مقالة منهجية

مقايسة مراسل المستندة إلى الأسفار بسيطة لتحديد المكونات الخلوية اللازمة للريسين سلسلة (RTA) الاتجار بالخميرة

DOI:

10.3791/56588

⸱

ديسمبر 15, 2017

 , 
1Molecular and Cell Biology, Department of Biosciences and Center of Human and Molecular Biology (ZHMB), Saarland University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه المخطوطة، يصف لنا استخدام مقايسة مراسل fluorescence المستندة إلى الخميرة تحديد المكونات الخلوية متورطة في تهريب وقتل العمليات للسآمة للخلايا وحدة فرعية من مادة الريسين السمية النباتية (RTA).

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا والنبات A/السموم ب استغلال مسارات الاتجار بالأشخاص الطبيعية في الخلايا حقيقية النواة للوصول إلى بهم داخل الخلية الهدف (ق) في سيتوسول وقتل في نهاية المطاف. هذه A/السموم ب تتألف عموما من نشاط انزيماتيكالي أسوبونيت (مثلاً، الريسين (RTA)) وخلية واحدة أو أكثر ملزم Bsubunit(s)، التي تعتبر مسؤولة عن السمية ملزمة محددة إلى الخلية المستقبلات السطحية. معرفتنا الحالية بطريقة أ/ب السموم قادرون على المسكرة العلماء الخلايا التي ساعدت على فهم الآليات الخلوية الأساسية، مثل الالتقام والبروتين داخل الخلية الفرز في الخلايا حقيقية النواة أعلى كفاءة. من وجهة نظر طبية، من المهم أيضا تحديد طرق الاتجار السمية الرئيسية لإيجاد حلول العلاج المناسب للمرضى أو لتطوير التطبيقات العلاجية على أساس السمية لعلاج السرطان في نهاية المطاف.

منذ التحليلات على نطاق الجينوم (أ) والتكسينية ب الاتجار في خلايا الثدييات هي معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة، عدة دراسات على أ/ب السم النقل قد أجريت في الحي النموذجي الخميرة Saccharomyces cerevisiae. على الرغم من كونها أقل تعقيداً العمليات الخلوية الأساسية في الخميرة وخلايا حقيقية النواة أعلى كثيرا من النتائج التي تحققت في الخميرة وهي مماثلة يمكن نقلها إلى حالة الثدييات.

هنا، يمكننا وصف مقايسة مراسل سريعة وسهلة الاستخدام لتحليل الاتجار داخل الخلايا لهيئة الطرق والمواصلات في الخميرة. ميزة أساسية للتحليل الجديد الفرصة للتحقيق ليس فقط المواصلات الرجعية-إزفاء من هيولى (ER) إلى سيتوسول، ولكن بدلاً من ذلك النقل الالتقام والسمية إلى الوراء من غشاء البلازما لائحة. الإنزيم يجعل استخدام بلازميد المراسل تمكن من قياس غير مباشر سمية هيئة الطرق والمواصلات من خلال الانبعاثات الأسفار من البروتينات الفلورية الخضراء (التجارة والنقل) وبعد الترجمة في فيفو . هذا الإنزيم منذ المواصلات كفاءة يمنع الشروع في تخليق البروتين الحيوي قبل 28S الرنا الريباسي ديبورينيشن، يسمح تحديد بروتينات الخلية المضيفة المعنية بالنقل المواصلات داخل الخلايا عن طريق الكشف عن التغييرات في الانبعاثات الأسفار.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المرضى الذين يعانون من التهابات بالسمية تنتج البكتيريا تمثل عبئا طبية ومالية شديدة لكل نظام الرعاية الصحية الاجتماعية، لا سيما نظراً لكفاءة العلاجات العلاجية لا تزال مفقودة إلى حد كبير. لوضع استراتيجيات علاجية جديدة، آليات التسمم معقدة من الناحية الطبية ذات الصلة/ب السموم مثل الكوليرا السمية، والسمية شيغا، أو الريسين يجب أن تكون مفهومة تماما على المستوى الجزيئي استناداً إلى رواية فحوصات القوية التي يتعين تنفيذها.

