يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في المختبر قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي

7.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/56550

⸱

ديسمبر 20, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Albrecht-Kossel-Institute, University Rostock Medical Center, 2Department of Biology, University Federico II, 3Centogene AG

في هذه المقالة

ملخص

وهناك طلب لجعل ما قبل السريرية الاختبار لفئة رواية اليتيمة "المخدرات يسمى مرافقين الدوائي استنساخه وسريعة وفعالة. وضعنا مقايسة على أساس الثقافة خلية بسيطة وموحدة شديدة وتنوعاً على الشاشة للمرضى المؤهلين، فضلا عن العقاقير وصي الدوائي الرواية.

الملخص

استخدام الأدوية المخصصة لعلاج الأمراض مونوجينيك النادرة مثل اضطرابات التخزين الليزوزومية (النساء) هو تحدي التصاميم المحاكمة السريرية المعقدة وتكاليف عالية، وانخفاض عدد المرضى. مئات الآليلات متحولة متورطة في معظم النساء. الأمراض التي تصنف عادة إلى 2 إلى 3 أنواع سريرية مختلفة حسب شدتها. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يساعد التوصيف الجزيئي للنمط الوراثي التنبؤ بالنتائج السريرية وأبلغ العناية بالمرضى. ولذلك، قمنا بتطوير مقايسة ثقافة خلية بسيطة تستند إلى خلايا HEK293H هيتيرولوجوسلي الإفراط معربا عن الطفرات تم تحديدها في مرض فابري وبومبي. قد أدخلت مؤخرا مقايسة مماثلة كاختبار الإكلينيكية التعرف على الطفرات قابلة للعلاج وصي الدوائية (PCT) في مرض فابري. ويصف هذه المخطوطة مقايسة ثقافة خلية معدلة التي تمكن من تقييم المظهرية السريع للمتغيرات الجينية في مرض فابري وبومبي لتحديد المرضى المؤهلون للمعاهدة وقد تساعد في تطوير فارماكوتشابيرونيس الرواية.

المقدمة

هناك أكثر من اثنتي عشرة التخزين الليزوزومية اضطرابات (النساء) تتصل بالخلل جليكوسيداسي نتيجة للطفرات الجينية الأولية. فابري (OMIM #301500) ومرض بومبي (OMIM #232300)، أكثر من 500 و 200 من الطفرات مغلطه وأبلغ1،2،3 ، على التوالي، التي تتطابق مع حوالي 60 في المائة العدد الإجمالي طفرة. لا يزال يجري تحديد العديد من المتغيرات الجينات الجديدة، والكثير منها معروف أهمية. كشفت دراسات مستفيضة البيوكيميائية أن بعض الأنماط الجينية لا تؤدي إلى فقدان-من-وظيفة كاملة من الجينات GLA (OMIM * 300644) في مرض فابري، بل تسبب الإنزيم المقابلة إلى فشل في الوصول إلى حالة قابلة لطي [ثرمودنميكلي] يفضل4 . هذه النتائج في استبقاء ER وتدهور سابق لأوانه إنزيم الفنية خلاف ذلك. قد تم استخلاص استنتاجات مماثلة في سائر النساء بما في ذلك مرض بومبي5. وعلاوة على ذلك، يمكن تسهيل التوصيف الجزيئي للمتغيرات إنزيم التفسير السريري للطفرات في وقت التشخيص6، مما يوحي بأن تطور LSD عملية فردية استناداً إلى طبيعة الطفرة. ولذلك، ينبغي إعادة تقييم التصنيف التقليدية إلى أنواع سريرية مختلفة عادة ما بين 2 إلى 3 بغية تبسيط المشورة الطبية والقرارات العلاجية.

العلاج باستبدال إنزيم (ERT) متاح لكلا المرضين. بيد أن فريق خبراء الاستعراض، قد محدودة فعالية في الأنسجة/الأجهزة المتأثرة مثل الدماغ والعضلات. وعلاوة على ذلك، يمكن الحصول على فريق خبراء الاستعراض استجابة مكسبه يهدد فوائدها العلاجية. المحرمين الدوائية (أجهزة كمبيوتر) بديل جذابة علاج للمرضى المصابين بما يسمى الطفرات استجابة. أجهزة الكمبيوتر بمثابة سقالة جزيئية لطي البروتين الصحيح وتحقيق الاستقرار الذي يمنع بدوره الاحتفاظ هيولى (ER) وتدهور الإنزيم المرتبطة ER. وعلاوة على ذلك، أجهزة الكمبيوتر يمكن أن تدار شفويا، ويحتمل أن تكون قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغ. ولذلك، قد تكون المعاهدة خياراً قابلاً للتطبيق أكثر لعلاج المرضى الذين يعانون من بعض الأنماط الجينية. لاستعراض مستفيض في تطبيق الكمبيوتر في النساء، الرجوع إلى استعراض ممتازة بارينتي7.

