مقالة منهجية

تحليل الاتصالات بين وحيدات وخلايا سرطان الثدي الأولية في مصفوفة خارج الخلية استخراج (أكمي)-على أساس نظام ثلاثي الأبعاد

DOI:

10.3791/56589

⸱

يناير 8, 2018

 ,  , 
1Unidad de Investigación en Virología y Cáncer, Hospital Infantil de México Federico Gómez, 2Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف أسلوب ثقافة ثلاثي الأبعاد لتحليل مورفولوجية الابتدائي خلايا سرطان الثدي، كذلك فيما يتعلق بدراسة تفاعلها المباشر/غير المباشر مع وحيدات ونتائج مثل تدهور الكولاجين وتجنيد الخلايا المناعية والخلايا الغزو، والترويج للالتهابات المتصلة بالسرطان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مضمن في المصفوفة خارج الخلية (ECM)، الخلايا الظهارية العادي والورم وثيقا التواصل مع الخلايا المكونة للدم وغير-المكونة للدم، وبالتالي التأثير على أنسجة طبيعية نتيجة التوازن والمرض إلى حد كبير. الإصابة بسرطان الثدي، المرتبطة بورم الضامة (تامس) تلعب دوراً حاسما في تطور المرض وورم خبيث، والتكرار؛ ولذلك، فهم آليات تشيمواتراكشن الوحيدات إلى ورم المكروية وتفاعلها مع الخلايا السرطانية مهم للسيطرة على المرض. هنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً لنظام ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافة المشارك للثدي الخلايا السرطانية (BrC) ووحيدات البشرية. إنتاج خلايا BrC ارتفاع مستويات التنظيم في تفعيل القاعدية، وعادي تي خلية أعرب ويفرز (رنتيس)، الوحيدات chemoattractant البروتين-1 (العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1)، وعامل تحفيز مستعمرة بلعم المحببات (ز-CSF)، بينما في الثقافة المشتركة مع وحيدات، تم إثراء بيتا انترلوكين (إيل)-1 برو-التهابات السيتوكينات (إيل-1β)، وايل-8 جنبا إلى جنب مع مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (MMP)-1 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-10. هذا وورم المكروية ستروما تعزيز مقاومة anoikis في هياكل مثل acini 3D MCF-10A، تشيمواتراكشن وحيدات، والغزو العدواني BrC الخلايا. توفير بديل بأسعار معقولة لدراسة الاتصالات داخل ورم البروتوكولات المقدمة هنا وهي مثال على الإمكانات الكبيرة التي توفر في المختبر نظم خلية ثلاثية الأبعاد استجواب ميزات محددة بيولوجيا الأورام المتصلة بالورم العدوان.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بيولوجيا الأورام الآن أكثر تعقيداً مما كان يعتقد سابقا. أدلة متزايدة تظهر أن الخلايا السرطانية أكثر من مجرد الجزء الأكبر من الخلايا المتكاثرة غير المنضبط؛ بدلاً من ذلك، تبدو الخلايا الورمية المختلفة لأداء وظائف مختلفة عرض عالية التنظيم والتسلسل الهرمي داخل الورم1. الخلايا السرطانية أيضا في التواصل الحميم مع عدم تحول الخلايا: الضامة، والخلايا الليفية، الخلايا الليمفاوية، adipocytes، خلايا بطانية، بين الخلايا الأخرى كلها مغمورة في سقالة البروتينات والسكريات التي تشكل إدارة المحتوى في المؤسسة. يتم إنشاء العديد من التفاعلات المباشرة وغير المباشرة بين الخلايا المحولة وعدم تحويلها، ومع إدارة المحتوى في المؤسسة، التي تمارس تأثيراً قويا على مدى ال2،نتائج المرض3. في قضية محددة من BrC، من المهم خاصة أن تشريح تبليغ الخلايا BrC مع تامس، إذ ترى أنه تم العثور تامس تلعب دوراً حاسما في تطور الورم، يزيد من مخاطر ورم خبيث، وتكرار المرض4 ،5.

لتحليل التفاعلات داخل الأورام ونتائجها المحتملة، نهج جديدة ثلاثية الأبعاد في المختبر وقد وضعت استناداً إلى استخدام مقتطفات إدارة المحتوى في المؤسسة التي تقدم المكروية أكثر تعقيداً بكثير، أقرب إلى واقع الأحياء الورم، بالمقارنة مع الثقافات الخلية أحادي الطبقة التقليدية التي تنمو فيها الخلايا المرفقة بالبلاستيك. بيترسن وبيسيل6 قدم أول نموذج من نونماليجنانت والخلايا الظهارية الثديية الخبيثة مثقف في غشاء الطابق السفلي الغنية laminin وكانوا الأول من وصف هياكل أورجانوتيبيك ثلاثية الأبعاد التي تميز الإنسان نونماليجنانت الثدي الخلايا الظهارية من نظرائهم الخبيثة. عقد من الزمان في وقت لاحق، النموذج الذي وضعته Debnath, موثوسوامي، وبروج7،،من89 توفير أداة قيمة توضيح الممرات البيولوجية للخطر أثناء التحول الخبيث من غدي acini، هذه كتشكيل acini كبيرة بسبب الانتشار غير المنضبط، توطن البروتينات مفرق ضيق كدليل على استقطاب الخلية البصر، وفقدان التجويف acini نتيجة لمقاومة الخلية anoikis، نوع من موت الخلايا المبرمج الذي يحدث في مرسى-تعتمد على الخلايا عند أنها فصل من ECM المحيطة بها. نماذج ساميني، جيديسزكو، وسلوان ركزت على النشاط proteolytic التصوير بالخلايا، الذي يرتبط ارتباطاً وثيقا اختزاع، سمة حاسمة أخرى من الورم الخبيث10،،من1112. تعتمد هذه النماذج على مصفوفات البروتين مختلطة مع ركائز البروتين تطفئ الأسفار المختلفة (الجيلاتين DQ، DQ-الكولاجين الأول والرابع DQ-الكولاجين)، في إشارات الفلورسنت التي هي إرشادية لتدهور الكولاجين proteolytic. نماذج ثلاثية الأبعاد وتستخدم أيضا لدراسة خصائص الخلايا الجذعية غير تحول على حد سواء، والخلايا السرطانية، كما وصف المجاميع، في الخلية التي الماغنيسيوم، يمكن أن يكون مثقف في التعليق أو في إدارة المحتوى في المؤسسة مثل البروتينات استجواب لآليات الخلية التمايز، غير متماثلة انقسام الخلية والتقيد خلية إلى خلية حركية13،14. فحوصات غزو السماح باختبار العدوانية المتأصلة للورم وتحديد الجزيئات التي تكون بمثابة تشيمواتراكتانتس أثناء عملية الغازية15. نماذج ثلاثية الأبعاد الشاملة، وتمثل تنويع بأسعار معقولة في المختبر الثقافة الخلية التي تعكس على نحو أوثق أنسجة طبيعية والنمطان morphogenesis.

