة. تشارك في النسخ المتماثل الترخيص المنشأ في المرحلة G1 الحمض النووي Cdt1، بروتين متعددة الوظائف، وهي أيضا مطلوبة من أجل المرفقات ميكروتوبولي kinetochore أثناء الانقسام15. دراسة وظيفة Cdt1 أثناء الانقسام، يحتاج المرء اعتماد أسلوب أن يتجنب تأثير استنفادها في النسخ المتماثل الترخيص خلال المرحلة G1، بينما في الوقت نفسه أحداث استنفادها على وجه التحديد خلال مرحلة G2/M فقط. نقدم هنا، بروتوكولات مفصلة تستند إلى كتلة thymidine مزدوجة لدراسة دور البروتينات مهام متعددة أثناء المراحل المختلفة لدورة الخلية الانقسامية بالتصوير الثابت وخلية يعيش.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-ضعف كتلة Thymidine والإصدار: الاستعدادات الكاشف

  1. جعل 500 مل دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دميم) المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS والبنسلين والستربتوميسين.
  2. جعل الأسهم 100 مم من التريتيوم في الماء المعقم ومخزن في مختبرين في-80 درجة مئوية.

2-البروتوكول المتعلق بتصوير ثابت الخلية الانقسامية التدرج (الشكل 1A)

  1. في اليوم 1، البذور ~ 2 × 105 هيلا الخلايا في آبار لوحة 6-جيدا مع زلة الغطاء (تعقيم مع الإيثانول 70% واشعاع الأشعة فوق البنفسجية) و 2 مل من المتوسطة دميم. تنمو الخلايا في حاضنة هوميديفيد عن 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5% CO2.
  2. كتلة thymidineش 1: في اليوم 2، مزيج دقيق حجم المطلوب من التريتيوم في وسائط الإعلام دميم الطازجة (100 ملم الأسهم، 2 مم النهائي تركيز).
  3. إضافة 2 مل thymidine التي تحتوي على وسائط الإعلام إلى الخلايا في كل بئر 6-البئر لوحة واحتضانها ح 18.
  4. في يوم 3، نضح المتوسطة وتغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من 1 x PBS ومرة مع دميم بريوارميد جديدة؛ تنمو الخلايا في المتوسطة دميم بريوارميد جديدة ح 9 للإفراج عن الخلايا من كتلة.
  5. 2nd thymidine كتلة: أضف مرة أخرى مل 2 التي تحتوي على thymidine وسائل الإعلام (تركيز نهائي 2 مم) إلى الخلايا في كل من لوحة 6-جيدا جيدا.
  6. احتضانها لآخر ح 18.
  7. في يوم 4، نضح المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع 2 مل من 1 x PBS ومرة مع دميم بريوارميد الطازجة.
  8. سيرناس مخفف (التحكم و Cdt1) وكاشف تعداء في المصل النمو الحر المتوسط بشكل منفصل عن الحد الأدنى 10 مزجها معا واحتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت وكان تركيز siRNA المستخدمة في كل تعداء النهائي 100 نانومتر. إضافة خليط رد فعل للخلايا التي قد تم غسلها من أصل Thymidine.
  9. احتضان خلايا في 37 درجة مئوية ح 9-10 لإطلاق سراح من حظر وإصلاح الخلايا على كشوف الغطاء مع 4% منهاج العمل لمدة 20 دقيقة في الرايت
    تنبيه: منهاج العمل السامة، وارتداء الحماية المناسبة.
  10. خلايا إيمونوستين، بعد بيرميبيليزينج مع المنظفات 0.5% (v/v) لمدة 10 دقائق في الرايت وغسل الخلايا مرتين مع 1 x برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
    1. كتلة الخلايا مع جيش صرب البوسنة 1% (w/v) في برنامج تلفزيوني x 1 ح 1 في الرايت متبوعاً بعلاج الخلايا مع 50 ميليلتر من الأجسام الأولية (الماوس المضادة-α-tubulin جسم المخفف 1:1، 000 جسم Zwint1 مكافحة الأرانب المخفف 1: 400، والماوس المضادة-والرمات-ɣ H2AX المخفف في رافعة) في 1% (w/v) جيش صرب البوسنة في 1 x برنامج تلفزيوني عن ح 1 في 37 ياجيم
    2. بعد الغسيل خارج الخلايا مع برنامج تلفزيوني x 1 ثلاث مرات وعلاج الخلايا مع 50 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية لكل تغطية الزجاج (488 أليكسا والأحمر والرودامين في تخفيف 1: 250 في 1% (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني x 1) ح 1 في الرايت
    3. بعد الغسيل الخلايا مع PBS 1 x مرتين لمدة 5 دقائق، يعامل الخلايا مع DAPI (0.1µg/مل في برنامج تلفزيوني 1 x) لمدة 5 دقائق في الرايت
    4. بعد الغسيل الخلايا مع PBS 1 x مرتين لمدة 5 دقائق، ضع بكشف الغطاء تواجه الخلايا إلى وسائل الإعلام المناسبة المتصاعدة على شريحة مجهرية واضحة.
  11. صورة الخلايا للبروتينات إيمونوستاينيد مع 60 X أو النفط 1.4 X نا خطة اللازيغيه DIC 100 الغمر الهدف شنت على مجهر [كنفوكل] مقلوب عالية دقة مزودة كاميرا مناسبة اللازمة لنوعية الصور المطلوبة.
  12. الحصول على صور في درجة حرارة الغرفة كما z-رزمة سمك 0.2 ميكرون باستخدام البرمجيات المناسبة للمجهر.