اكتشاف مئات أمراض التي تسبب الآليلات متحولة التحديات اختبار المخدرات قبل الإكلينيكية ويستلزم إجراء تقييم بسيطة وسريعة وعالية موحدة للمرضى قابلة للأخذ بنهج طب شخصية. من أجل تقييم الآثار الضارة للطفرات الجينية LSD واختبار الطفرات المرشح للتنبؤ المرضى قابلة للبراءات، كان نظام تعبير المفرط موحدة عالية في خلايا HEK293H التي تسمح بقياس نشاط الإنزيم سريعة وموثوق بها البلدان المتقدمة النمو. نظم التعبير المفرط مماثلة قد وصفت سابقا لمرض فابري وبومبي باستخدام أما كوس-78،9،،من1011أو خلايا هيلا12أو HEK29313 14، ،،من1516 الخلايا للجينات جليكوسيداسي.

طريقة مشابهة جداً، حتى تم تسجيل براءة اختراع "وسيلة للتنبؤ باستجابة للعلاج الدوائي والوصيفة من الأمراض"17 تشير إلى أهمية خلية ثقافة نظام قادر على إدماجها في الممارسة السريرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد المسخ الثوابت pcDNA3.1/GLA و pcDNA3.1/جا

ملاحظة: استراتيجيات الاستنساخ ل GLA و جا الترميز تسلسل (cds) قد تم الإبلاغ عنها سابقا15،18.

  1. توجه موقع الطفرات استخدام الطفرات توجه الموقع
    1. استخدام المرجع تسلسل NM_000169.2 و NM_000152.4 كقوالب للطفرات الجينات GLA و أكاديمية ، على التوالي. لديك مجموعة من الإشعال درجة نقاء عالية مجانية الملح (25-37-الصرف) توليفها من قبل موفر تجارية، مع الإشعال الإحساس و antisense يحمل واحدة من التعديلات كل تسلسل المركزية على طول الأخذ بشكل فردي الطفرة. استخدام أداة تصميم التمهيدي مجانية لدعم تصميم التمهيدي19.
    2. الخليط رد فعل، استخدام الشروط القياسية لحل رد فعل وظروف PCR توفيرها من قبل الشركة المصنعة.
      1. مزيج 5 ميليلتر من 10 س رد فعل المخزن المؤقت، 10 نانوغرام من قالب مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل بلازميد الحمض النووي (pcDNA3.1/GLA أو pcDNA3.1/جا)، 125 نانوغرام لكل التمهيدي، 1 ميليلتر من خليط دنتب المقدمة، 3 ميليلتر من كاشف [دمس] في وحدة تخزين مناسبة للمياه (حجم الرد النهائي : 50 ميليلتر). وأخيراً، إضافة 2.5 "يو دنا" بوليميريز ومزيج من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. كعنصر تحكم سلبية، تحمل على طول عينة لا التمهيدي.
    3. بدء تشغيل الاسترداد استخدام البرنامج التالي: الخطوة 1:95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، الخطوة 2:95 درجة مئوية لمدة 50 ثانية، الخطوة 3:60 درجة مئوية لمدة 50 s, الخطوة 4:68 درجة مئوية لمدة 8 دقائق، كرر الخطوة 2-4 18 مرة، والخطوة 5:68 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
      1. بكر، بعد إضافة 1 ميليلتر من Dpnأنا إنزيم التقييد (يو 10/ميليلتر) وكذلك احتضان القنينة رد الفعل عند 37 درجة مئوية ح 1.
  2. التحول والفرز لاستنساخ المطلوب
    1. تحويل قاسمة للخلايا أولتراكومبيتينت وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. استخدام شركة نفط الجنوب متوسطة (تريبتوني 2% (w/v)، الخميرة استخراج 0.5% (w/v)، كلوريد الصوديوم 10 مم، بوكل 2.5 ملم، وتعقيم في 121 درجة مئوية ثم قم بإضافة الحلول العقيمة التي تمت تصفيتها مجكل2 والسكر حتى التركيزات النهائية 10 و 20 مم، على التوالي) بدلاً من الشركة المصنعة المتوسطة. بعد هذا الإجراء، لوحة 250 ميليلتر من الطفرات عينة على رطل لوحة تحتوي على 100 الأمبيسلّين ميكروغرام/مل واحتضان في 37 درجة مئوية ح 18.
    2. أؤكد أن عدد ترانسفورمانتس > 10 ورد فعل غلة على الأقل ثلاثة إضعاف هذا العدد المستعمرات كمراقبة التمهيدي لا رد فعل، مثلاً، استخدام لوحة مضيئة لتسهيل عد مستعمرة. ثم اختيار 3 مستعمرات وإعداد 3 مل الثقافات بين عشية وضحاها في متوسطة مرق رطل.
    3. في اليوم التالي، القيام بإعداد بلازميد مع مجموعة قياسية وتحليل تسلسل كامل باستخدام T7 (5ʹ-ﻷعمالهم تاك GAC TCA كبار المستشارين التقنيين العلامة زز-3ʹ) وترتيب الإشعال بغر (5ʹ-العلامة AAG الائتلاف كاج TCG AGG-3ʹ) عبر سانجر القياسية.
    4. استخدم أداة مناسبة في مجال بيولوجيا الجزيئية لتحليل التسلسل. عندما يتم الكشف عن الطفرة المنشودة ولا كذلك تسلسل الشذوذ بالمقارنة مع NM_000169.2 (α-جالاكتوسيداسي A) أو NM_000152.4 (حمض α-glucosidase) وينظر، حدد الاستنساخ لتنقية بلازميد تعداء-الصف.
    5. تحديد نقاء الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص في جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: تسمح فقط الأعمال التحضيرية التي تعطي درجة نقاء بلازميد مع نسبة امتصاص 260/280 من > 1.8 لخلية ثقافة التجارب.