في السنوات الأخيرة، حاولت عدة دراسات لتحليل أ/ب السم النقل في خلايا الثدييات باستخدام أساليب مضيعة للوقت وباهظة التكلفة مثل السمية الإشعاعية والخميرة وسم1،2 ، فضلا عن الفحص على أساس siRNA تقترب من3. وفي بعض الحالات، الاتجار بالسمية قد تصور في فيفو بالفحص المجهري الأسفار بعد اقتران الكيميائية و/أو الوراثية لمفارز السمية الفردية مع فلوروفوريس أو النقاط الكم أو بروتينات الفلورسنت4،5. لسوء الحظ، مثل هذه التعديلات غالباً ما تؤدي إلى غير نشط و/أو تغيير الخصائص الطبيعية للسموم. طريقة أنيقة أخرى غير مباشر الإجابة على مجموعة واسعة من المسائل العلمية هو استخدام نظم مراسل استناداً إلى الإنزيمات مثل لاكز، لوسيفراس، أو البروتينات الفلورية (مثل التجارة والنقل أو ديسكوسوما sp. (البروتين الأحمر نيون دسريد)).

في هذه المخطوطة، يوصف بروتوكول بسيط الذي يحدد مكونات الخلوية اللازمة للنقل داخل الخلايا للمواصلات اكستراسيلولارلي التطبيقية في S. cerevisiae. وبالتالي، بلازميد مراسل الأسفار التي تحتوي على إشارة الطرفي ن ER-استيراد تليها التجارة والنقل بمثابة جهاز استشعار بروتين الحيوي، الذي يقيس تثبيط البروتين هيئة الطرق والمواصلات بوساطة الترجمة غير مباشر بالتجارة والنقل fluorescence الانبعاثات بعد الحية الترجمة6. في حالة أن الالتقام المواصلات و/أو الاتجار بها داخل الخلايا سلبا (أو إيجاباً) يتأثر في متحولة حذف خميرة خاصة مقارنة بالبرية من نوع، يمكن هذا الكشف من خلال الزيادة (أو النقصان) في التجارة والنقل fluorescence انبعاث6.

وحتى الآن، جميع أساليب تحليل النقل المواصلات في خلايا الخميرة اقتصرت على عملية الرجعية-إزفاء ER إلى سيتوسول لهيئة الطرق والمواصلات. في مثل هذا نظام مصطنع، يعبر عن المواصلات التي تحتوي على إشارة استيراد ER من عاملاً إيندوسيبلي أدى إلى الانتحار من النمط الظاهري1،7. على الرغم من أن الخلية ملزمة ب-وحدة فرعية من مادة الرايسين المثل مفقود في الإعداد التجريبي المبين في هذه المخطوطة، وهكذا، لا يعكس الحالة الطبيعية لمادة الرايسين هولوتوكسين التسمم8، النقل السمية من البلازما يمكن أن يكون الغشاء عن طريق جهاز غولجي للائحة يحاكي عن كثب مع هذا التحليل رواية. من المثير للاهتمام، تشير النتائج الأولية التي تم الحصول عليها في الدراسة التجريبية إلى أن مسارات الاتجار استخدامها من قبل هيئة الطرق والمواصلات تكشف عن أوجه الشبه ملفتة للنظر مع مسار التسمم بالريسين هولوتوكسين.

وباختصار، يمكن استخدام الأسلوب وصف لتحديد الدور المحدد للاتجار بالخميرة والبروتينات الخلوية المحدد في الالتقام هيئة الطرق والمواصلات. وعلاوة على ذلك، هذا الإعداد التجريبية قد تكون تتكيف بسهولة مع الريبوسوم الأخرى يخمد السموم المنتجة ويفرز من مختلف الأنواع البكتيرية مثل زيموسين أو السمية شيغا والخميرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: نظرة عامة سير العمل التجريبي العام هو مبين في الشكل 1.