لقد قمنا بتصميم نظام ثقافة المشارك خلية ثلاثية الأبعاد استناداً النماذج المذكورة أعلاه7،10،11، استخدام خطوط الخلية BrC كل البشرية التجارية إمكانات العدوانية المعروفة (أنواع لومينال وسالب الثلاثي) والابتدائية الخلايا اكسبلانتيد من المرضى BrC. ونحن أولاً وضع نموذج مثقف يشترك مع U937 وحيدات في مقتطف مصفوفة خارج الخلية (أكمي) فيها غير العدواني (MCF-7) أو عدوانية BrC (نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231) خلايا-استناداً إلى نظام ثلاثي الأبعاد الذي يسمح بالتفاعل المباشر خلية خلية. واستخدمت هذه الثقافات المشاركة لتحديد كيفية تأثير الاتصال بين هذه الأنساب الخلية اثنين النسخ من مجموعة من الجينات المتصلة بالسرطان السلوك العدواني. ولوحظ زيادة كبيرة في نسخة (كوكس-2) السيكلواوكسيجيناز-2 التي تزامنت مع زيادة إنتاج إحدى منتجاتها، البروستاغلاندين E2 (PGE2)، استنتاجا بأن أبرز دور الالتهاب في تطور السرطان. زيادة النسخ نظام التمثيل التناسبي المختلط لوحظ أيضا أن يرتبط بزيادة الكولاجين بروتيوليسيس عندما كانت شاركت مثقف العدوانية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا مع U937 وحيدات في الثقافات التي تحتوي على الكولاجين دي كيو "الرابع". من المذكرة، ثقافاتنا المشتركة لا تؤيد الافتراض بأن هناك حاجة إلى آليات التفاعل خلية خلية لتدهور الكولاجين. واقترح بدلاً من ذلك أن الاتصالات بين الأنساب الخلية اثنين وساطة من جزيئات يفرزها. وعلاوة على ذلك، الواردة supernatants تحصد من هذه الاختبارات ثقافة المشارك العوامل القابلة للذوبان التي مشوش acini غدي شكلتها غير تحول الخلايا MCF-10A13. وقد وجد أن العدوانية والابتدائي BrC الخلايا يفرز مستويات الجزيئات chemotactic الوحيدات العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، GM-CSF، ورنتيس مرتفعة. وهكذا، أوضحنا ثقافة ثلاثية الأبعاد التي تم فصل الخلايا في خلية يدخل الثقافة لمنع التفاعلات خلية خلية. واستخدمت هذه الثقافات لمعالجة الاتصالات غير المباشرة بين الخلايا BrC ووحيدات. لهذه الاختبارات وغير عدوانية وعدوانية من خطوط الخلايا BrC التجارية والابتدائي BrC الخلايا وثلاثة أنواع مختلفة من وحيدات البشرية: خلايا U937 و THP-1 التجارية ووحيدات الأولية (PMs) المعزولة من الدم المحيطي صحية من الجهات المانحة (جميع واستخدمت وحيدات في حالة عدم تنشيط) استخدمت. ولوحظت زيادة تركيزات السيتوكينات الالتهابية 1β إيل وايل-8 إثراء الثقافة المشتركة. وبالمثل، وجد أن MMP-1 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-10 وزيدت أيضا في BrC خلايا الوحيدات الثقافات المشتركة، ومن ثم يعزز الاستنتاجات السابقة14. ويرد في هذه المخطوطة، سير عمل نقطة بنقطة لعزل الخلايا BrC الأولية واختبار في الثقافات 3D جنبا إلى جنب مع نتائج تمثيلية. ويشكل هذا العمل مثالاً جيدا للإمكانات الكبيرة التي توفر في المختبر نظم خلية ثلاثية الأبعاد استجواب جوانب محددة من الأحياء الورم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتم الحصول على عينات من المرضى BrC من مصرف الأنسجة أون بحوث Unidad de Virología y المصابة، غوميز فيديريكو مستشفى الأطفال في المكسيك. أقر هذه الدراسة العلمية، والأخلاقية، والسلامة البيولوجية استعراض المجالس غوميز فيديريكو مستشفى الأطفال في المكسيك: لجنة بحوث، أون هي دي لجنة الدراسات ولجنة دي بيوسيجوريداد. جميع المرضى مقيدين في تاريخ لاحق، وأبلغ عن طبيعة الدراسة: الراغبين في المشاركة التوقيع موافقة خطية قبل جمع العينات ويعاملون وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية وأفضل الممارسة السريرية من المؤسسة. وقد تصبح مجهولة المصدر هوية المشاركين طوال فترة الدراسة. تم تشخيص مرضى وشملت مع سرطان الأقنية الغازية ونسيجية الصف 2 والسريرية في المرحلة الثانية، مع لا علاج نيوادجوفانت السابقة قبل استئصال الأنسجة. كان المرضى المسنين جميع الإناث في المتوسط 56.8 سنة (المدى 42 إلى 75)14.