2-زراعة الخلايا HEK293H

  1. الحفاظ على خلايا HEK293H في ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام/لتر) Dulbecco´s التعديل النسر المتوسطة (دميم) تستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) والبنسلين/ستربتوميسين 1%. إبقاء الخلايا واتيرجاكيت حاضنة في 37 درجة مئوية تحت جو2 CO 5%.
  2. زراعة الخلايا لكثافة 80-90%.
  3. نضح المتوسطة ويغسل مرة واحدة باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون Ca2 + و Mg2 +.
  4. مرور عن طريق إضافة 0.05% يدتا التربسين واحتضان لمدة 5 دقائق في أول أكسيد الكربون 37 درجة مئوية و 5%2.
  5. تقسيم الخلايا 01:15 في المتوسط الطازجة والبذور قارورة T75 جديدة للحفاظ على ثقافة دائمة. لا تستخدم الخلايا مع أكثر من 25 من الممرات.

3-pcDNA3.1/GLA و pcDNA3.1/جا تعداء بلازميد والعلاج HEK293H

  1. 24 ساعة قبل تعداء، يغسل خلايا HEK293H قارورة ثقافة الخليوي T75 مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مع Ca2 +, Mg2 +. حصاد الخلايا مع 0.05% يدتا التربسين كما ورد أعلاه والبذور 1.5 × 105 خلايا في التجاويف للثقافة جيدا 24 لوحة باستخدام 500 ميليلتر دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS دون المضادات الحيوية.
  2. تنفيذ بروتوكول تعداء وفقا للدليل الخاص بالشركة المصنعة. عادة، استخدام خليط من 1 ميكروغرام بلازميد الحمض النووي و 2.5 ميليلتر من تعداء الكاشف في 100 ميليلتر من دميم خالية من المصل. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإضافة إلى الخلايا بطريقة دروبويسي بعد ذلك.
  3. إزالة المتوسطة المحتوية على الكاشف تعداء بعد فترة من ح 4 في 37 °C/5% CO2 وإضافة 500 ميليلتر من دميم الطازجة مع 10% FBS/1% البنسلين/ستربتوميسين.
    ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، هيدروكلوريد 1-ديوكسيجالاكتونوجيريميسين (DGJ) أو هيدروكلوريد 1-ديوكسينوجيريميسين (دنج) يمكن أن تضاف إلى المتوسطة الثقافة حيث يقصد بها (استخدام حلاً مخزون مائي من 10 ملم من أجل الحصول على تركيز نهائي من 20 ميكرومتر DGJ ودنج ). تمت إضافة جديدة DGJ أو دنج ح 42 بعد تعداء بلازميد.