تنبيه: هيئة الطرق والمواصلات شديدة السمية بالنسبة للبشر. هناك حاجة إلى سلامة مختبر إذن S2 (ما يعادل 2 مستوى السلامة الأحيائية). يرجى ارتداء القفازات خلال التجربة بأكملها.

1-مغايرة التعبير عن المواصلات صاحب معلم في الإشريكيّة القولونية

  1. تحويل الخلايا كولاي مع التعبير بلازميد pET24-هيئة الطرق والمواصلات(له) 6 أو pET24a متجه فارغة(+) باستخدام البروتوكولات القياسية انهانسر9،10. الخلايا التي تحتوي على بلازميد فارغة كعنصر سلبي.
  2. بعد اختيار استنساخ إيجابية على ألواح رطل (100 ميكروغرام/مل) الذي يحتوي على كاناميسين، تلقيح خلايا تحتوي على بلازميد تعبير هيئة الطرق والمواصلات أو متجه فارغة في المتوسطكان مل 5 رطل (متوسط رطل مع 100 ميكروغرام/مل من كاناميسين) واحتضان في 37 درجة مئوية و 220 لفة في الدقيقة ح 24.
  3. الملحق 1 رطل Lكان متوسطة مع ثقافة ما قبل 5 مل واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة حتى وصلت إلى خلايا التطوير التنظيمي600 من 0.8-1.0 (حوالي 3-4 ح). بعد ذلك، خفض الثقافة درجة الحرارة إلى 28 درجة مئوية وإعداد م 1 الأيزوبروبيل-β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) حل الأسهم في ح2o.
  4. حمل تعبير هيئة الطرق والمواصلات من كولاي بإضافة إيبتج إلى تركيز نهائي من 1 مم.
  5. بعد ح 3.5 في 28 درجة مئوية و 220 دورة في الدقيقة، خلايا الحصاد بالطرد المركزي في ز 10,000 x و 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، يغسل بيليه مرتين مع 5 مل من ربط المخزن المؤقت (500 ملم كلوريد الصوديوم، ايميدازول 10 مم، و 20 مم خ2ص4 ، pH = 7.4) 10 آلاف x ز و 4 درجات مئوية عن 10 دقيقة، وبيليه ريسوسبيند في المخزن المؤقت لربط 5 مل.
    ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول في هذه المرحلة، ويمكن تخزين الخلايا عند 80 درجة مئوية لعدة أيام.