3-بروتوكول لتصوير خلية حية لتطور الانقسامية (الشكل 3A)

  1. في يوم 1، البذور حوالي 0.5-1 × 105 خلايا هيلا ستابلي الإعراب عن H2B مشري وبروتينات فلورية خضراء-α-tubulin (متغير قليلاً استناداً إلى نوع من الخلايا والبروتينات وهم يعربون عن) إلى 35 ملم الزجاج أسفل الأطباق مع 1.5 مل متوسطة دميم وتنمو لهم في هوميديفيد حاضنة ح 24 37 سج و شركاه 5%2.
  2. كتلة thymidineش 1: في اليوم 2، إضافة 1.5 مل thymidine التي تحتوي على وسائط الإعلام إلى الخلايا في الطبق (thymidine 100 مم، وتركيز نهائي 2 مم،).
  3. احتضانها ح 18.
  4. في يوم 3، نضح المتوسطة التي تتضمن التريتيوم وتغسل الخلايا ثلاث مرات، مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1 x ومرة مع دميم بريوارميد الطازجة.
  5. سيرناس مخفف (التحكم و Hec1) وكاشف تعداء مع المصل النمو الحر المتوسط بشكل منفصل عن الحد الأدنى 10 مزجها معا واحتضان لمدة 20 دقيقة في الرايت وكان تركيز siRNA المستخدمة في كل تعداء النهائي 100 نانومتر. إضافة خليط رد فعل للخلايا التي قد تم غسلها من أصل Thymidine.
  6. تنمو الخلايا في 1.5 مل من الطازجة المتوسطة دميم بريوارميد ح 8 بالإفراج عن الخلايا من كتلة.
  7. 2nd thymidine كتلة: إضافة 1.5 مل thymidine التي تحتوي على وسائط الإعلام (تركيز نهائي 2 مم) إلى الخلايا في الطبق.
  8. احتضانها لآخر ح 18.
  9. في يوم 4، نضح المتوسطة وتغسل الخلايا ثلاث مرات، مرتين مع 2 مل من برنامج تلفزيوني 1 x ومرة مع دميم بريوارميد الطازجة. ثم تنمو خلايا في يبوفيتش بريوارميد جديدة المتوسطة (L-15) تستكمل مع 10% FBS و 20 مم حبيس في درجة الحموضة 7.0 ح 8 بالإفراج عن خلايا من الكتلة.
  10. ضع الطبق في قاعة مراقبة درجة الحرارة في المجهر [كنفوكل] عالية الدقة التي قد تحولت بالفعل على الأقل 30 دقيقة قبل البدء التصوير استقرار درجات الحرارة المسرح والتجريبية.
  11. التركيز في الحقل مشرق مع الهدف 60 x حتى تكون الخلايا مرئية، ثم فرزت يدوياً المسرح في المنطقة لاختيار.
  12. قم بإعداد الضوء والليزر الطاقة/التعرض، والمعلمات الحصول على صورة، ومدة التجربة باستخدام البرمجيات اكتساب صورة مجهر الاختيار. استخدام عوامل التصفية للتجارة والنقل (488 الإثارة؛ 385 nm الانبعاثات) ومشري (561 نانومتر الإثارة و 385 nm الانبعاثات) الحصول على الصور.
  13. إجراء التجربة مرور الزمن باكتساب نابض ضوء المنقولة بشكل منفصل والأسفار الصور كل 10 دقائق لمدة تصل إلى 16 ساعة.
  14. الحصول على الصور حسب الاقتضاء 1.0 اثنا عشر فصل ميكرومتر z-الطائرات في 9 ح بعد الإفراج عنهم من كتلة thymidine مزدوجة باستخدام البرمجيات للمجهر.
  15. تحليل الصور تتبع الخلايا الفردية للتقدم الانقسامية وأخيراً تجميع الفيلم المقابلة مع برمجيات المصدر فيجي/إيماجيج.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دراسة تطور الانقسامية والاستقرار ميكروتوبولي في الخلايا الثابتة بعد الإفراج عنهم من ضعف thymidine كتلة
وتشارك Cdt1 في منح التراخيص لأصول النسخ المتماثل الحمض النووي في المرحلة G1. تتحلل خلال المرحلة S ولكن إعادة يتراكم في المرحلة G2/M. لدراسة دورها في الانقسام، يحتاج Cdt1 الذاتية أن تستنفد على وجه التحديد إلى المرحلة ز/م باستخدام تقنية التزامن الخلية الأكثر ملاءمة، thymidine مزدوجة القطعة15. تم transfected الخلايا مع سيرناس فورا بعد الإفراج عنهم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأكثر أهمية وميزة التزامن thymidine مزدوج أنه يوفر عينة زيادة حجم الخلايا الانقسامية في إطار زمني قصير مع العديد من هذه الخلايا تدخل الانقسام في انسجام، مما يمكن أيضا تحليلات لمحاذاة كروموسوم، ثنائي القطب مغزل تشكيل، والعزل الصبغي بكفاءة أعلى كثيرا.