4-الخلية الحصاد و α-جالاكتوسيداسي A أو قياس نشاط حمض α-glucosidase

  1. الحصاد الخلية
    1. في يوم الحصاد، إزالة الخلايا من الحاضنة ونضح المتوسطة. أغسل بعناية الخلايا 2 مرات مع برنامج تلفزيوني مع Ca2 + و Mg2 +.
      ملاحظة: هذه الخطوة الحاسمة لأن DGJ ودنج مثبطات قوية من α-جالاكتوسيداسي و α-جلوكوسيداسي، على التوالي، وسوف يبطل أي بقايا الاختبار.
    2. إضافة 200 ميليلتر من المياه مباشرة فوق الخلايا. شطف الخلايا من اللوحة وتحويلها إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل.
  2. تجانس بالتجميد والذوبان
    1. وضع العينات في الرف الرغوة المناسبة ودوامه 5 s جعل تحلل أكثر كفاءة. وضع العينات التي تعقد بالتناوب في النتروجين السائل لمدة 10 ق وفي حمام مائي في درجة حرارة الغرفة حتى ذوبان الجليد الكامل (5 دقائق).
    2. كرر هذا الإجراء 5 مرات وثم تدور هذه العينات لمدة 5 دقائق في 10,000 س ز.
الإبقاء على المادة طافية وماصة في أنبوب رد فعل جديد.
  • تحديد تركيز البروتين باستخدام مقايسة حمض (اتفاق التعاون الأساسي) بيسينتشونينيك
    1. إعداد أنبوب جديد لكل عينة تحتوي على 40 ميكروليتر منزوع ح2س وإضافة 10 ميكروليتر من عينة. مزيج الحل قبل فورتيكسينج بإيجاز ونقل 10 ميليلتر في تجويف صفيحة جيدا 96 (كل عينة في ثلاث نسخ). تمييع حل أسهم ألبومين المصل بقرى (BSA) 2 مغ/مل في منزوع ح2س كما يلي للحصول على منحنى قياسي: 50 ميليلتر ح2O/50 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ 60 ميليلتر ح2ميليلتر س/40 جيش صرب البوسنة؛ ميليلتر 70 ح2س/30 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ ميليلتر 80 ح2س/20 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ ميليلتر 90 ح2س/10 ميليلتر جيش صرب البوسنة؛ 100 ميليلتر ح2o.
    2. ابدأ الرد بإضافة 200 ميليلتر من اتفاق التعاون الأساسي كاشف (كاشف أ وكاشف ب المختلطة بنسبة 50: 1) واحتضانها ح 1 في الظلام في 37 درجة مئوية تحت الانفعالات طفيف في شاكر مداري (300 لفة في الدقيقة). قياس امتصاص في 560 نانومتر في قارئ لوحة.
      ملاحظة: تتضمن العينات عادة بين 1 والبروتين 1.5 ميكروغرام لكل ميليلتر.
  • قياس نشاط الإنزيم مع ركائز اصطناعية 4-ميثيلومبيليفيريل (4-القدح)
    1. إضعاف المبلغ المحسوب لكل عينة وبيبيت في أنابيب جديدة 1.5 مل رد فعل الحصول على 0.05 (لألف α-جالاكتوسيداسي) أو 0.5 (لحمض α-glucosidase) ميكروغرام/ميليلتر البروتين الحلول. كذلك لوحة العينات 5 s مرة أخرى وبيبيت 10 ميليلتر من هذا التخفيف إلى 96 دوامة (كل عينة في مكررة).
    2. ابدأ رد فعل بإضافة 20 ميليلتر من الحل الركيزة الخاصة بكل منها:
      ل α-جالاكتوسيداسي ج: 2 مم 4-ميثيلومبيليفيريل-α-د-جالاكتوبيرانوسيدي (4-مو-غال) 0.06 م الفوسفات سترات المخزن المؤقت، 4.7 درجة الحموضة.
      لحمض α-glucosidase: 2 مم 4-ميثيلومبيليفيريل α-د-جلوكوبيرانوسيدي (4-مو-غلو) في م 0.025 خلات الصوديوم، pH 4.0.
    3. احتضان ردود فعل الإنزيم ح 1 في الظلام في 37 درجة مئوية تحت الانفعالات طفيف في شاكر مداري (300 لفة في الدقيقة). إنهاء رد فعل بإضافة 200 ميليلتر 1.0 متر، الرقم الهيدروجيني 10.5 المعدلة جليكاين-هيدروكسيد الصوديوم العازلة.
    4. إعداد منحنى قياسي من 4-ميثيلومبيليفيروني (4-مو) من 0.01 ملغ/مل أسهم على النحو التالي:
      100 ميليلتر ح2س/لا مو 4؛ 80 ميليلتر ح2س/20 ميليلتر 4-مو؛ 60 ميليلتر ح2س/40 مو 4 ميليلتر؛ 40 ميكروليتر ح2س/60 ميليلتر 4-مو؛ 20 ميليلتر ح2س/80 مو 4 ميليلتر؛ لا ح2س/100 ميليلتر 4-مو، بيبيت 10 ميليلتر من كل تمييع في البئر 96 لوحة (في تكرارات) وإضافة 200 ميليلتر من المخزن المؤقت جليكاين-هيدروكسيد الصوديوم 1.0 متر لكل بئر من أجل ضبط حجم ودرجة الحموضة.
    5. قياس نشاط الإنزيم في قارئ الأسفار مزودة بعامل التصفية المناسب تعيين وتحليل البيانات باستخدام البرنامج المناسب لجهاز قارئ الأسفار.
      ملاحظة: كل ركائز 4-القدح تخفض إلى 4-مو خلال التعرض إلى α-جالاكتوسيداسي A أو حمض α-جلوكوسيداسي. 4-مو المفرج عنهم هو فلوروتشرومي، الذي يمكن أن يقاس في 360 و 465 شمال البحر الأبيض المتوسط كموجات الإثارة والانبعاثات، على التوالي، باستخدام قارئ الأسفار ميكروسكوبية.

    • الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    الإجراء الطفرات
    لتقييم الكفاءة للطفرات الجينية GLA ، صنفت الطفرات في واحدة من الفئات التالية. وكشف هذا النهج تولد الطفرات التي تم الحصول على حوالي 66.5 في المائة الطفرات GLA في المحاولة الأولى. ويمكن الحصول على زيادة 25 ٪ بعد بكر ثانية معدلة قليلاً.

    الفئة 1: الطفرات PCR كان فعالاً في المحاولة الأولى.

    الفئة 2: فشل أول الطفرات بكر (ل...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    يسلم البروتوكول المبينة في هذا التقرير نتائج قوية لتقييم الأضرار الإنزيم في أمراض وراثية الليزوزومية من الأيض. هذه المخطوطة إدخال تعديل على البروتوكول ونشرت قبل15. أهم التعديلات التي تنطوي على صرامة (أيعملية إعداد بناء ناقلات متحولة)، توحيد البروتوكول ثقافة الخلية (أي، ظروف الصيانة وتعداء الخلايا HEK293H)، والارتفاع عدد التكرار التجريبي (على الأقل 5)، مما أسهم في إمكانية تكرار نتائج نتائج عالية. بالإجمال، كلا الجينات المستهدفة قد تم الوصول إليها بسهولة للطفرات ويمكن تجميع عدد واف...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