1-الثقافات الخلية ثلاثي الأبعاد

  1. بذور 0.1 × 106 MCF 10A الخلايا أو الخلايا BrC الأولية في قوارير الثقافة2 25 سم مع DMEM/F12 الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 5% الحصان المصل، 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، السمية الكوليرا 100 نانوغرام/ملليلتر، الهيدروكورتيزون 0.5 ميكروغرام/مل، 10 ميكروغرام/مل الأنسولين، و 20 نانوغرام/مليلتر من عامل نمو البشرة (مماثلة). بذور 0.1 × 106 التجاري BrC الخلايا وخلايا mcf-7 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا في 75 سم2 ثقافة قوارير مع DMEM/F12 الثقافة المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة.
  2. بعد 48 ساعة, شطف أحادي الخلية في الطبقة مع 10 مل 1 العقيمة x الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). تريبسينيزي أحادي الخلية في الطبقة مع الحل 3 مل من 0.05% التربسين و 0.48 ملم الإيثيلين حمض (يدتا) لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميليلتر من المصل المطابق لوقف تريبسينيزيشن و 7 مل من المتوسط دون ملاحق. ريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج وإزالة قاسمة 10 ميليلتر حساب عدد الخلايا في دائرة نويباور.
  3. في كل من نظام الشرائح الدائرة 8-جيدا جيدا، انتشار قاعدة ميليلتر 40 أكمي نقية، متبوعاً حضانة من 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  4. في كل بئر، مكان الخلايا 800 حراكه في 400 ميليلتر من دميم/F12 (دون الأحمر الفينول) تكملة كما في الخطوة 1، 1 ولكن مع التغييرات التالية: الابتدائي BrC الخلايا والخلايا MCF-10A، إضافة 4 نانوغرام/مليلتر 2% ولو أكمي؛ MCF-7 ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231، فقط إضافة 2% أكمي.
  5. احتضان الثقافات في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة. استبدال وسائط الثقافة كل 48 ساعة.
  6. التغيرات المورفولوجية سجل خلايا كل 24 ساعة لمدة 15 يوما مع مجهر ضوئي. لتحليل مورفولوجية BrC الابتدائي الخلايا و MCF-10A ونجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا خطوط الخلايا إشارة جيدة لأمثلة على تشكيل أسينار مرتبة واضطرابه الهياكل الشبيهة بالسرطان العدوانية، على التوالي.
  7. الحصول على صور للخلايا في المجهر الحقل مشرق في 100 X و 200 X التكبير، وقارن بين مورفولوجيا الخلايا مع مرجع MCF-10A وخطوط نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 الخلايا (الشكل 1).

2-الحصول على الخلايا السرطانية الأولية من ورم الأنسجة

ملاحظة: للحصول على استخدام ورم الخلايا الظهارية الأنسجة من الأورام الأولية مستأصل من المرضى BrC مع لا علاج neoadjuvant السابقة؛ تجنب مناطق نخرية والعمل مع حد أدنى من 0.5 سم3 من أنسجة الورم.

  1. شطف ورم الأنسجة مع برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة وتفصيل ميكانيكيا مع مشرط في الأجزاء 1-2 مم.
  2. هضم الأنسجة في قنينة زجاج معقمة 20 مل مع غطاء ح 2 في درجة حرارة الغرفة (RT) مع 2 مل من متابعة الحل: مزيج 1 ملغ/مل كولاجيناز النوع الأول والبروتين السكري المثبط يو/مليلتر 100 في DMEM/F12 المتوسطة تحتوي على 100 البنسلين يو/مليلتر و 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين ، مع التحريك المستمر.
  3. تصفية تعليق الناتجة عن طريق قطعة معقمة من قماش لإزالة أجزاء كبيرة من الأنسجة عسر الهضم. قم بتصفية تعليق خلية عن طريق غشاء 100 ميكرومتر المسامية معقمة.
  4. بيليه الخلايا في 430 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وغسلها مرتين مع PBS العقيمة x 1. الثقافة الخلايا الأولية في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع مصل الحصان 5% 100 يو/مليلتر البنسلين، 100 ميكروغرام/مل ستربتوميسين، 100 نانوغرام/مليلتر الكوليرا السمية، 0.5 ميكروغرام/مل الهيدروكورتيزون، 10 ميكروغرام/مل الأنسولين و 20 نانوغرام/مليلتر من لو. استبدال المتوسطة كل حاء 48 المحافظة على الثقافات في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة.
  5. التأكد من وجود الخلايا المعزولة الخلايا الظهارية مع بروتوكول قياسي إيمونوسيتوتشيميستري14. اختبار ثلاث علامات طلائي: فريق سيتوكيراتينس (بنك)، الميوسين-1 (Muc-1)، وجزيء التصاق الخلايا الظهارية (ابكام).

3-عزل الخلايا بعد الظهر من "الدم المحيطي"

  1. استخراج حوالي 40 مل من الدم المحيطي من صحي متطوع، وتمييع الدم بنسبة 1:3 مع برنامج تلفزيوني عقيمة خالية من الذيفان 1 x، وإخضاعها لكثافة فصل تدرج.
  2. في أنبوب مخروطي، ضع 2 مل وسيلة دياتريزواتي بوليسوكروسي والصوديوم مع كثافة 1.077 غ/مل. بعناية وبطء تراكب 8 مل الدم المخفف. مدة 30 دقيقة، ز x 765 في استخدام الرايت أبطأ سرعة تسارع التباطؤ النابذة للطرد المركزي.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي، سوف تشكل أربع طبقات من الأسفل إلى الأعلى: بيليه خلايا الدم الحمراء وكثافة الطبقة المتوسطة التدرج وطبقة الخلايا وحيدات النوى (يبدو كحلقة بيضاء غرامة) وطبقة البلازما.
  3. استرداد طبقة الخلايا وحيدات النوى من التدرج مع ماصة باستور معقمة بعناية وغسلها ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1 x، في كل مرة متبوعاً بالطرد المركزي أبطأ (430 و 275 و 191 س ز) لمدة 10 دقائق في الرايت
  4. استخدام بروتوكولات الانتقاء السلبي لتجنب تنشيط الخلايا. مثال من هذا البروتوكول هو ما يلي:
    1. تغسل الخلايا وحيدات النوى مرة مع محلول غسيل مخزنة (0.5% البقري ألبومين المصل، 2 مم يدتا في برنامج تلفزيوني 1 x). عد الخلايا في دائرة نويباور وتكييفها لكثافة 1 × 107 خلايا/30 ميليلتر من حل مخزنة بشكل مؤقت.
    2. لكل الخلايا7 1 × 10، إضافة 10 ميليلتر من FcR حجب الكاشف و 10 ميليلتر من الكوكتيل البيوتين-جسم الوحيدات يحتوي على الإنسان المضادة CD3 CD7 و CD16، CD19، CD56، CD123، و A جليكوفورين (المضمنة في مجموعات تجارية).
    3. مزيج الخلايا واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إضافة ميليلتر 30 إضافية من الحل الغسيل مخزنة بالإضافة إلى 20 ميليلتر من البيوتين المضادة ميكروبيدس (ضمن الطقم)؛ مزيج الخلايا واحتضان لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    4. أغسل الخلايا مرة واحدة مع حل مخزنة بشكل مؤقت، الطرد المركزي في 430 x ز لمدة 5 دقائق في RT، وريسوسبيند في 1.5 مل من مخزنة الحل لفصل المغناطيسية.
    5. تحميل تعليق خلية في عمود الفاصل مغناطيسي مشطوف مسبقاً وإضافة 7 مل من محلول مخزنة بشكل مؤقت. جمع الكسر أثري الوحيدات في أنبوب مخروطي 15 مل، عد الخلايا، وإذا لم مثقف فورا، تجميد وحيدات في كثافة 2 × 106 خلايا/1 مل من DMEM/F12 المتوسطة وتستكمل مع 50% FBS و 10% [دمس] في −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تجنب استخدام وحيدات بعد أكثر من شهرين من التجميد، كما يمكن أن يتعرض للخطر قدرتها على الاستمرار.
  5. الحفاظ على الثقافات للدورة الشهرية في المتوسط DMEM/F12 تستكمل مع 6% FBS و 100 يو/مليلتر البنسلين والستربتوميسين 100 ميكروغرام/مل، في 37 درجة مئوية في 5% هوميديفيد CO2 البيئة.
  6. أداء كل مجموعة من تجارب استخدام الدورة الشهرية من اثنين على الأقل من الجهات المانحة المختلفة بشكل مستقل، كما وحيدات تجميع الموارد من الجهات المانحة المختلفة يمكن أن ينتج التنشيط الوحيدات.