2-تنقية صاحب معلم المواصلات عبر التقارب اللوني

  1. Sonicate الخلايا على الجليد باستخدام البروتوكول التالي: 15 s نبض (20 ميكرون)، 30 s وقفه. كرر هذه الخطوة من خمس مرات.
  2. الطرد المركزي خلية في 21,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وتصفية المادة طافية باستخدام نظام تصفية المحاقن معقمة (0.2 ميكرون حجم المسام).
    ملاحظة: الكريات الخلايا من عينات سونيكاتيد بنجاح تظهر حدود شفافة.
  3. استخدام نظام تنقية الآلي مجهزة 5 مل ني2 +-القائمة على عمود النسب لتنقية الكسر المواصلات صاحب معلم من العقيمة التي تمت تصفيتها كولاي طافية. بشكل عام، استخدم بسرعة شطف 1 مل/دقيقة وتبريد نظام تنقية كاملة لمنع فقدان النشاط السمية والسمية غير الكفء الملزمة.
    ملاحظة: يتم سرد المعلمات لكفاءة المواصلات تنقية في الجدول 1. انظر أيضا بيكر وآخرون. لمزيد من المعلومات،9.
    1. بإيجاز، حجته العمود تقارب مع 20 مل من المخزن المؤقت ملزم لإزالة المخزن المؤقت التخزين. وتنطبق المادة طافية العقيمة تصفية على عمود النسب استخدام المحاقن.
    2. أغسل العمود مع مل 25-35 من المخزن المؤقت ملزم لإزالة البروتينات غير منضم من العمود. نفذ الخطوة الغسيل حتى امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 280 نيوتن متر بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية القيمة الأولية.
    3. الوت منضم الكسر هيئة الطرق والمواصلات في مل 20-35 من شطف المخزن المؤقت (ايميدازول 500 ملم، 500 ملم كلوريد الصوديوم، 20 مم خ2ص4، ودرجة الحموضة = 7.2) والاحتفاظ بالعينة على الجليد (الشكل 2 ألف و 2 باء الشكل).
      ملاحظة: تم وضع علامة شطف الكسر هيئة الطرق والمواصلات بزيادة في امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. يرجى ملاحظة حصرا جمع هذا الكسر لمنع التلوث مع البروتينات منضم غير محدد.
    4. استخدام 20 ميليلتر من عينات التيد لأداء الأزرق أخذ تلطيخ11 أو12،تحليل لطخة غربية13 (اختياري). استخدم الابتدائية صاحب المضادة الأجسام المضادة (1:1، 000) والثانوي المضادة-موس-مفتش-برنامج الصحة الإنجابية (01:10، 000) للكشف عن هيئة الطرق والمواصلات، والتحقق من نموذج النقاء (الشكل 3).
    5. تحلية التيد الكسر هيئة الطرق والمواصلات على عمود ديسالتينج 5 مل وحجته عينة في السوربيتول 0.8 م.
      1. استبدال العمود تقارب نظام تنقية حسب العمود ديسالتينج وحجته الأولى العمود مع 20 مل السوربيتول 0.8 م.
      2. تطبيق الكسر المواصلات التيد إلى العمود عن طريق حقنه. أغسل العمود مع 100 مل السوربيتول 0.8 متر والوت الكسر هيئة الطرق والمواصلات ديسالتيد في أنبوب 15 مل حالما يبدأ امتصاص الأشعة فوق البنفسجية زيادة (الشكل 2).
      3. تخزين الكسر المواصلات التيد في 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: إيقاف مباشرة هيئة الطرق والمواصلات جزء المعاينة عند زيادة الموصلية لتجنب تلوث الملح. يتم سرد المعلمات لإجراء ديسالتينج في الجدول 1.
  4. تركز الوتيد الكسر هيئة الطرق والمواصلات في ز 10,000 x و 4 درجة مئوية لمدة 30-180 دقيقة استخدام عمود دوران وقف إنتاج المواد الانشطارية كاتشين 10 إلى وحدة تخزين نهائي 1-2 مل وتخزين العينات في 4 درجات مئوية لمدة 3-4 أسابيع.
    تنبيه: لا تجميد العينة منذ التجميد يؤدي إلى خسارة كاملة لنشاط هيئة الطرق والمواصلات.
  5. تحديد تركيز البروتين باستخدام مجموعة أدوات تصميم بروتين تقليدية. وينبغي تركيز البروتين في النطاق من 1-1.5 ملغ/مل.
    ملاحظة: هيئة الطرق والمواصلات يميل إلى التعجيل إذا كان تركيز البروتين مرتفع جداً (> 5 ملغ/مل).