    شكر وتقدير

    الكتاب تود أن تقر لوبيرت ماندي وتينا كزاجكا للدعم الفني الممتاز. نشكر لوه النباتات (كلية الطب في جامعة هارفارد، بوسطن، ماجستير، الولايات المتحدة الأمريكية) لتحرير تعليمات اللغة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    <قوي>المواد
    QuikChange II XL مجموعة الطفرات الموجهة للموقع ستراتاجين ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية# 200522
    برايمر GLA [R301Q] -frw: 5 &ACUTE ؛ - CTA ATG ACC TCC AAC ACA TCA GCC C-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GLA [R301Q] -rev: 5 & - GGG CTG ATG TGT TGG AGG TCA TTA G-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GLA [A156V] -frw: 5 & حاد ؛ -CTA CGA CAT TGA TGA TGT CCA GAC CTT TGC TG-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GLA [A156V] -rev: 5 & -CAG CAA AGG TCT GGA CAT CAA TGT CGT AG-3&ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GLA [A156V] -frw: 5 & -GGA AAT AAA ACC TGC ACA GGC TTC CCT GGG A-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GLA [A143T] -rev: 5 & -TCC CAG GGA AGC CTG TGC AGG TTT TAT TTC C-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GAA [F455Y] -frw: 5 & حاد ؛ -CTG CCG GGA GCT TCA GGC CCT ACG A-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GAA [F455Y] -rev: 5 & -TCG TAG GGC CTG AAG CTC CCG GCA G-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GAA [P545L] -frw: 5 & حاد ؛ -CAC CCT ACG TGC TTG GGG TTG G-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon, Ebersberg, ألمانياn.a.Primer
    GAA [P545L]-rev: 5 & -CCA ACC ACC CCA AGC ACG TAG GGT G-3 &ACUTE ;MWG Eurofins Operon, Ebersberg, Germanyn.a.Primer
    GAA [L552P]-frw: 5&ACUTE;-TTG GGG GGA CCC CCC AGG CGG CCA C-3&ACUTE ;MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    GAA [P545L] -rev: 5 & حاد ؛ -GTG GCC GCC TGG GGG GTC CCC CCA A-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    T7: 5 & حاد ؛ -TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Primer
    BGHrev: 5 & حاد ؛ -TAG AAG GCA CAG TCG AGG-3 &ACUTE ؛MWG Eurofins Operon ، Ebersberg ، ألمانياn.a.Tryptone
    Carl Roth ، كارلسروه ، ألمانيا8952.1
    مستخلص الخميرةMerck ، دارمشتات ، ألمانيا103،753
    كلوريد الصوديومMerck ، دارمشتات ، ألمانيا1،064،041،000
    كلوريد البوتاسيومMerck ، دارمشتات ، ألمانيا1،049،360،500
    MgCl2 x 6H2OMerck ، دارمشتات ، ألمانيا1،058،330،250
    D (+) - الجلوكوز أحادي الهيدراتميرك ، دارمشتات ، ألمانيا1،083،422،500
    هيدروكسيد الصوديومميرك ، دارمشتات ، ألمانيا1،064،980،500
    جلايسينكارل روث ، كارلسروه ، ألمانيا3908.2
    حامض الستريككارل روث ، كارلسروه ، ألمانياX863.3
    فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديومميرك ، دارمشتات ، ألمانيا1،065،860،500
    أسيتات الصوديومميرك ، دارمشتات ، ألمانيا1،062،640،050
    حمض الخليك الجليديسيجما ألدريتش ، ميونيخ ، ألمانياA6283
    رطل أجاركارل روث ، كارلسروه ، ألمانياX969.2