4-إنشاء 3D اشتركت الثقافات

  1. الثقافات المشتركة 3D التفاعل غير المباشر
    ملاحظة:     إجراء هذه الاختبارات في لوحات الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع باستخدام إدراج ثقافة الخلية البولي مع أغشية حجم المسام ميكرومتر 0.4. في هذا التحليل، يمكن استرداد supernatants وخلايا في نهاية التجربة.
    1. زراعة 2 × 106 وحيدات U937 و THP-1 في 10 مل متوسط RPMI 1640 تستكمل مع 10% FBS، 1% المضادات الحيوية/فطري، وزراعة جديدة الدورة الشهرية في المتوسط DMEM/F12 المكملة (على النحو المشار إليه سابقا في الخطوة 3، 5)، في 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
    2. لوحة 4 × 105 وحيدات في 1 مل/جيدا من المتوسطة على المقابلة (تستكمل مع 2% أكمي و 2% FBS وحيدات U937 و THP-1، أو 2% أكمي و 6% FBS للدورة الشهرية).
    3. إدراج في كل بئر وإضافة 0.9 مل من 4 × 105 BrC تعليق خلية في المتوسط المقابلة (تستكمل مع 2% أكمي و 2% FBS لخطوط الخلايا التجارية أو 5% الحصان المصل للابتدائي BrC الخلايا). استبدال نصف مجموع وسائل الإعلام كل 48 ساعة.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة لمدة 5 أيام واسترداد في سوبيرناتانتس. استرداد خلايا من تريبسينيزيشن إذا كان يتم إجراء التحليل اللاحق.
    5. وتشمل عناصر الثقافات الخلية الفردية مع وسائط الإعلام الخاصة بكل منها.
  2. الثقافات المشتركة 3D التفاعل المباشر
    1. قم بتسمية الخلايا BrC ووحيدات مع الأصباغ الفلورية المختلفة قبل زراعة الخلايا للسماح بفرز مستقلة لكل خلية النسب بعد الثقافة لتحليل التعبير مرناً والبروتين. استخدام المشتقات المالية المتاحة تجارياً من الكومارين ووالرودامين بحرية تمر عبر غشاء الخلية من الخلايا الحية. بروتوكول عام لوضع العلامات هو ما يلي:
      1. إعداد أحادي الطبقة خلايا BrC من الفائدة (2 × 106 خلايا في قارورة ثقافة2 سم 25) ويستعاض عن المتوسط القياسي بحل العامل المعالجون مسبقاً كاف من صبغة الفلورسنت (1:2، 000 من صبغة الفلورسنت في المتوسط قاعدة قياسية دون أي ملحق). احتضان 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة. نضح الحل صبغ وشطف بلطف مع كافية 1 x برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة وسيلة قياسية.
      2. تريبسينيزي أحادي الخلية في الطبقة مع 2 مل حل يدتا التربسين و 0.48 ملم 0.05% لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 200 ميليلتر من FBS لوقف تريبسينيزيشن و 7 مل من المتوسط المراسل دون ملاحق. ريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر حساب عدد الخلايا في دائرة نويباور. تواصل مع البروتوكول ثقافة المشارك بعد عد الخلايا.
      3. بيليه الخلايا في 430 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت (أداء هذا الأول من نوعه منذ وحيدات تنمو في التعليق). تجاهل المادة طافية ولطف ريسوسبيند الخلايا مع 3 مل من إيجاد حل عملي المعالجون مسبقاً من صبغة الفلورسنت (1:2، 000 من صبغة الفلورسنت في متوسط قاعدة قياسية دون ملاحق). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
      4. بيليه الخلايا مرة أخرى، تجاهل الحل العامل الصبغ، وريسوسبيند برفق مع 5-7 مل من برنامج تلفزيوني 1 x. بيليه مرة أخرى، تجاهل برنامج تلفزيوني، ومن ريسوسبيند الخلايا في 5-7 مل متوسط القياسي. تأخذ قاسمة 10 ميليلتر من تعليق خلية حساب عدد الخلايا في دائرة نويباور. تواصل مع البروتوكول ثقافة المشارك بعد عد الخلايا.
    2. تعيين الثقافة المشتركة على النحو التالي:: انتشار أكمي كافية في أسفل البئر لتشكيل طبقة حتى في كل من نظام الشرائح الدائرة 4-جيدا جيدا. لوحة 20 ميليلتر من تعليق خلية واحدة تحتوي على 5 × 105 المسمى BrC الخلايا كل بئر.
    3. بعد 15-20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، إضافة تعليق 2.5 × 105 المسمى وحيدات في 80 المتوسطة الإنزيم ميليلتر (تستكمل مع 60% أكمي).
    4. تسمح أكمي يصلب لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    5. أضف 1 مل مزيج 1:1 خلايا BrC ووسائط الثقافة الوحيدات.
    6. احتضان ثقافات المشارك في 37 درجة مئوية في 5% هوميديفيد CO2 البيئة ح 24 أو 48 ساعة أو 5 أيام لتعقب التغييرات في نقاط زمنية مختلفة.
    7. تتحلل بروتينات ECM لاستعادة الخلايا من الثقافات. نضح وتجاهل المتوسطة، وإضافة 0.5 مل من س 1 برنامج تلفزيوني مع التربسين 0.1% و 0.25% يدتا واحتضانها ح 3 في 37 درجة مئوية. بعد التفريخ، إضافة 0.5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x مع 10% FBS لتحييد التربسين، وريسوسبيند الخلايا التي بيبيتينج بشدة للحصول على تعليق خلية واحدة.
    8. بيليه الخلايا في 765 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية ريسوسبيند الخلايا في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1 x مع 10% FBS. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    9. موضوع تعليق خلية إلى خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) مع الأداة المناسبة. التأكد من وجود السكان النهائي نقية على الأقل 95 ٪).
    10. بعد الفرز، تغسل الخلايا مع PBS العقيمة x 1، بيليه (430 غ س لمدة 5 دقائق في RT)، وريسوسبيند في برنامج تلفزيوني x 1 العقيمة. يمكن معالجة الخلايا وفقا لبروتوكولات معينة لعزل الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين.
    11. كرر من الفحص كل ثلاث مرات، بما في ذلك الثقافات 3D من كل سلالة الخلايا الفردية كعناصر تحكم.
  3. التفاعل المباشر 3D الثقافات المشتركة لتقييم تدهور الكولاجين
    1. إنشاء خلية 3D الثقافات المشتركة كما هو موضح في الخطوة 4، 2، مع خطوة إضافية لإضافة 32.5 ميكروغرام/مل من نوع الكولاجين الرابع المسمى مع fluorescein isothiocyanate إلى أكمي. تركيز الكولاجين الرابع في أكمي النهائي هو 0.5%. تنمو الثقافات في ساترة 35 ملم وضعها في أطباق بتري.
    2. انتشار طبقة من 40 ميليلتر من أكمي في الجزء السفلي من صحن بيتري. تسمح أكمي على ترسيخ عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 2.5 × 10 خلايا BrC5 في 10 ميليلتر من الوسط وتسمح للخلايا ليستقر.
    4. أضف تعليق 1.25 × 105 U937 وحيدات في 40 المتوسطة الإنزيم ميليلتر (تستكمل مع 60% من الكولاجين دي كيو "الرابع" المسمى-أكمي).
    5. تسمح أكمي يصلب لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. إضافة 2 مل 1:1 مزيج من الخلايا BrC ووسائط الثقافة الوحيدات.
    7. احتضان ثقافات المشارك لمدة 5 أيام في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 البيئة. استبدال وسائط الثقافة كل 48 ساعة.
    8. تحليل الانبعاثات fluorescence في مجهر مسح [كنفوكل] وقياس الكثافة الضوئية المتكاملة (المدراء) الواحد 50 ميكرومتر2 للثقافة. مقارنة IODs ضد الثقافات الفردية والثقافة في وقت صفر (الشكل 2).