3-الخميرة التحول وإزالة جدار الخلية

  1. تحويل طفرات الحذف الخميرة البرية من نوع أو المحدد مع بروتينات فلورية خضراء مراسل بلازميد pRS315 K28SPبروتينات فلورية خضراء-6 استخدام الليثيوم القياسية خلات تحول أساليب14. احتضان خلايا على leucine التسرب (د/س) لوحات الجلوكوز (السكر 2% أجار 1.5%، كبريتات الأمونيوم 0.5%, 0.17% قاعدة النيتروجين الخميرة (YNB) و 0.087% d/يا ميكس دون leucine) عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للتحديد استنساخ إيجابية.
  2. اختيار 3 استنساخ الخميرة مختلفة من كل لوحة وتطعيم المستنسخين في 100 مل من ليوسيني د/س raffinose المتوسطة (raffinose 2% كبريتات الأمونيوم 0.5%, 0.17% YNB و 0.087% d/يا مزيج دون leucine) في دورة في الدقيقة 220 و 30 درجة مئوية إلى OD600 = 1.0 2.0 (2-4 × 107 خلايا/مل).
    ملاحظة: يختلف نمو الخلايا من سلالات الحذف الخميرة مختلفة. رصد OD600 عن طريق جهاز المطياف الضوئي.
  3. لحساب قيم600 OD، تخفف من العينات إلى OD600 = 0.1-0.3 (1:5 إلى 01:10 تخفيف) وقياس OD600 في جهاز المطياف الضوئي. كمرجع، استخدام ح2س تستكمل مع المبلغ المقابل ل leucine د/س رافيونوسي المتوسطة.
وأخيراً، ريسوسبيند OD600 = 125 في 5 مل الماء المعقم (5 × 108 خلايا/مل).
  • الطرد المركزي الخلايا عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في 10,000 س ز، وتغسل الخلايا مرتين مع 5 مل من الماء المعقم وريسوسبيند الخلايا الموجودة في المخزن المؤقت سفيروبلاستينج 50 مل (0.8 م السوربيتول، 10 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 10 مم كاكل2، ديثيوثريتول 2 مم (DTT)، و 200 ميكروغرام/مل الإنزيم الحال).
  • احتضان ثقافة 50 مل في 100 لفة في الدقيقة و 30 درجة مئوية عن 90 دقيقة اختياري: رصد تشكيل سفيروبلاست كل 15 دقيقة قبل الطوري. ينبغي أن تحتوي الخلايا تحت المجهر، لون رمادي داكن شفافة. يتم هضمها الخلايا برايت (ريفراكتيلي) غير كاف، بينما أشباح (رمادي شاحب الخلايا مع القليل، أن وجد، الهيكل الداخلي) يتم هضمها الإفراط.
  • التحقق من فعالية إعداد سفيروبلاست لكل عينة.
    1. بعد الانتهاء من الخطوة 3، 5، مزيج 4 ميليلتر لثقافة سفيروبلاستيد 50 مل مع المخزن المؤقت سفيروبلاستينج ميليلتر 496 (حوالي 2 × 106 جدارها) والطرد المركزي لمدة 10 دقائق في 400 x ز.
    2. ريسوسبيند بيليه في 10 مل ح2س المقطر، نموذج دوامة ل 30 ثانية، ولوح بها 10 ميليلتر من العينة على leucine د/س ألواح الجلوكوز (السكر 2% أجار 1.5%، كبريتات الأمونيوم 0.5%, 0.17% YNB و 0.087% d/يا ميكس دون leucine).
    3. احتضان خلايا لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية. إجمالي عدد مستعمرات الخلايا المزروعة على اللوحة. لتقييم البيانات، استخدم فقط من العينات بكفاءة أعلى من 98% (إجمالي عدد الخلايا مستعمرة < 40 المستعمرات/اللوحة).
  • أجهزة الطرد المركزي خلايا من الخطوة 3.5 في 400 x ز و 4 درجات مئوية للخلايا 10 دقيقة ويغسل مرتين مع 5 مل استقرت لوسين د/س raffinose المتوسطة (السوربيتول 0.8 م raffinose 2%، كبريتات الأمونيوم 0.5%, 0.17% YNB ومزيج التسرب 0.087% دون لوسين). ريسوسبيند الخلايا في 5 مل لوسين استقرت د/س raffinose المتوسطة (1 × 108 خلايا/مل) واستخدام الخلايا مباشرة للقياسات المقايسة مراسل التجارة والنقل (القسم 4).

    • 4-التجارة والنقل مراسل المقايسة القياس في لوحات 96-جيدا

    1. البذور من جدارها خلايا الخميرة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3، 7 إلى 96-جيدا لوحات (200 ميليلتر في البئر).
    2. إضافة 70 ميليلتر لوسين استقرت د/س raffinose المتوسطة التي تحتوي على عنصر التحكم السلبي (النذرة ني2 +-تقارب خلية المنقي ليستي من الخلايا التي يسببها إيبتج كولاي معربا عن متجه فارغة) أو تنقية هيئة الطرق والمواصلات في تركيز هيئة الطرق والمواصلات نهائي من 5 ميكرومتر ( المقابلة لهيئة الطرق والمواصلات 160 غرام/لتر) في كل بئر.
    3. فورا إضافة 30 ميليلتر استقرت اللبن الحل (اللبن 30 ٪، السوربيتول 0.8 متر) للحث على تعبير بروتينات فلورية خضراء وبعد ذلك البدء القياس.
      ملاحظة: إجراء replicates التقنية على الأقل 3 للتجربة وإنشاء نسخ متماثلة 3 البيولوجية كل سلالة الخميرة.
    4. بعد الانتهاء من إعداد نموذج (الخطوات 4، 1-4-3)، وضعت لوحة 96-جيدا في قارئ الأسفار وبدء القياس. استخدام عامل تصفية نانومتر 475/509 مجموعة مطلوبة من أجل كشف fluorescence التجارة والنقل. إجراء القياسات في 30 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة، ويبلغ قطرها 1 ملم على مدى إطار زمني من ح 20 (قياس فترات من 10 دقيقة) تهتز.
      ملاحظة: تعيين عامل تصفية بروتينات فلورية خضراء تتوفر عادة في جميع نظم القارئ. يمكن ضبط درجة الحرارة، والإطار الزمني، قياس فترات، وتركيز هيئة الطرق والمواصلات للاحتياجات الخاصة. وتظهر نتائج الممثل في الشكل 4.
    5. اختياري: استخدام ضوابط داخلية إضافية في القياس لمراقبة الجودة. إعداد عنصر تحكم سلبية بإضافة 30 ميليلتر لوسين استقرت د/س raffinose المتوسطة بدلاً من اللبن 30% (لا التجارة والنقل التعريفي). وباﻹضافة إلى ذلك، أضف ميليلتر 70 من 0.8 م السوربيتول استقرت G418 الحل (300 ميكروغرام/مل). بمثابة مثبط ترجمة البروتين G418 مراقبة إيجابية لتثبيط البروتين كما أنه يمنع التعبير بروتينات فلورية خضراء في الخميرة.
    6. حساب النسبية fluorescence بروتينات فلورية خضراء في المئة للنقطة 20 ح الوقت وفقا للمعادلة التالية (انظر الشكل 4A): figure-protocol-1 "نورث كارولاينا حيث" هو التحكم بالسلبية
      1. وبدلاً من ذلك، تحديد الأسفار بروتينات فلورية خضراء النسبي لكل نقطة قياس (في هذه الحالة 10 دقيقة، انظر أيضا خطوة 4.4) باستخدام المعادلة المذكورة أعلاه. كما هو موضح في الشكل 4 باء، إنشاء رسم بياني من النشاف كثافات fluorescence بروتينات فلورية خضراء المحور (ص) على مر الزمن (س).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    سير العمل العام للبروتوكول، المذكورة في هذه المخطوطة يتضح في الشكل 1، تلخص تقريبا واحد خطوات ناجحة المواصلات تنقية وبروتينات فلورية خضراء مراسل مقايسة التجربة اللاحقة. يمكن الاطلاع على وصف أكثر تفصيلاً لكل خطوة فردية في البروتوكول. ويبين الشكل 2 النتيجة المتوقعة لتنقية المواصلات الناجحة التي تقارب اللوني (الشكل 2A)، ومكافحة ناقلات فارغة (الشكل 2). ويبين

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    عند تنفيذ هذا البروتوكول، نوصي بالاقتراحات التالية لتحقيق نتيجة ناجحة لهذه التجربة.

    للتعبير مغايرة من البروتين، ومن المهم أن لا يتجاوز تركيز إيبتج 1 مم. تركيزات إيبتج > 1 مم تمنع التعبير هيئة الطرق والمواصلات وتؤدي إلى انخفاض غلة السمية المستحثة بالمروج. وعلاوة على ذلك، الخلايا لا ينبغي المزروعة في درجة حرارة أعلى من 28 درجة مئوية لمنع تشكيل الهيئة إدراج وعدم كفاءة قابلة للطي، والمنظمة السمية. من الممكن التعبير المواصلات في انخفاض درجة الحرارة (مثلاً، 20-28 درجة مئوية) ويؤدي أيضا ...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وكانت أجزاء من هذه الدراسة يرجى تدعمها منحة من دويتشه الأوقيانوغرافية (SFB 1027، A6).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    <قوية >سلالات بكتيرية وخميرة< / قوية >
    < > بكتريا قولونية < / م > BL21 DE3 (ذهبي)Aligent Technologies230130
    S. cerevisiae < / em > BY4742EuroscarfY10000
    S. cerevisiae < / em > BY4742 طفراتالحذف DharmaconYSC1054مجموعة كاملة
    <قوي>الاسمCompany>Catalog NumberComments
    Plasmids المستخدمة في هذا البروتوكول
    pET24a(+) (Novagen)Millipore69772-3
    pET-RTA(His6)Becker et al.< / em> (2016)3
    NameCompanyCatalog NumberComments
    Recodes
    Zymolyase 20TUSBioZ1000.250إنزيم لايتي لجدار الخلية إزالة
    مرق LB متوسط10855021Thermo Scientific15 جم أجار لإنتاج الألواح
    YNBThermo ScientificDF0335-15-9
    كبريتات الأمونيومSigma-AldrichA4418-100G
    مزيج الخميرة المتسربة بدون ليوسينسيجما-ألدريتشY1376-20G
    أجارسيجما-ألدريتش05040-100 جرام
    د-الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270-100G
    DTTسيجما ألدريتش10197777001
    د-رافينوزسيجما ألدريتش83400-25G
    D-sorbitolسيجما-ألدريتشS1876-1KG
    D-galactoseسيجما-ألدريتشG0750-10MG
    G418حراري علمي11811031
    IPTGSigma-AldrichI6758-1G
    ImidazoleRoth3899.1
    PAGE مسطرة مسبقة التلخFermentas26616المستخدمة في التحليل الغربي
    NameCompanyCatalog NumberComments
    < قوي > مادة لتنقية هيئة الطرق والمواصلات وتحلية المياه وقياسات القارئ < / قوي >
    مقياس الطيف الضوئي Ultrospec 2100 proAmersham
    Soniprep 150MSEالنموذج القديم ، النماذج الأخرى المتاحة
    Fluoroskan AscentThermo Scientific5210470النموذج القديم ، غير متوفر بعد الآن
    & أومل. تم إيقاف منتج KTAPurifierThermoScientific 28406266واستبداله
    HisTRAP HP العمودGE Healthcare17-5248-02
    عمود تحلية المياه HiTRAPGE Healthcare11-0003-29
    مرشح Midisart المعقمSartorius16534K0.2 & micro ؛ م حجم المسام
    مجموعة فحص البروتين BCAبيرس23225
    660 نانومتر طقم الفحصThermo Scientific22660
    96 لوحة بئرThermo Scientific260860
    NameCompany Catalog NumberComments
    <قوي >أجسام مضادة (اختياري) < / قوي >
    مضاد لرباعي - HisQiagen34670الجسم المضاد الأساسي ؛ 1: 1,000
    المضاد للماوس HRPسيجما-ألدريتشA9044-2ML، تخفيف 1: 10،000
    تمت إضافة سلم البروتين تخفيف الجسم المضاد الثانوي

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Li, S., et al. Folding-competent and folding-defective forms of ricin A chain have different fates after retrotranslocation from the endoplasmic reticulum. Mol Biol Cell. 21 (15), 2543-2554 (2010).
    2. Li, S., Spooner, R. A., Hampton, R. Y., Lord, J. M., Roberts, L. M. Cytosolic entry of Shiga-like toxin a chain from the yeast endoplasmic reticulum requires catalytically active Hrd1p. PLoS One. 7 (7), e41119(2012).
    3. Moreau, D., et al. Genome-wide RNAi screens identify genes required for Ricin and PE intoxications. Dev Cell. 21 (2), 231-244 (2011).
    4. Giepmans, B. N., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The fluorescent toolbox for assessing protein location and function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
    5. Majoul, I. V., Bastiaens, P. I., Soling, H. D. Transport of an external Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) protein from the plasma membrane to the endoplasmic reticulum: studies with cholera toxin in Vero cells. J Cell Biol. 133 (4), 777-789 (1996).
    6. Becker, B., Schnoder, T., Schmitt, M. J. Yeast Reporter Assay to Identify Cellular Components of Ricin Toxin A Chain Trafficking. Toxins (Basel). 8 (12), (2016).
    7. Li, X. P., Baricevic, M., Saidasan, H., Tumer, N. E. Ribosome depurination is not sufficient for ricin-mediated cell death in Saccharomyces cerevisiae. Infect Immun. 75 (1), 417-428 (2007).
    8. Lord, J. M., Roberts, L. M., Robertus, J. D. Ricin: structure, mode of action, and some current applications. Faseb J. 8 (2), 201-208 (1994).
    9. Becker, B., Schmitt, M. J. Adapting yeast as model to study ricin toxin a uptake and trafficking. Toxins (Basel). 3 (7), 834-847 (2011).
    10. Seidman, C. E., Struhl, K., Sheen, J., Jessen, T. Introduction of plasmid DNA into cells. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
    11. Brunelle, J. L., Green, R. Coomassie blue staining. Methods Enzymol. 541, 161-167 (2014).
    12. Shapiro, A. L., Vinuela, E., Maizel, J. V. Jr Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem Biophys Res Commun. 28 (5), 815-820 (1967).
    13. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. 24, 145-149 (1992).
    14. Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations. J Bacteriol. 153 (1), 163-168 (1983).
    15. Vitetta, E. S., Yen, N. Expression and functional properties of genetically engineered ricin B chain lacking galactose-binding activity. Biochim Biophys Acta. 1049 (2), 151-157 (1990).
    16. Wales, R., Roberts, L. M., Lord, J. M. Addition of an endoplasmic reticulum retrieval sequence to ricin A chain significantly increases its cytotoxicity to mammalian cells. J Biol Chem. 268 (32), 23986-23990 (1993).
    17. Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5 (8), 711-718 (2008).
    18. Jablonowski, D., Schaffrath, R. Zymocin, a composite chitinase and tRNase killer toxin from yeast. Biochem Soc Trans. 35 (Pt 6), 1533-1537 (2007).
    19. Jablonowski, D., Schaffrath, R. Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II is affected by Kluyveromyces lactis zymocin. J Biol Chem. 277 (29), 26276-26280 (2002).
    20. Jablonowski, D., Frohloff, F., Fichtner, L., Stark, M. J., Schaffrath, R. Kluyveromyces lactis zymocin mode of action is linked to RNA polymerase II function via Elongator. Mol Microbiol. 42 (4), 1095-1105 (2001).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    GFP

    مقالات ذات صلة