    رطل متوسطكارل روث ، كارلسروه ، ألمانياX968.2
    Zyppy Plasmid Miniprep KitZymoResearch ، فرايبورغ ، ألمانياD4020
    QIAfilter Plasmid Midi KitQiagen ، هيلدن ، ألمانيا12245
    HEK293H خط الخليةInvitrogen ، كارلسروه ، ألمانيا11631-017   ؛
    Dulbecco & حاد; s معدل النسر المتوسط Invitrogen, Karlsruhe, Germany31966-047
    HyClone fetal bovine serum GE Healthcare ، جنوب لوجان ، يوتا ، الولايات المتحدة الأمريكيةSV30160.03
    Penicillin / StreptomycinInvitrogen ، كارلسروه ، ألمانيا15140-122
    قوارير CELLSTAR Standard Cell Culture ، Greiner Bio OneVWR International GmbH ، هانوفر ، ألمانيا82050-854
    لوحات زراعة الخلايا (24 بئر)Sarstedt ، N & uuml ؛ mbrecht ، ألمانيا831،836
    Cellstar 96 بئر لوحةGreiner bio one ، Frickenhausen ، ألمانيا655185
    أنابيب تفاعل SafeSeal ، 1،5 مل & nbsp ؛Sarstedt, Nü mbrecht ، ألمانيا72،706
    Lipofectamine 2000Invitrogen ، كارلسروه ، ألمانيا11668-019
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride   ؛Sigma Aldrich ، ميونيخ ، ألمانياD9641
    1-Deoxygalactonojirimycin Hydrochloride   ؛تورونتو للأبحاث الكيميائية ، تورنتو ، كنداD236500
    1-Deoxynojirimycin سيجما ألدريتش ، ميونيخ ، ألمانياD9305
    PBS Dulbecco بدون كالسيوم ، بدون المغنيسيومBiochrom ، برلين ، ألمانياL 1825
    Trypsin-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرالحراري العلمي ، براونشفايغ ، ألمانيا25300054
    بيرس BCA Protein Assay KitThermo Scientific ، براونشفايغ ، ألمانيا23225
    4-MethylumbelliferoneSigma ألدريتش ، ميونيخ ، ألمانياM1381
    4-Methylumbelliferyl &alpha ؛ -D-galactopyranosideSigma Aldrich ، ميونيخ ، ألمانياM7633
    4-Methylumbelliferyl &alpha ؛ -D-glucopyranosideSigma Aldrich ، ميونيخ ، ألمانياM9766
    Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number < / strong> Comments
    Equipment
    incubator type T6Heraeus Instruments, Hanau, Germanyn.a.Luminous
    Plate Gr. 2 ECarl Roth, Karlsruhe, GermanyP265.1
    3130 xl Genetic Analyzer Applied Biosystems, دارمشتات, ألمانياn.a.GFL-3032
    شاكر البكتيريGFL, Burgwedel, ألمانيا n.a.Avanti
    J-25 جهاز طرد مركزيBeckman / Coulter ، Krefeld ، ألمانياn.a.Ultraspec
    3100 pro< / em> مقياس الطيف الضوئيAmersham Biosciences ، باكينجهامشير ، المملكة المتحدةn.a.water-jacket
    incubator Binder ، Tuttlingen ، ألمانياn.a.Vortex
    Genie 1 خلاط اللمسScientific Industries ، بوهيميا ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكيةn.a.Z
    233 MK-2 أجهزة الطرد المركزي المبردة للأنابيب الدقيقةHermle ، Tuttlingen ، ألمانيا   ؛n.a.LaboStar
    جهاز المياه فائقة النقاءسيمنز ، برلين ، ألمانياn.a.Thermo
    Shaker PST-60HL-4 شاكر مداريBiosan ، ريغا ، لاتفياn.a.Tecan
    GENios ReaderTecan ، M & auml ؛ nnedorf ، سويسراn.a.HI
    223 مقياس الأس الهيدروجيني للمعالجاتالدقيقة HANNA Instruments ، Arvore ، البرتغالn.a.CASY

    عداد الخلايا + نظام المحلل
    نموذج TT    		Innovatis AG ، Cham / Zug ، سويسرا
    Name< / strong>CompanyCatalog Numberتعليقات
    Software
    Magellan Data Analysis Software v6.6Tecan, Mä nnedorf ، سويسراn.a.GraphPad
    Prism 5.04GraphPad Software، Inc. ، La Jolla ، CA ؛ الولايات المتحدة الأمريكيةn.a.Microsoft
    Office 2010Microsoft Corporation ، ريدموند ، واشنطن ، الولايات المتحدة الأمريكيةn.a.BioEdit
    محرر المحاذاة ، V7.0.1http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.htmln.a.
    abbreviations
    frw = إلى الأمام ؛ rev = عكس
    n.a. = غير قابل للتطبيق

    المراجع

    1. Cardiff University. , http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index. (2017).
    2. Meiji Pharmaceutical University. , http://fabry-database.org (2017).
    3. Erasmus Medical Center. Mutations In Human Acid Alpha-Glucosidase. , http://cluster15.erasmusmc.nl/klgn/pompe/mutations.html?lang=en (2017).
    4. Ishii, S., et al. Mutant alpha-galactosidase A enzymes identified in Fabry disease patients with residual enzyme activity: biochemical characterization and restoration of normal intracellular processing by 1-deoxygalactonojirimycin. Biochem J. 406, 285-295 (2007).
    5. Tajima, Y. Structural and biochemical studies on Pompe disease and a "pseudodeficiency of acid alpha-glucosidase". J Hum Genet. 52, 898-906 (2007).
    6. Lukas, J. Functional and Clinical Consequences of Novel α-Galactosidase A Mutations in Fabry Disease. Hum Mutat. 37, 43-51 (2016).
    7. Parenti, G. Treating lysosomal storage diseases with pharmacological chaperones: from concept to clinics. EMBO Mol Med. 1, 268-279 (2009).
    8. Yasuda, M. Fabry disease: characterization of alpha-galactosidase A double mutations and the D313Y plasma enzyme pseudodeficiency allele. Hum Mutat. 22, 486-492 (2003).
    9. Shimotori, M., Maruyama, H., Nakamura, G., Suyama, T., Sakamoto, F., Itoh, M., Miyabayashi, S., Ohnishi, T. Novel mutations of the GLA gene in Japanese patients with Fabry disease and their functional characterization by active site specific chaperone. Hum Mutat. 29, 331(2008).
    10. Andreotti, G., et al. Therapy of Fabry disease with pharmacological chaperones: from in silico predictions to in vitro tests. Orphanet J Rare Dis. 6, 66(2011).
    11. Khanna, R. The pharmacological chaperone AT2220 increases the specific activity and lysosomal delivery of mutant acid alpha-glucosidase, and promotes glycogen reduction in a transgenic mouse model of Pompe disease. PLoS One. 9, e102092(2014).
    12. Siekierska, A. α-Galactosidase aggregation is a determinant of pharmacological chaperone efficacy on Fabry disease mutants. J Biol Chem. 287, 28386-28397 (2012).
    13. Parenti, G. Pharmacological enhancement of mutated alpha-glucosidase activity in fibroblasts from patients with Pompe disease. Mol Ther. 15, 508-514 (2007).
    14. Wu, X. A pharmacogenetic approach to identify mutant forms of α-galactosidase A that respond to a pharmacological chaperone for Fabry disease. Hum Mutat. 32, 965-977 (2011).
    15. Lukas, J. Functional characterisation of alpha-galactosidase a mutations as a basis for a new classification system in fabry disease. PLoS Genet. 9, e1003632(2013).
    16. Andreotti, G., Citro, V., Correra, A., Cubellis, M. V. A thermodynamic assay to test pharmacological chaperones for Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1840, 1214-1224 (2014).
    17. , https://www.google.ch/patents/US9095584 (2017).
    18. Lukas, J., et al. Enzyme enhancers for the treatment of Fabry and Pompe disease. Mol Ther. 23, 456-4564 (2015).
    19. , http://www.genomics.agilent.com/primerDesignProgram.jsp (2017).
    20. Yam, G. H., Bosshard, N., Zuber, C., Steinmann, B., Roth, J. Pharmacological chaperone corrects lysosomal storage in Fabry disease caused by trafficking-incompetent variants. Am J Physiol Cell Physiol. 290, C1076-C1082 (2006).
    21. Shin, S. H., et al. Screening for pharmacological chaperones in Fabry disease. Biochem Biophys Res Commun. 359, 168-173 (2007).
    22. Shin, S. H., et al. Prediction of response of mutated alpha-galactosidase A to a pharmacological chaperone. Pharmacogenet Genomics. 18, 773-7780 (2008).
    23. Filoni, C., et al. Functional studies of new GLA gene mutations leading to conformational Fabry disease. Biochim Biophys Acta. 1802, 247-252 (2010).
    24. Citro, V. The Large Phenotypic Spectrum of Fabry Disease Requires Graduated Diagnosis and Personalized Therapy: A Meta-Analysis Can Help to Differentiate Missense Mutations. Int J Mol Sci. 17, (2016).
    25. Cammisa, M., Correra, A., Andreotti, G., Cubellis, M. V. Fabry_CEP: a tool to identify Fabry mutations responsive to pharmacological chaperones. Orphanet J Rare Dis. 8, 111(2013).
    26. Leinekugel, P., Michel, S., Conzelmann, E., Sandhoff, K. Quantitative correlation between the residual activity of beta-hexosaminidase A and arylsulfatase A and the severity of the resulting lysosomal storage disease. Hum Genet. 88, 513-523 (1992).
    27. Germain, D. P. Safety and pharmacodynamic effects of a pharmacological chaperone on α-galactosidase A activity and globotriaosylceramide clearance in Fabry disease: report from two phase 2 clinical studies. Orphanet J Rare Dis. 7, 91(2012).
    28. Hughes, D. A., et al. Oral pharmacological chaperone migalastat compared with enzyme replacement therapy in Fabry disease: 18-month results from the randomised phase III ATTRACT study. J Med Genet. 54, 288-296 (2017).
    29. Parenti, G., Andria, G., Valenzano, K. J. Pharmacological Chaperone Therapy: Preclinical Development, Clinical Translation, and Prospects for the Treatment of Lysosomal Storage Disorders. Mol Ther. 23, 1138-1148 (2015).
    30. Parenti, G., et al. A Chaperone Enhances Blood α-Glucosidase Activity in Pompe Disease Patients Treated With Enzyme Replacement Therapy. Mol Ther. 22, 2004-2012 (2014).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    الوسوم

    مرض فابريالعلاج بالمرافقات الدوائيةقياس نشاط الإنزيمالطفرات الموجهة للموقعخلايا HEK293Hألفا-جالاكتوزيداز أألفا-جلوكوزيداز الحمضيمقايسة BCAقارئ الفلورية
    في المختبر قياس إنزيم لاختبار الاستجابة الدوائية والوصيفة في فابري ومرض بومبي
    تواصل معنا
    أوصِ به للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.