5-تحليل سوبيرناتانتس من 3D اشتركت الثقافات التفاعل غير المباشر

  1. بعد 5 أيام ثقافة المشتركة، استرداد في سوبيرناتانتس من الأعلى والمقصورات أقل من الثقافات المشتركة 3D، ومن عناصر الثقافة 3D الفردية. خلط المادة طافية أيضا كل من بيبيتينج. قاسمة، وتخزين المادة طافية في −20 درجة مئوية حتى الاستخدام (لمدة شهر).
    ملاحظة: الحفاظ على سوبيرناتانتس في −80 درجة مئوية إذا كان سيتم تخزين أطول من شهر واحد.
  2. تحليل supernatants مع الإرسال المتعدد منصات المقايسة، وفحوصات الممتز المرتبط بالانزيم (ELISA)، أو تحديدكم المستندة إلى حبة عقب الإجراءات الموصى بها الشركة المصنعة.
    ملاحظة: سوبيرناتانتس يمكن أيضا تحليل لطخة غربية أو مركزة من خلال مرشحات المسام محددة للحصول على حجم أثري البروتين الكسور لإجراء تحليل زيموجرافي16،17. بدلاً من ذلك، استخدم في supernatants كوسائل مكيفة لتجارب أخرى، كما هو موضح أدناه. عادة ما يتم الحصول على وسائط مكيفة من ثقافة 5 أيام (الشكل 3).

6-توصيف تأثيرات Supernatants من الخلايا BrC الأولية في تشكيل أسيني وهيكل أسيني

  1. في كل بئر شريحة الدائرة 8-جيدا نظام انتشار قاعدة أكمي ميليلتر 40 والسماح لها بترسيخ لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  2. بذور 800 MCF-10A خلايا/بئر في 400 ميليلتر لتستكمل DMEM/F12 الثقافة المتوسطة، كما هو موضح في الخطوة 1، 2.
  3. إضافة 400 ميليلتر مكيفة وسائل الإعلام أو المتوسطة الثقافة DMEM/F12 تستكمل مع 20 نانوغرام/مليلتر من إيل الماشوب البشري-1β.
  4. مكان الشريحة الدائرة إلى طبق بيتري زجاجية التي تحتوي على طبق بتري 35 ملم مليئة 2 مل من برنامج تلفزيوني لخلق بيئة رطوبة.
  5. استبدال وسائط الإعلام/المادة طافية كل 48 ساعة.
  6. سجل تشكيل acini غدي كل 24 ساعة لمدة 14 يوما مع مجهر ضوئي.
  7. وبعد 14 يوما ثقافة، وصمة عار acini مع 100 ميليلتر من 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) بتركيز 100 نانومتر في برنامج تلفزيوني 1 x لمراقبة نواة الخلية. احتضان لمدة 25 دقيقة في RT في التحريك المستمر. شطف ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني x 1 لمدة 5 دقائق، كل مرة في التحريك المستمر في جبل الرايت الأعمال التحضيرية مع تصاعد متوسطة محددة لتلطيخ الفلورسنت. ختم مع البولندية شفافة والحفاظ على محمية من الضوء في 4 درجات مئوية.
  8. تحليل في أسيني مع مجهر [كنفوكل] التقاط صور لمداخن مستعرضة في أعماق مختلفة من أسيني (الشكل 4أ، ب، ج).
  9. تصور مختلف البروتينات الخلوية في أسيني مع البروتوكولات المصبوغة السليم. على سبيل المثال، كان ملون ه-كادهيرين تقييم التصاق خلية إلى خلية، والخلية القطبية، و/أو التجويف تشكيل18 (الشكل 4د).