العديد من مجمعات البروتين التنظيمي ومسارات الإشارات مكرسة لضمان تطور طبيعي عن طريق الانقسام وإلغاء الضوابط التنظيمية لهذه العملية قد أدت إلى توموريجينيسيس. ويعيش تصوير خلية من خلايا هيلا ستابلي الإعراب عن H2B مشري والتجارة والنقل-tubulin وأفرج عنه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم أي مصلحة مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للدكتور كوزو تاناكا من جامعة توهوكو باليابان لتقاسم خلايا هيلا ستابلي الإعراب عن H2B مشري--هيستون وبروتينات فلورية خضراء-α-توبولين. وأيد هذا العمل بمنحه لجنة التحقيق الوطنية إلى العنف المنزلي (R00CA178188) ومن أموال بدء التشغيل من جامعة نورث وسترن.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (1x)Life Technologies11965-092Store at 4 & deg; C
DPBS (1x)Life Technologies14190-144Store at 4 & deg; سي
ليبوفيتز s (1x) L-15 تقنيات العمر المتوسط21083-027مخزن عند 4 درجات ؛ C
مصل متوسط مخفض (Opti-MEM)Life Technologies319-85-070يخزن في 4 درجات ؛ C
البنسلين والستربتومايسينتقنيات الحياة15070-063 (Pen Strep)1: 1,000 التخفيف
Dharmafect2GE DharmaconT-2002-02Store at 4 & deg; C
ThymidineMP Biomedicals LLC103056مذابة في مياه معقمة
Cdt1 siRNALife Technologiesالمرجع 10
Hec1 siRNALife Technologiesالمرجع 13
خلية HeLa تعبر عن GFP-H2B
خلايا HeLa التي تعبر عن GFP-& alpha;-tubulin و mCherry H2Bهدية سخية من الدكتور كوزو تاناكا من توهوكو الجامعة ، اليابان
محلول الفورمالديهايدSigma-Aldrich CorporationF8775سامة ، يحتاج إلى الحذر
DAPISigma-Aldrich CorporationD9542Toxic ، يحتاج إلى الحذر
الفأر المضاد لألفا التوبولينسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةSc322931: 1،000 تخفيف
أرنب النمل Zwint1BethylA300-781A1: 400 تخفيف
الفأر المضادة للفوسفو - جاما. H2AX (Ser139)Upstate Biotechnology05-626 ، استنساخ JBW3011:300 تخفيف
Alexa 488Jackson ImmunoResearch1: 250 تخفيف
Rodamine Red-XJackson ImmunoResearch1: 250 تخفيف
BioLite 6 بئر متعدد الأطباقThermo Fisher Scientific130184
35 مم طبق زجاجي قاعMatTek CorporationP35GCOL-1.5-14-C
نيكون Eclipse TiE مجهر مقلوبنيكون إنسترومنتس
نيكون قرص الغزل لكاميرايوكاجاواCSU-X1
Ultra 888 EM-CCDكاميرا AndoriXon Ultra EMCCD
4 ليزر بطول موجةنظام حضانة تقنيات
للمجاهرTokai HitTIZB
برنامج عناصر NIS: نيكون إنسترومنتس
متحد البؤر Agilent

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lajtha, L. G., Oliver, R., Berry, R., Noyes, W. D. Mechanism of radiation effect on the process of synthesis of deoxyribonucleic acid. Nature. 182 (4652), 1788-1790 (1958).
  2. Puck, T. T., Steffen, J. Life Cycle Analysis of Mammalian Cells. I. A Method for Localizing Metabolic Events within the Life Cycle, and Its Application to the Action of Colcemide and Sublethal Doses of X-Irradiation. Biophys. J. 3, 379-392 (1963).
  3. Santaguida, S., Musacchio, A. The life and miracles of kinetochores. EMBO J. 28 (17), 2511-2531 (2009).
  4. Musacchio, A., Desai, A. A Molecular View of Kinetochore Assembly and Function. Biology (Basel). 6 (1), E5(2017).
  5. Chaudhry, M. A., Chodosh, L. A., McKenna, W. G., Muschel, R. J. Gene expression profiling of HeLa cells in G1 or G2 phases. Oncogene. 21 (12), 1934-1942 (2002).
  6. Zhou, J. Y., Ma, W. L., Liang, S., Zeng, Y., Shi, R., Yu, H. L., Xiao, W. W., Zheng, W. L. Analysis of microRNA expression profiles during the cell cycle in synchronized HeLa cells. BMB Rep. 42 (9), 593-598 (2009).
  7. Stumpf, C. R., Moreno, M. V., Olshen, A. B., Taylor, B. S., Ruggero, D. The translational landscape of the mammalian cell cycle. Mol. Cell. 52 (4), 574-582 (2013).
  8. Chen, X., Simon, E. S., Xiang, Y., Kachman, M., Andrews, P. C., Wang, Y. Quantitative proteomics analysis of cell cycle-regulated Golgi disassembly and reassembly. J. Biol. Chem. 285 (10), 7197-7207 (2010).
  9. Rosner, M., Schipany, K., Hengstschläger, M. Merging high-quality biochemical fractionation with a refined flow cytometry approach to monitor nucleocytoplasmic protein expression throughout the unperturbed mammalian cell cycle. Nature Protocols. 8 (3), 602-626 (2013).
  10. Coquelle, A., et al. Enrichment of non-synchronized cells in the G1, S and G2 phases of the cell cycle for the study of apoptosis. Biochem. Pharmacol. 72 (11), 1396-1404 (2006).
  11. Amon, A. Synchronization procedures. Methods Enzymol. 351, 457-467 (2002).
  12. Cooper, S. Rethinking synchronization of mammalian cells for cell cycle analysis. Cell Mol. Life Sci. 60 (6), 1099-1106 (2003).
  13. Whitfield, M. L., Sherlock, G., Saldanha, A. J., Murray, J. I., Ball, C. A., Alexander, K. E., Matese, J. C., Perou, C. M., Hurt, M. M., Brown, P. O., Botstein, D. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol. Biol. Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  14. Vassilev, L. T., et al. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (28), 10660-10665 (2006).
  15. Varma, D., Chandrasekaran, S., Sundin, L. J., Reidy, K. T., Wan, X., Chasse, D. A., Nevis, K. R., DeLuca, J. G., Salmon, E. D., Cook, J. G. Recruitment of the human Cdt1 replication licensing protein by the loop domain of Hec1 is required for stable kinetochore-microtubule attachment. Nat. Cell Biol. 14 (6), 593-603 (2012).
  16. Garcia, M., Westley, B., Rochefort, H. 5-Bromodeoxyuridine specifically inhibits the synthesis of estrogen-induced proteins in MCF7 cells. Eur. J. Biochem. 116 (2), 297-301 (1981).
  17. Bostock, C. J., Prescott, D. M., Kirkpatrick, J. B. An evaluation of the double thymidine block for synchronizing mammalian cells at the G1-S border. Exp. Cell Res. 68 (1), 163-168 (1971).
  18. Martin-Lluesma, S., Stucke, V. M., Nigg, E. A. Role of Hec1 in spindle checkpoint signaling and kinetochore recruitment of Mad1/Mad2. Science. 297, 2267-2270 (2002).
  19. Brouwers, N., Mallol Martinez, N., Vernos, I. Role of Kif15 and its novel mitotic partner KBP in K-fiber dynamics and chromosome alignment. PLoS One. 12 (4), e0174819(2017).
  20. Dou, Z., et al. Dynamic localization of Mps1 kinase to kinetochores is essential for accurate spindle microtubule attachment. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), E4546-E4555 (2015).
  21. Chan, Y. W., Jeyaprakash, A. A., Nigg, E. A., Santamaria, A. Aurora B controls kinetochore-microtubule attachments by inhibiting Ska complex-KMN network interaction. J Cell Biol. 196 (5), 563-571 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitotic Cell SynchronizationHigh Resolution Confocal MicroscopyDouble Thymidine BlockCell Cycle AnalysisMitotic Protein FunctionChromosome Alignment SegregationCdt1 Depletion ProtocolHec1 Kinetochore AnalysisLive Cell ImagingFixed Cell Analysis

Related Articles