7-الهجرة معبراً

ملاحظة: إجراء فحوصات الهجرة من U937، PMs THP-1، وجديدة في الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع ألواح البولي باستخدام الخلية إدراج الثقافة مع أغشية من 8 حجم المسام ميكرومتر. سبق يتضح أن المستقطبات GM-CSF، العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، ورنتيس عثر يفرز بتركيزات عالية في الثقافات 3D الفردية من خطوط الخلايا BrC العدوانية. واقترح أن هذه السيتوكينات ذات أهمية حاسمة لاجتذاب وحيدات إلى موقع الورم الرئيسي؛ تم اختبار هذا في فحوصات الترحيل باستخدام السيتوكينات وصفها تشيمواتراكتانتس.

  1. U937 الثقافة، الدورة الشهرية THP-1، أو جديدة كما هو موضح في الخطوة 4.1.1.
  2. يشطف مرة واحدة كل إدراج مع 200 ميليلتر من RPMI 1640 دون سيرا هيدرات الغشاء.
  3. ملء مع 50 ميليلتر من أكمي الباردة ووضع تدرج في لوحة ثقافة 24-جيدا مسطحة القاع، وتسمح أكمي بلمرة ح 1 في 37 درجة مئوية.
  4. إضافة 180 ميليلتر من ربمي دون FBS في المقصورة العلوية اللوحة. إضافة في مجلس النواب دون ميليلتر 800 محتدما لتستكمل مع أما 100 نانوغرام/مليلتر من GM-CSF، ربمي العملية التشاورية المتعددة الأطراف-1، أو رنتيس ك chemoattractant. استخدام المتوسط دون السيتوكينات كعنصر سلبي. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية إنشاء تدرج لوني تشيموكيني.
  5. مكان 1.5 × 105 من كل نوع من الوحيدات في أنبوب عقيم، يغسل مرتين مع 1 مل 1 x برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي في 430 x ز لمدة 5 دقائق في "الرايت ريسوسبيند" وحيدات في 20 ميليلتر من ربمي دون FBS، مكان لهم في يدخل ، وتجانسه بعناية فائقة بتعليق خلية (الحجم النهائي لمجلس الشيوخ وهو 200 ميليلتر).
  6. السماح بهجرة الخلية للتقدم من أجل 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
    ملاحظة: كما وحيدات غير ملتصقة، سيتم عادة الخلايا المهاجرة في وسائط الإعلام في حجرة أقل.
  7. إزالة تدرج واسترداد وسائط الإعلام وحساب عدد الخلايا في 2، 4 و 6، و 24 ساعة استخدام دائرة نويباور أو تدفق سيتوميتير؛ وبدلاً من ذلك، خاصة إذا تم العثور على لا خلايا في وسائط الإعلام، الحصول على صور الجزء السفلي من إدراج مع كاميرا رقمية. يتم استخدام عدد الخلايا يعني من 3 حقول عشوائية (في التكبير X 100) للتحليل (الشكل 5).

8-الغزو فحوصات

ملاحظة: إجراء فحوصات غزو الخلايا BrC في لوحات الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع باستخدام إدراج ثقافة الخلية البولي مع أغشية حجم المسام ميكرومتر 8. في دراساتنا الأصلي، إيل-8 كانت واحدة من السيتوكينات أثرت في supernatants BrC خلية/الوحيدات 3D الثقافات المشارك. تم اختبار ما إذا كان هذا سيتوكين كانت تشارك في غزو خطوط الخلايا BrC.

  1. توسيع نطاق الخلايا BrC في قوارير2 75 سم. MCF-7، T47D، HS578T، وجمعية نجمة داود الحمراء-ميغابايت-231 هو موضح في الخطوة الأولية BrC الخلايا و 1.2 (ولكن دون أكمي) كما هو موضح في الخطوة 2، 4.
  2. أغسل بمجرد إدراج كل البولي 8 ميكرومتر المسامية غشاء الخلية والثقافة مع 200 ميليلتر من المتوسط دون سيرا (الوسيلة المستخدمة يعتمد على خط الخلية اختبار) هيدرات الغشاء.
  3. ملء الإدراج مع 50 ميليلتر من أكمي الباردة (1:4 إضعاف ECME:cold المتوسطة دون FBS) ووضع تدرج في لوحة ثقافة 24-جيدا مسطحة القاع وتسمح أكمي بلمرة ح 1 في 37 درجة مئوية.
  4. مرة واحدة قد بلمرة أكمي، إضافة ميليلتر 180 خلية كل منها وسائل الإعلام دون FBS. إضافة 800 ميليلتر الوسائط بدون FBS من خلال الشقوق الإدراج. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية إنشاء تدرج إيل-8.
    ملاحظة: تجنب خلق الفقاعات في وسائل الإعلام. الوسائط المستخدمة دون FBS ولكن تكملها 100 نانوغرام/مليلتر من إيل-8 ك chemoattractant أو وسائل الإعلام النقي دون FBS، كعناصر سلبية.
  5. الحصول على ما مجموعة 6 × 105 خلايا لكل خط الخلية كما يلي:
    1. تجاهل سوبيرناتانتس وشطف مرة واحدة مع 10 مل من 1 x برنامج تلفزيوني، وإضافة 2 مل من 0.05% التربسين/0.48 ملم يدتا لمدة 2 دقيقة في 37 درجة مئوية لفصل الخلايا. إضافة 4 مل متوسطة المكملة التوقف عن رد فعل التربسين وريسوسبيند بشدة من بيبيتينج.
  6. أن 10 ميليلتر الكوة من تعليق خلية لحساب عدد الخلايا في دائرة نويباور. تأخذ كمية من تعليق خلية تحتوي على خلايا5 6 × 10. الطرد المركزي في 430 x ز لمدة 5 دقائق في الرايت وتجاهل المادة طافية وشطف الخلايا في 1 مل من س 1 برنامج تلفزيوني. كرر الشطف مرة أخرى.
  7. ريسوسبيند الخلايا في 20 ميليلتر لوسائل الإعلام الخاصة بكل منها دون FBS ومكان في إدراج تحتوي على 180 ميليلتر لوسائل الإعلام الخاصة بكل منها دون FBS. مجانسة تعليق خلية بعناية قبل بيبيتينج.
  8. تسمح غزو الخلية للتقدم من أجل 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 البيئة.
  9. بعد 48 ساعة، قم بإزالة الأقراص وتجاهل المادة طافية وشطف إدراج مرة جداً بعناية مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x. مع قضيب القطن ذات الرؤوس إزالة الفائض في برنامج تلفزيوني.
    ملاحظة: الخلايا الغازية وعادة ما يتم إرفاق إلى الجانب الآخر من الإدراج كما في هذه الحالة حيث تكون الخلايا ملتصقة.
  10. إصلاح الخلايا عن طريق وضع الإدراج في بئر لوحة الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع الذي يحتوي على 1 مل/جيدا من بارافورمالدهيد 4% لمدة 15 دقيقة في الرايت Afterwards, شطف إدراج مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1 x.
  11. وصمة عار الخلايا عن طريق الإدراج في بئر من لوحة الثقافة 24-جيدا مسطحة القاع الذي يحتوي على 1 مل/جيدا لبرنامج تلفزيوني 1 x مع 0.2% الكريستال البنفسجي لمدة 45 دقيقة في "الرايت بعناية"، مع إزالة القطن ذات الرؤوس قضيب أكمي كل من الجزء العلوي من الغشاء ، التي تحتوي على الخلايا التي غير ترحيل، وشطف بعناية فائقة مع الماء المقطر لتجنب القضاء على إصلاح الخلايا الغازية.
  12. حساب عدد الخلايا الغازية بمراقبة الجانب السفلي من إدراج تحت المجهر المقلوب. يتم استخدام عدد الخلايا يعني من 3 حقول عشوائية (في التكبير X 100). في الحالات حيث قد غزت ككتل الخلايا ومن الصعب الاعتماد على حدة، الحصول على الصور من 3 حقول عشوائية (في التكبير X 100) مع كاميرا رقمية. تحليل الصور باستخدام برنامج لتحليل الصور واستخدم المدراء للتحديد الكمي لغزو الخلية (الشكل 6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحليل BrC الخلايا في الثقافات 3D المورفولوجية:

تم دراسة مورفولوجية الابتدائي BrC خلايا تنمو في الثقافات 3D كثافات منخفضة وعالية على مدى 5 أيام. خلال 48 ساعة الأولى، التمسك أكمي الخلايا والحفاظ على كثافة منخفضة. في هذه النقطة الزمنية، يمكن وضوح تقدير أن الخلايا الحالية على شكل يشبه شوكي ممدود، بعضها مع إسقاطات طويلة هيولى اثنين أو أكثر، ودون أن تظهر جهات الاتصال الظاهر خلية خلية. بعد 5 أيام ثقافة، تكاثرت الخلايا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنمو الخلايا الظهارية في تكيف ثلاثية الأبعاد مكانية وتفاعلها مع بروتينات ECM المحوري للتوازن الأنسجة. دراسات السرطان كثيرة تستند إلى خلايا تزرع في مونولاييرس (2D) وعلى الرغم من أنها كانت حاسمة بالنسبة لفهم جوانب عديدة من تشكيل الورم والتقدم، مونولاييرس لا الخص الخصائص التي يفرض إدارة المحتوى في المؤسسة في الخلايا، مثيل: الحد من انتشار وبقاء الخلية تعتمد على الالتصاق، قطبية قمي باسولاتيرال، إعادة عرض المحتوى، وتمايز الخلية، إلخ الأهم من ذلك، ليس فقط بالتفاعل بين الخلايا السرطانية وإدارة المحتوى في المؤسسة ضرورية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أنه ليس لديهم أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من مبرزين فونسيك أفريقيا جنوبي الصحراء/الضمان الاجتماعي/عمال المشروع رقم 233061 إلى ازكويل م فوينتس-Pananá وفوندو دي الدعم على غرار الدراسات، مستشفى الأطفال في المكسيك فريدريكو غوميز (المشروع رقم HIM-2014-053). نا اسبينوزا-سانشيز طالب دكتوراه من Programa de دوكتورادو en Biomédicas العلوم، الجامعة الوطنية المستقلة بالمكسيك (يونام) وتلقت زمالة 231663 من المجلس الوطني. ه-ق "نا"، نعترف أيضا بالدعم المالي المقدم من المعهد المكسيكي "الضمان الاجتماعي" (الضمان الاجتماعي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
U937مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC   ؛CRL-1593.2خط الخلايا أحادية الخلية / سرطان الغدد الليمفاوية النسيجي   ;
THP-1مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC   ؛TIB-202خط الخلايا أحادي الخلية / ابيضاض الدم وحيد الخلية الحاد   ؛
MCF-10Aمجموعة الثقافة الأمريكية ATCC   ؛CRL-10317خط خلايا الثدي غير المحول
MCF-7مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC   ؛HTB-22خط خلايا سرطان الثدي
T47Dمجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC & nbsp ؛HTB-133خط خلايا سرطان الثدي
HS578Tمجموعة الثقافة من النوع الأمريكي ATCC & nbsp ؛HTB-126خط خلايا سرطان الثدي
MDA-MB-231ثقافة النوع الأمريكي ATCC & nbsp ؛HTB-26خط خلايا سرطان الثدي
RPMI 1640 متوسطGIBCO BRL Life Technologies11875-093
DMEM High Glucose جيبكو BRL Life Technologies11964-0924.5 جم / لتر جلوكوز
DMEM / F12جيبكو BRL Life Technologies11039-021
المضادات الحيوية / المضادة للفطرياتجيبكو BRL Life Technologies15240-062100 U / mL البنسلين ، 100 وميكرو. جم / مل ستربتومايسين ، و 0.25 وميكرو ؛ جم / مل مصل الأبقار الجنيني Fungizone
GIBCO BRL Life Technologies16000-044
مصل الحصان  جيبكو BRL Life Technologies16050114
0.05٪ Trypsin-EDTA 1XGIBCO BRL LIFETECHNOLOGIES 25300-062
PBS 1X (محلول ملحي مخزن بالفوسفاتجيبكو BRL Life Technologies20012-027
عامل نمو البشرة (EGF)PeproTechAF-100-15 (1.00 مجم) الأنسولين
SIGMA-ALDRICHI1882-100MG
هيدروكورتيزونSIGMA-ALDRICHH088-5G
توكسين الكوليرا الضمة الكوليراSIGMA-ALDRICHC8052-1MG
Matrigel Corning Inc356237ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ، مستخلص المصفوفة خارج الخلية ، يخزن في -20 درجة ؛ C حتى الاستخدام عند 4 درجة ؛ سي
جي إم-سي إس إفبيبرو تيك300-03
ام سي بي-1بيبروتك300-04
رانتسبيبرو تيك300-06
IL-8بيبروتك200-08
IL-1 وبيتا؛PeproTech200-01B
كريستال بنفسجيHycel M & eacute ؛ xico541
ParaformaldehydeSIGMA-ALDRICHP6148
دعامات نفاذية Transwell (إدراجات)Corning Inc3422قطر 6.5 مم ، 8 وميكرو ؛ م حجم المسام / 24 بئر لوحات   ;
دعامات نفاذية للعمود (إدراجات)Thermofisher Scientific140620قطر 6.5 مم ، 0.4 وميكرو ؛ م حجم المسام / 24 بئر لوحات   ;
طقم عزل الخلايا الأحادية II الإنسان   ؛Miltenyi Biotec130-091-153
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401
مجموعة لوحة الخرزة المغناطيسية للسيتوكين البشري / الكيموكين 96 اختبار لوحة البئرEMD MilliporeHCYTOMAG-60K
Magpix مع برنامج xPonent (أجهزة اختبار تحليلية فلورية قائمة على الليزر) شريحةLuminexCorporation 40-072
Lab-Tek مع غطاء (8 حسنا)Nalge Nunc International177402
زجاج قاع ميكروويل 35 مم petri   أطباقMatTek Corp.P35G-1.5-14-C
مجموعة ، غرفة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rich, J. N. Cancer stem cells: understanding tumor hierarchy and heterogeneity. Medicine (Baltimore). 95 (1), Suppl 1 2-7 (2016).
  2. Wang, M., et al. Role of tumor microenvironment in tumorigenesis. J Cancer. 8 (5), 761-773 (2017).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  4. Sica, A., et al. Macrophage polarization in tumour progression. Semin Cancer Biol. 18 (5), 349-355 (2008).
  5. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  6. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  7. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  8. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
  9. Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nat Cell Biol. 3 (9), 785-792 (2001).
  10. Sameni, M., Dosescu, J., Moin, K., Sloane, B. F. Functional imaging of proteolysis: stromal and inflammatory cells increase tumor proteolysis. Mol Imaging. 2 (3), 159-175 (2003).
  11. Sameni, M., et al. MAME models for 4D live-cell imaging of tumor: microenvironment interactions that impact malignant progression. J Vis Exp. (60), (2012).
  12. Jedeszko, C., Sameni, M., Olive, M. B., Moin, K., Sloane, B. F. Visualizing protease activity in living cells: from two dimensions to four dimensions. Curr Protoc Cell Biol. 4, Chapter 4 Unit 4 20(2008).
  13. Chimal-Ramirez, G. K., et al. MMP1, MMP9, and COX2 expressions in promonocytes are induced by breast cancer cells and correlate with collagen degradation, transformation-like morphological changes in MCF-10A acini, and tumor aggressiveness. Biomed Res Int. 2013, 279505(2013).
  14. Espinoza-Sanchez, N. A., Chimal-Ramirez, G. K., Mantilla, A., Fuentes-Panana, E. M. IL-1beta, IL-8, and Matrix Metalloproteinases-1, -2, and -10 Are Enriched upon Monocyte-Breast Cancer Cell Cocultivation in a Matrigel-Based Three-Dimensional System. Front Immunol. 8, 205(2017).
  15. Li, Y., Wang, L., Pappan, L., Galliher-Beckley, A., Shi, J. IL-1beta promotes stemness and invasiveness of colon cancer cells through Zeb1 activation. Mol Cancer. 11, 87(2012).
  16. Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. Immunoblotting and immunodetection. Curr Protoc Mol Biol. 10, Chapter 10 Unit 10 18(2008).
  17. Troeberg, L., Nagase, H. Zymography of metalloproteinases. Curr Protoc Protein Sci. 21, Chapter 21 Unit 21 15(2004).
  18. Arevalo-Romero, H., Meza, I., Vallejo-Flores, G., Fuentes-Panana, E. M. Helicobacter pylori CagA and IL-1beta Promote the Epithelial-to-Mesenchymal Transition in a Nontransformed Epithelial Cell Model. Gastroenterol Res Pract. 2016, 4969163(2016).
  19. Reed, J. R., Leon, R. P., Hall, M. K., Schwertfeger, K. L. Interleukin-1beta and fibroblast growth factor receptor 1 cooperate to induce cyclooxygenase-2 during early mammary tumourigenesis. Breast Cancer Res. 11 (2), 21(2009).
  20. Ma, L., et al. Epidermal growth factor (EGF) and interleukin (IL)-1beta synergistically promote ERK1/2-mediated invasive breast ductal cancer cell migration and invasion. Mol Cancer. 11, 79(2012).
  21. Grande, S. M., Bannish, G., Fuentes-Panana, E. M., Katz, E., Monroe, J. G. Tonic B-cell and viral ITAM signaling: context is everything. Immunol Rev. 218, 214-234 (2007).
  22. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliv Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  23. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  24. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
  25. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  26. Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric Organoids: An Emerging Model System to Study Helicobacter pylori Pathogenesis. Curr Top Microbiol Immunol. 400, 149-168 (2017).
  27. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  28. Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nat Cell Biol. 16 (1), 118-126 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة