مقالة منهجية

طريقة لتصنيف النصوص في الخلايا الفردية الإشريكيّة القولونية للأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين

DOI:

10.3791/56600

⸱

ديسمبر 21, 2017

 ,  , 
1Department of Physics of Complex Systems, Weizmann Institute of Science

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذه المخطوطة أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) مع تحقيقات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. سمفيش هو أسلوب تصور يسمح الكشف المتزامن، والترجمة، والتقدير الكمي لواحد مرناً الجزيئات في الخلايا الفردية الثابتة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف أسلوب لوصف النصوص الفردية رسول من الحمض النووي الريبي (مرناً) في البكتيريا الثابتة للاستخدام في الأسفار جزيء واحد في الموقع تجارب التهجين (سمفيش) في كولاي. يسمح سمفيش قياس التغير خلية إلى خلية في عدد النسخ مرناً للجينات للفائدة، فضلا عن موقع سوبسيلولار للنصوص. الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها هي تثبيت ثقافة الخلية البكتيرية، permeabilization أغشية الخلايا، والتهجين النصوص المستهدفة مع مجموعات من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي القصيرة المتاحة تجارياً. يمكن أن تسمح سمفيش تصوير وقائع جينات متعددة في نفس الخلية، مع القيود التي فرضتها التداخل الطيفي بين علامات مضيئة مختلفة. وعقب انتهاء البروتوكول هو موضح أدناه، خلايا يمكن سهولة تصويرها استخدام مجهر مقترنة بكاميرا مناسبة للأسفار المنخفضة الكثافة. هذه الصور، جنبا إلى جنب مع ملامح الخلية التي تم الحصول عليها من تجزئة المرحلة التباين الإطارات، أو تلطيخ غشاء الخلية، السماح لحساب توزيع مرناً نسخة رقم عينة خلايا باستخدام برمجيات المصدر المفتوح أو كتب مخصصة. يمكن أيضا تطبيق الأسلوب وضع العلامات الموصوفة هنا لنسخ الصورة مع التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ستوتشاستيسيتي هو أحد جوانب الأساسية والتي لا يمكن تجنبها للتعبير الجيني ويؤدي إلى الخلية الخلية التغايرية1، سواء على مستوى النصوص والبروتينات2،3. التحديد الكمي للتفاوت بين الخلايا تحت ظروف محددة جيدا توفر نافذة فريدة من نوعها في العمليات الأساسية التي تكمن وراء التعبير الجيني ولائحته. واحد مصدرا هاما للخلية عدم التجانس في البكتيريا تجري على المستوى النسخي. تتباين أرقام نسخة ليس فقط بسبب ستوتشاستيسيتي للنسخ، ولكن أيضا لعمليات بوستترانسكريبشونال مثل تنظيم الكشف ورناسيس صغيرة2. طريقة واحدة للوصول مباشرة إلى هذا التباين بطريقة كمية علامات النصوص الفردية لجين معين فلوريسسينتلي في سمفيش. هذه المنهجية يسمح بالكشف عن والتعريب سوبسيلولار من جزيئات الحمض النووي الريبي خاصة في ثابتة، الخلايا البكتيرية الفردية4. يتم تهجين مرناس مع مجموعة من المسمى فلوريسسينتلي ~ 20 قاعدة طويلة النوكليوتيد التي تهدف إلى ربط بشكل انتقائي للمحاضر الحرفية للفائدة5،6. العلامات متعددة تضمن الكشف أعلاه الخلفية الفلورية، والفرد مرناً الجزيئات تظهر كبقع حيود محدودة تحت مجهر الأسفار7 (انظر الشكل 1). وهناك نهج أخرى لوصف جزيئات مرناً، التي تحمل تحقيقات تكميلية oligomer haptens مترافق (مثلاً، البيوتين أو ديجوكسيجينين) التي تم الكشف عنها باستخدام تقنيات مراسل الثانوي المسمى فلوريسسينتلي8.

وهناك أساليب أخرى توفر معلومات كمية عن النصوص، بالإضافة إلى سمفيش. بعضها، مثل الشمالي لطخة أو PCR الكمي، التحقيق الجزء الأكبر وهكذا يمكن قياس عدد نسخ مرناً لا موقفهم في الخلايا الفردية. ولهذه الأساليب ليست مناسبة لقياس التغير خلية إلى خلية. تم تطوير تقنية المستندة إلى الصورة الأخيرة التي تسمح للتقدير الكمي لعدد نسخ الكشف داخل الخلايا، فضلا عن موقعها داخل الخلايا، ودعا متعدد الأسفار خطأ قوية في الموقع التهجين (ميرفيش). ميرفيش يستند تعيين رمز شريطي فريد يتألف من مجموعة محددة من عدد محدد من المسابر اليغنوكليوتيد المسمى فلوريسسينتلي. يتم قراءة هذه الرموز الشريطية في جولات متتابعة من القياسات سمفيش، مع فوتوبليتشينج بعد كل جولة من التهجين، وبالتالي زيادة الإنتاجية بأوامر اثنين من حجم9،10. يتطلب هذا الأسلوب سائل الآلي التعامل مع النظام والتصميم السليم لمجموعة التحقيق.

يتيح الجمع بين عدة fluorescence تسمية النصوص الفردية، جنبا إلى جنب مع تقنيات رواية القرار عظمى مثل التعمير البصرية العشوائية مجهرية (العاصفة)11، بزيادة عشرة إضعاف في القرار في سوبسيلولار ترجمة النصوص. في العاصفة، يسمح مزيج مناسب من المسابر الفلورسنت والمخزن المؤقت للتصوير لدورات متعددة من انبعاث الأسفار كل جزيء مسبار (وامض). كما يمكن استخدام العاصفة صورة الترنسكربيتوم كولاي ومراقبة منظمة الجينوم المنظومة المكانية من الجيش الملكي النيبالي، بوسم جميع وقائع الفائدة12في وقت واحد.

تستند كافة الأساليب وحيدة الخلية التي تم استعراضها أعلاه التصوير المحاضر في الخلايا الثابتة. ومن ثم فإنها لا توفر أية معلومات تتعلق بالخصائص الحركية للنصوص داخل الخلايا. متابعة المحاضر في الخلايا الحية13، يمكن أن تعتبرها مرناس انصهار الجينات التي تهم مجموعة من مواقع الربط. هذه الأخيرة هي ثم يقرها بروتين الحمض النووي الريبي ملزمة، مثل عاثية MS2 معطف البروتين، الذي هو تنصهر فيها بروتين فلوري مثل البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء)10،،من1415.

هنا يصف لنا طريقة لوسم مرناس الفردية مع مجموعة من المجسات الحمض النووي المسمى فلوريسسينتلي، لاستخدامها في التجارب سمفيش، ولا سيما في كولاي. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أنه يمكن استخدام نفس نظام وضع العلامات للقياسات العاصفة مع تعديلات طفيفة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-التحقيق في التصميم

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول المسابير اليغنوكليوتيد المتاحة تجارياً علامات تمييز بالفعل مع فلوروفوريس. المسابير تتكون من مجموعة من تسلسل معين مكملة لهدف مرناً، كل التحقيق يجري مترافق لجزيء فلوري واحد. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن إرفاق علامات مضيئة للتحقيقات، كما هو موضح في مكان آخر5،16.

  1. تحقيقات سمفيش التصميم باستخدام خوارزمية16 "مصمم التحقيق" وضعتها راج أرجون (van أووديناردين مختبر معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا)؛ تسلسل المسابر سمفيش المستخدمة في هذه المخطوطة المذكورة في الجدول للمواد.
    ملاحظة: الحد الأدنى لعدد من تحقيقات في مجموعة لإشارة قابلة للاكتشاف هو ~ 30. قد تختلف العدد الدقيق وفقا للجين موضع الاهتمام، خاصة إذا كان يتم قياس نصوص قصيرة جداً.
  2. اختر صبغة تناسب الإعداد الضوئية (انظر الجدول للمواد).
    ملاحظة: صبغة Cy3 أو صبغ ما يعادل بصريا مع قابلية منخفضة لتبييض الصورة ينصح بشدة. هو مرشح للتسمية المزدوجة Cy5 أو أي ما يعادل بصريا صبغ (انظر الجدول للمواد). الأصباغ مناسبة لتصوير العاصفة من مرناً المسمى تتميز بقدرتها على دورات متعددة من الانبعاثات الأسفار. يمكن استخدام بعض الأصباغ سمفيش لتصوير العاصفة (انظر الجدول للمواد). الصورة في النصوص اثنين (أو أكثر) المقابلة لجينات مختلفة في نفس الخلية، واحدة ينبغي اختيار المسابر اليغنوكليوتيد مترافق بالأصباغ الأطياف التي قد تداخل قليلاً أو لا.

2-كاشف إعداد

ملاحظة: من المهم الاحتفاظ بعينات مجانية رناسي باستخدام خالية رناسي المواد الاستهلاكية مثل نصائح ماصة المصفاة وأنابيب، والحفاظ على أي بيئة عمل نظيفة. لتفادي تدهور النصوص المستهدفة، يجب أن تكون جميع الكواشف المستخدمة بعد تثبيت الخلية خالية من نوكلاس (انظر الجدول للمواد) أو ديثيلبيروكاربوناتي (ديبك)-معاملة وتعقيمها.

  1. المخازن المؤقتة سمفيش
    1. تعد خالية من رناسي 1 x برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة، الحل مع تركيز 0.01 متر عازلة فوسفات وتركيز كلوريد الصوديوم 0.154 م، (الرقم الهيدروجيني 7.4)). تمييع خالية رناسي 10 x برنامج تلفزيوني (انظر الجدول للمواد) في خالية من نوكلياسي والمياه (انظر الجدول للمواد) في 01:10 نسبة v/v.
      1. بدلاً من ذلك إعداد معاملة ديبك 1 × برنامج تلفزيوني.
    2. تعد خالية من رناسي 2 x SSC (سترات الصوديوم المالحة المخزن المؤقت، وكلوريد الصوديوم م 0.3 في 0.03 م سترات الصوديوم، (pH 7.0)). تمييع خالية رناسي 20 x SSC (انظر الجدول للمواد) في المياه خالية من نوكلياسي في 01:10 نسبة v/v.
      1. بدلاً من ذلك، إعداد 2 تعامل ديبك x SSC.
  2. اليغنوكليوتيد المسبار حل الأسهم.
    1. إعادة حل الخليط مسبار اليغنوكليوتيد المجففة في 200 ميليلتر من المخزن المؤقت الشركة المصرية للاتصالات (10 مم تريس-HCl، 1 مم يدتا، pH 8.0) لإنشاء مخزون مسبار من 25 ميكرومتر. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، وثم دوامة وأجهزة الطرد المركزي بإيجاز.
    2. لتجنب تجميد وذوبان الأنبوب الحل الأسهم، جعل مختبرين عدة الحل الأسهم، المقابلة للمبلغ المتوقع لاستخدامه في تشغيل تجريبي واحد. تخزين في حل الأسهم في-20 درجة مئوية أو أقل وحماية من الضوء.
      ملاحظة: يمكن أن توفر مجموعة مسبار نمول 5 ردود فعل التهجين يصل إلى 250.
  3. المخزن المؤقت التهجين (عقب سكينر et al. 7 ):
    1. إضافة 5 مل نوكلاس خالية من الماء إلى أنبوب 50 مل البوليبروبيلين مخروطية الشكل السفلي. أضف 1 غرام كبريتات ديكستران للماء وحله قبل فورتيكسينج قوية. خلط المحتويات في شاكر مداري حتى تختفي فقاعات (~ 30 دقيقة).
    2. إضافة إلى ميليلتر الحل 3,530 من منزوع ميثلامين، 10 ملغ من كولاي الحمض الريبي النووي النقال، 1 مل 20 × التعاون بين بلدان الجنوب، 100 ميليلتر من مجمع ريبونوكليوسيدي فاناديل 200 ملم وميليلتر 40 50 ملغم/مل جيش صرب البوسنة. يصل الحجم النهائي إلى 10 مل بإضافة ديبك معاملة المياه أو المياه خالية من نوكلياسي، ودوامه الحل حتى أنها متجانسة.
      ملاحظة: لتجنب التجميد والذوبان من الحل، جعل مختبرين عدة الحل الأسهم، المقابلة للمبلغ المتوقع لاستخدامه في تشغيل تجريبي واحد. مخزن الحل الأسهم عند-20 درجة مئوية. تأكد من السماح ميثلامين الحارة إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح الزجاجة. للحد من الخلفية، ويقترح لمعايرة تركيز ميثلامين الأمثل (نسبة 10-40% v/v).
      تنبيه: تحذير! ميثلامين شديدة السمية وتناسليا معروفة. تجنب ملامسة العينين أو الجلد أو الاستنشاق أو الابتلاع. التعامل مع ذلك تحت غطاء دخان أثناء ارتداء معطف مختبر وقفازات واقية.
    3. تعقيم الحل بتمريره من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. تبقى في مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية إلى سنة واحدة.
  4. إعداد التثبيت المخزن المؤقت (4.6% فورمالدهايد في برنامج تلفزيوني 1 x) عن طريق إضافة 37% فورمالدهيد (v/v) إلى برنامج تلفزيوني 1 x (انظر 2.1.1) v/v نسبة 1:8 ودوامه.
    تنبيه: تحذير! الفورمالديهايد شديدة السمية ومسرطنة معروفة. التعامل مع ذلك تحت غطاء دخان أثناء ارتداء معطف مختبر وقفازات واقية.
  5. إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي سمفيش (ميثلامين 20% في 2 x SSC) عن طريق إضافة ميثلامين منزوع إلى 2 x SSC (انظر 2.1.2) v/v نسبة 1:4 ودوامه.
  6. إعداد المخزن المؤقت للتصوير سمفيش بإضافة 5 مم سيستيميني والأكسجين الزبالين (7 ميكرومتر الجلوكوز أوكسيديز، 56 نانومتر الكاتالاز، والجلوكوز 10% (w/v)) لغسل المخزن المؤقت (ميثلامين 20% في 2 x SSC)
  7. المخازن المؤقتة للعاصفة
    1. إعداد المخزن المؤقت A عن طريق إضافة HCl تريس 50 و 10 ملم كلوريد الصوديوم إلى المياه خالية من نوكلاس.
      ملاحظة: مخزن في RT لسنوات.
    2. إعداد "المخزن المؤقت ب" بإضافة 50 مم تريس-HCl، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 10% w/v الجلوكوز للمياه خالية من نوكلاس.
      ملاحظة: مخزن في 4 درجات مئوية لتصل إلى سنة.
    3. إعداد المخزن المؤقت لاتفاق بيئي متعدد الأطراف بحل سيستيميني 77 mg في 1 مل من المخزن المؤقت A (يجعل حل م 1).
      ملاحظة: يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
    4. إعداد المخزن المؤقت جلوكسي بإضافة (وحدات التعسفي) الاتحاد الأفريقي 8,440 الجلوكوز أوكسيديز والمخزن المؤقت 70,200 كاتالاز الاتحاد الأفريقي لمل 1 ألف
      ملاحظة: يجعل 50 س الحل الأسهم، يمكن تخزينه في 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
    5. إعداد المخزن المؤقت للتصوير للعاصفة بإضافة 50 مم من المخزن المؤقت لشركة طيران الشرق الأوسط و 1 × جلوكسي المخزن المؤقت إلى المخزن المؤقت ب
      ملاحظة: المخزن المؤقت تصوير للعاصفة تتكون من 5 مم سيستيميني والأكسجين الزبالين (أوكسيديز الجلوكوز ميكرومتر 7 و 56 نانومتر كتالاز) في 50 ملم تريس مع 10 ملم كلوريد الصوديوم والجلوكوز 10 ٪ على درجة الحموضة 8.0. التحضير قبل التصوير، ويمكن تخزينها والمستخدمة في RT لحوالي 2 ح.

3-نموذج التثبيت

  1. تنمو الخلايا البكتيرية (مثلاً، هاء
القولونية MG1655) في وسائط النمو خيار (مثلاً، المتوسطة رطل) بين عشية وضحاها عنان شاكر المداري في 260 لفة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لتحديد الخلفية بسبب الربط غير محددة التحقيقات، القياسات في سلالة تم حذف الجينات للاهتمام الذي ينبغي أن تجري، اتباع نفس الإجراءات (انظر Δجالك في الشكل 1 و Δسودب في الشكل 2).
  • تمييع 1: 100 الثقافة بين عشية وضحاها في متوسطة جديدة وقياس كثافته الضوئية (OD600) في جهاز المطياف الضوئي كل ح ~ 1، ما يصل إلى قيمة 0.2-0.4؛ ثقافة مل 4 ينبغي أن يكون كافياً.
    ملاحظة: إذا لم يكن لديه المجهر المختارة التباين المرحلة أو قدرات التدخل التفاضلية على النقيض، يمكن المسمى كولاي الأغشية الخارجي مع 2 ميكرومتر محبتين علامة نيون (انظر الجدول للمواد)، التي ينبغي أن تضاف إلى تعليق 20 دقيقة قبل التثبيت17من البكتيريا. إنجاز التثبيت وتلقى المزيد من العلاج كما هو موضح أدناه. ويجب الحرص على اختيار علامة نيون وجود طيف انبعاث مختلفة، للتقليل من التداخل الطيفي مع مجموعة مسبار المسمى.
  • خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 4,500 ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية من جميع الأنابيب.
  • أضف 1 مل من 1 x برنامج تلفزيوني لكل أنبوبة وريسوسبيند بيليه للتقليل من خلية إلى التجميع. قم بإضافة 4 مل من المخزن المؤقت للتثبيت ودوامه بلطف.
  • احتضان عينات في شاكر مداري 260 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 24 درجة مئوية.
  • خلايا بيليه بالطرد المركزي ل 10 دقيقة، 1,000 ز، 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية. إضافة مل 1 1 x برنامج تلفزيوني.
  • نقل تعليق إلى أنابيب صغيرة-أجهزة الطرد المركزي 1.8 مخروطية الشكل السفلي ميليلتر (انظر الجدول للمواد) وكرر الخطوة 3، 6 مرتين.

    • 4-نموذج بيرميبيليزيشن

    1. إزالة المادة طافية بعناية فائقة. استخدام الماصات صغيرة الحجم، إذا لزم الأمر، لإزالة جميع السائل خارج بيليه.
    2. ريسوسبيند في 300 ميليلتر ديبك معاملة المياه أو المياه خالية من نوكلاس. إضافة درجة عالية ميليلتر 350 الإيثانول المطلق (99 ٪) وتخلط بلطف بعكس الأنبوب. إضافة آخر ميليلتر 350 الإيثانول والمزيج مرة أخرى، للوصول إلى تركيز إيثانول نهائي من 70% (نسبة v/v).
      تنبيه: تحذير! الإيثانول قابل للاشتعال.
    3. تدوير العينة مع المدورة أنبوبة 20 لفة في الدقيقة ح 1 في درجة حرارة الغرفة (RT)، أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. قد يتم تخزين العينات عند 4 درجة مئوية إلى أسبوع واحد.

    5-التهجين

    1. خلايا بيليه بالطرد المركزي لدقيقة 7، 750 س ز، 4 درجة مئوية. إزالة المادة طافية.
    2. أضف 1 مل 20% يغسل المخزن المؤقت للعينات وترك مكانة لعدة دقائق، أو ماصة لإذابة بيليه تماما.
    3. خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة دقيقة 7، في س 750 ز، 4 درجة مئوية.
    4. إزالة المادة طافية بلطف جداً من بيبيتينج. استخدام الماصات صغيرة الحجم إذا لزم الأمر لإزالة جميع السائل خارج بيليه.
    5. إضافة تعيين المسبار اليغنوكليوتيد حل الأسهم إلى قاسمة المخزن المؤقت التهجين حيث يكون تركيز اليغنوكليوتيد النهائي 250 نانومتر؛ الدوامة بقوة.
      ملاحظة: واحد تسمية مرناس مستهدفة مختلفة اثنين أو أكثر في وقت واحد في نفس الخلية. إضافة مجموعات التحقيق من كلا الهدفين إلى المخزن المؤقت التهجين. ويجب الحرص على اختيار الأصباغ بعد مختلف أطياف الانبعاث للتقليل من التداخل الطيفي (مثلاً، Cy3 و Cy5). تأكد من أن العينات المقصود لتصوير العاصفة هي تهجين مع مسبار اليغنوكليوتيد تعيين مترافق مع صبغة مناسبة للعاصفة (مثلاً، في الجدول للمواد).
    6. تعليق عينات (راجع الخطوة 5، 4) في 50 المخزن المؤقت التهجين ميليلتر يحتوي على مجسات اليغنوكليوتيد، مع تجنب توليد فقاعات (الحل لزج تماما).
    7. ترك عينات بين عشية وضحاها في كتلة ساخنة في 30 درجة مئوية في الظلام.
      ملاحظة: بعد هذا، عينات قد تكون مخزنة لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية.

    6-الغسل

    1. استخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي جديد واحد لكل عينة للصورة. أضف 1 مل أغسل المخزن المؤقت.
    2. إضافة 10-15 ميليلتر من العينات المهجن إلى الأنبوب الجديد الذي يحتوي على المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، ومزيج/دوامة.
    3. خلايا بيليه بالطرد المركزي لمدة 7 دقائق، 750 غ س في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
      ملاحظة: للحد من الخلفية، احتضانها ح 1 في 30 درجة مئوية.
    4. تغسل مرتين أكثر (ريسوسبيند في 1 مل أغسل المخزن المؤقت والطرد المركزي وإزالة بيليه).
    5. ريسوسبيند في 25 ميليلتر يغسل العازلة.
      ملاحظة: بغية الحد من تبييض الصورة واحد إضافة إلى المخزن المؤقت يغسل أكسجين مسح النظام (2.6) لتحسين الاستقرار صبغ في صف واحد-جزيء تجارب6.

    7-إعداد العينات للتصوير

    ملاحظة: الخلايا بحاجة إلى أن تكون معطلة من أجل السماح بتصوير السليم تحت مجهر الأسفار وعلى النقيض للمرحلة. يمكن استخدام الأساليب التالية لإعداد العينات التي يمكن تصويرها عرض لحقول مختلفة في مختلف الطائرات المحورية.

    1. إعداد [اغروس] هلام
      1. إضافة 150 ملغ [اغروس] إلى 10 مل 2 x SSC المخزن المؤقت. لا تقم بإضافة 2 x SSC على [اغروس]، وأﻻ فإنها سوف لا تذوب بشكل صحيح.
      2. الموجات الدقيقة عن 10-15 ثانية كل مرة حتى تبدأ فقاعات كبيرة في النموذج. جانبا لتبرد لبضع دقائق.
      3. ضع إطار سيليكون فصل على الشريحة حتى يظل مركز الشريحة المكشوفة.
      4. ضع حلقة جامدة على مستوى (1-2 مم) 10 ملم في وسط الشريحة وإيداع كمية صغيرة من هلام، للختم. انتظر لبضع دقائق لأنها تتصلب.
      5. إضافة هلام أكثر حتى يتم تشكيل شكل قبة عالية. انتظر 10 دقائق لذلك تصلب، وإزالة الطوق (باستخدام الملقط غرامة أو أي طريقة أخرى).
      6. إيداع ~ 10 ميكروليتر من غسلها الخلايا البكتيرية (انظر 6.5) على جل وختم مع شريحة ساترة #0.
    2. إعداد نموذج الدائرة سمفيش
      1. وبدلاً من ذلك (في الخطوة 7، 1) إعداد العينات للتصوير بشل حركة الخلايا البكتيرية غسلها (انظر 6.5) على الزجاج بولي-د-يسين-المغلفة أسفل المتاح أطباق بيتري البلاستيك.
      2. احتضان هذه العينات في الظلام، في درجة حرارة الغرفة، بين عشية وضحاها قبل التصور للسماح لالتصاق الخلايا إلى السطح. قبل التصور يغسل مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (-5)؛ الاحتفاظ بالعينة رطبة مع الغسيل buffer(2.5) أو تصوير المخزن المؤقت لسمفيش (2.6).
    3. إعداد نموذج الدائرة للعاصفة
      1. إعداد العينات للعاصفة للتصوير على الزجاج بولي-د-يسين-المغلفة أسفل المتاح أطباق بيتري البلاستيك.
      2. احتضان هذه العينات في الظلام، في الرايت، بين عشية وضحاها. قبل التصور يغسل مرة واحدة مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي سمفيش (2.5)؛ وإضافة المخزن المؤقت للتصوير للعاصفة (2.7.5).

    8.التصور نسخة

    1. صورة الخلايا مع مجهر الأسفار واسع المجال مجهزة بمرحلة إليه (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: لتعديل العاصفة، واستخدام الخلايا المسماة مع صبغة قادرة على دورات متعددة من الانبعاثات الأسفار. صورة العينة باستخدام نظام التصوير 3D القرار العظمى (مثلاً، انظر الجدول للمواد).
    2. استخدام (مستحسن) 60-100 × N.A > النفط 1.3 الغمر مرحلة التباين الهدف العدسة مع مصدر ضوء قوي، مثل الزئبق أو مصباح هاليد معدني؛ ويوصي أيضا مصادر الضوء على أساس الصمام.
    3. استخدام معيار تبريد كاميرا CCD، الأمثل من الناحية المثالية للتصوير الإضاءة المنخفضة المستوى بدلاً من السرعة (نستخدم كاميرا بحجم بكسل ميكرومتر 16) (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: الاستخدام من امككد تبريد (إلكترون ضرب الجهاز المسؤول إلى جانب) كاميرا CCD كاميرا ضروري للحد من الضوضاء الحرارية الذي يمنع كشفها، لا سيما من جزيئات مفردة.
    4. استخدام عامل تصفية مجموعات مناسبة فلوروفوريس اختياره.
    5. لتحديد بشكل صحيح حدود الخلية, الحصول على صور عرض لحقول مختلفة في كل عينة مع مرحلة التباين البصريات، أو بوصفها فلوريسسينتلي غشاء الخلية الخارجي. الحصول على الصور في مختلف الطائرات المحورية (z-المكدس) لجميع القنوات (عادة ما تكون مفصولة شرائح 13 250 نانومتر وتؤخذ).
      ملاحظة: ينبغي أن تسيطر مرحلة يجهز المجهر ومجموعات التصفية عليها التجارية (انظر الجدول للمواد) أو البرامج الداخلية التي يمكن التقاط كومة من الصور في تسلسل.

    9-بيانات التحليل

    1. تحويل رصات الصور بشكل ملائم لتحليل البيانات.
    2. تقدير عدد نسخ الهدف مرناً من مجموع شدة الفلورسنت البؤر في الخلية بدلاً من عد منفصلة 'البقع' كما هو الحال في غيرها من البروتوكولات المتوفرة حاليا.
    3. القيام بتحليل الصور مع برمجيات المصدر المفتوح18 أو مع برنامج المواصفات. للاطلاع على تفاصيل تصوير البيانات والتحليل انظر سكينر et al. 7

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    قمنا بتنفيذ قياسات سمفيش النصوص جالك وسودب في الخلايا كولاي . تم تهجين النصوص مع مجموعة من تسلسل معين مكملة لتسلسل المستهدفة، كل التحقيق يجري مترافق لجزيء فلوري واحد (انظر الجدول للمواد). الأسفار والمرحلة على النقيض من الصور من MG1655 البرية من نوع سلالة كولاي (WT) أو JW0740 (مجموعة كيو)19 حذف جالك سلالة (Δجالك) تعرضوا إلى 2 ملم د-فوكس مبينة في الشكل 1A و 1B. تم إصلاح خلايا على الأقل 3 ح بعد ...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    وقد قمنا بقياس في المختبر عدد نسخة من جينات مختلفة في الخلايا كولاي باستخدام الأسلوب سمفيش2. باختصار، هذا الإجراء يتكون من الخطوات التالية: تثبيت الخلية، permeabilization الأغشية للسماح لاختراق التحقيق، التحقيق في التهجين، وعينه التصوير باستخدام مجهر الأسفار قياسية. ويستند هذا الإجراء تلك المنشورة سابقا مع بعض التعديلات6،،من716. قيل سابقا أن سمفيش يتطلب أن عدد المجسات اليغنوكليوتيد تكمن في حدود 4...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    شكر وتقدير

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    أيد هذا العمل منحة من "مؤسسة العلوم إسرائيل" 514415 (إلى ج. س.) وقوات أمن الحدود الهندية-جبهة الخلاص الوطني (المجلس) منحة 2016707 (ج. س.). دعم من سيغفريد وأولمان إيرما كرسي الأساتذة (إلى ج. س.) من المسلم به أيضا.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    ملح كبريتات ديكستران الصوديومسيجما ألدريتشD8906
    إيثانول نقي ، 99.5٪ ، كاشف ACS ،مالينكرودت بيكر مطلق - أفانتور8025.25
    ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)سيجما ألدريتشD5758
    خالية من RNase 20X SSCLife Technologies / AmbionAM9763
    RNase خالية من 10X PBSLife Technologies / AmbionAM9625
    TE عازلة (10 ملي مولار Tris-HCl ، 1 ملي مولار EDTA ، درجة الحموضة 8.0) BioUltra ، للبيولوجيا الجزيئيةSigma-Aldrich93283
    ماء خال من النوكليازمحلول فورمالديهايد 10977035
    Thermo Fisher Scientific للبيولوجيا الجزيئية ، 36.5-38٪ في الماءSigma-AldrichF8775
    فورماميد منزوع الأيونات ، خال من النوكليازThermo Fisher Scientific / AmbionAM9342
    الإشريكية القولونية tRNA (الحمض النووي الريبي ، نوع النقل xx من الإشريكية)Sigma-AldrichR1753-500UN
    UltraPure BSA (50 مجم / مل) ThermoFisher Scientific / AmbionAM2616
    مركب فاناديل ريبونوكليوزيد ، VRC ، 200 ملي نيوإنجلاند BiolabS1402S
    Poly-L-LysineSigmaP4707
    السيستيمين والأكسجينسيجما ألدريتش30070
    الجلوكوز أوكسيديز من الرشاشيات النيجر ، النوع السابع ، 50KUسيجما ألدريتشG2133
    كاتالازسيجما ألدريتشC40
    D-الجلوكوزسيجما ألدريتشG8270
    D-fucoseSigma-AldrichF8150
    Vybrant DiO Cell-Labeling Cell تقنياتV2286
    Agarose ، كاشف ذوبان منخفضSigma-AldrichA9414
    عازل سيليكون لاصق 24-2 مم ضياء. × 1.8 مم عمق JTR24R-A2-2.0Grace Bio-LabsJTR24R-A2-2.0 < / span>666208
    بولي D-lysine الزجاج المطلي بصحن ثقافة القاع الزجاجيMatTek CorporationP35GC-1.5-14-C
    قفازات فحص خالية من مسحوق النتريل سوبر لايفماكسTC-N-9889
    حاضنة تعقيم العلامة التجاريةأنابيب الطرد المركزي الدقيقة سيجما ألدريتشBR61750
    (1.8 مل)Axygen - Corning Life SciencesMCT-175C
    Falcon أنابيب البولي بروبيلين المستديرة القاع (14 مل)BD Biosciences352059
    جهاز طرد مركزي مخروطي القاع البولي بروبيلين أنابيب (50 مل)ماصات كورنينج430828
    مصلية (كورنينج 5 مل)كورنينج لايف ساينسز4051
    ماصات مصلية (كورنينج 10 مل)كورنينج لايف ساينسز4488
    ماصات مصلية (كورنينج 25 مل)كورنينج لايف ساينسز4251
    كوفيت مقياس الطيفالضوئي سارستيدت67.742
    أطراف ماصة خالية من RNase 0.2 - 20 & mu; لمن FroggaBioFT20
    RNase 10 - 200 & لخالية من Axigene / corningTF-200
    RNase 100 - 1000 مو ؛ لأطراف ماصة خالية من FroggaBioFT1000
    RNase 100 - 1000 & لسورنسون14200
    حقنة التخلص من 10 مل إبرة G-21بيكتون ديكنسون ، العلوم البيولوجيةBD-309643
    مينيسارت 0.2 ميكرومتر مرشح حقنةسارتوريوس16534 K
    أدوات نيكون مجهر من النوع A زيت الغمر أ ، 8 سم مكعبشرائح مجهر نيكونMXA20233
    76 × 26 ، 3 × 1 بوصة × 1 ممثيرمو فيشر العلمي421-004ET
    # 0 شريحة غطاء 24x60ثيرمو فيشر العلمية / MenzelBNBB024060A0
    شاكر مداريM.R.CTOU-50
    كتلة ساخنةM.R.C
    VortexFried Electric CompanyG-560-E
    الطرد المركزيEppendorf5427R
    الطرد المركزيEppendorf5810R
    المحمولة Pipet-Aid XP2 ، وحدة تحكم الماصةDrummond Scientific Company4-000-501-I
    OD600 مقياس الطيف الضوئي لمعدلات نمو البكتيريا مقياس DiluPhotometerMidsciOD600-10
    iXon X3 EMCCD كاميراAndorDU-897E-CS0-#BV
    Eclipse Ti مجهرنيكونMEA53100
    خطة CFI apochromat DM 100X هدف الزيت lambda PH-3 NA 1.45 WD 0.13مجموعة مرشحاتنيكون MRD31905
    (TRITC / CY3): EX - ET545 / 30X ؛ EM - ET620 / 60M ؛ BS - T570LPنيكون49005
    مجموعة المرشحات (CY5): EX - ET640 / 30X ؛ EM - ET690 / 50M ؛ BS - T660Pنيكون49009
    نيس عناصر AR إعادة البحث التلقائي البرمجياتنيكونMQS31000
    STORM مجهرVutaraSR-200
    NA 1.2 الغمر في الماء الهدف < / span>Olympus
    SRX الحصول على الصور وتحليل البرمجياتVutara
    Evolve 512 كاميراEMCCDالقياسات الضوئية
    Stellaris & reg; مجسات FISH ، فحص مخصص مع CAL Fluor & reg ؛ Red 590 صبغBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
    Probe Sequence for galK mRNA: < / قوي>
    gtgttttttctttcagactc
    tagccaaatgggtgtgagtggcaaa
    ctgaatggtgtggcag
    caccaatcaaattcacgggg
    ACGAAACCGTCGTTGTAGTC
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtggcacaactgatcacg
    acgggaactttacgcatc
    gctgattttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacggg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgcgcaagcgttgaac
    ggcgttttcagtcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacgggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    ggatcagcgcgacgagatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctgtttttt
    ctccttgtgatggtttacaa
    Stellaris® مجسات FISH ، فحص مخصص مع Quaser Fluor & reg ؛ Red 670 DyeBiosearch Technologies IncSMF-1083-5
    Probe Sequence for sodB mRNA: < / قوي>
    gtgttttttttctcagactc
    tagccaaatgggtgtgagtggcaaa
    ctgaatggtgtggcag
    caccaatcaaattcacgcgg
    ACGAAACCGTCGTTGTAGTC
    tgataatcaatcgcgcaggg
    gtggtggcacaactgatcacg
    acgggaactttacgcatc
    gctgattttcataatcggct
    gcatcgagggaaaactcgtc
    gttttcatgtgcgacaatgg
    cacgccacgaacgtagttag
    ttacgcagttgcagatgttt
    tccagtgaagcggaagaact
    tgctgcaatacggttccgac
    gtccagcggcagatgataaa
    tgaccgttaagcgcgatttg
    agcctacaaactggttttct
    gcggaaattagctgatccat
    aaggcatgatctttcttgcc
    cagtgagcggcaatcgatca
    tgggcatggaaactgctttg
    gatgatgacgacagccacac
    ggtttcgcactgttcacgac
    tggctgctggaagaaacggg
    ttcaatggtgacatcacgca
    catgcgcaagcgttgaac
    ggcgttttcagtcagtatat
    atacgtttcaggtcgccttg
    tgagactccgccatcaactc
    gaaatcatcgcgcatagagg
    caatttgcggcacgggtgatt
    ttgacgatttctaccagagt
    acctttgtcgccaatcacag
    ggatcagcgcgacgagatacag
    atattgttcagcgacagctt
    gtctctttaatacctgtttttt
    ctccttgtgatggttttacaa
    Life سوبر شريط أطراف ماصة خالية أطراف ماصة أجهزة الدقيقة أجهزة gggtacgtttgagtgtttcgctgccaacgggtacgtttgagtgtttcgctgccaac

    المراجع

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Tsimring, L. S. Noise in biology. Reports Prog. Phys. 77 (2), 26601(2014).
    2. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    3. Arbel-Goren, R., et al. Effects of post-transcriptional regulation on phenotypic noise in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 41 (9), 4825-4834 (2013).
    4. van Gijtenbeek, L. A., Robinson, A., van Oijen, A. M., Poolman, B., Kok, J. On the Spatial Organization of mRNA, Plasmids, and Ribosomes in a Bacterial Host Overexpressing Membrane Proteins. PLOS Genet. 12 (12), e1006523(2016).
    5. Raj, A., vanden Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
    6. Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472 (10), Elsevier Inc. (2010).
    7. Skinner, S. O., La Sepúlveda,, Xu, H., Golding, I. Measuring mRNA copy number in individual Escherichia coli cells using single-molecule fluorescent in situ hybridization. Nat. Protoc. 8 (6), 1100-1113 (2013).
    8. Barakat, T. S., Gribnau, J. Combined DNA-RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) to study X chromosome inactivation in differentiated female mouse embryonic stem cells. J. Vis. Exp. (88), e51628(2014).
    9. Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S., Zhuang, X. RNA imaging. Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells. Science. 348 (6233), aaa6090(2015).
    10. van Gijtenbeek, L. A., Kok, J. Illuminating messengers: An update and outlook on RNA visualization in bacteria. Front. Microbiol. 8, 1-19 (2017).
    11. Fei, J., et al. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
    12. Moffitt, J. R., Pandey, S., Boettiger, A. N., Wang, S., Zhuang, X. Spatial organization shapes the turnover of a bacterial transcriptome. Elife. 5, 1-22 (2016).
    13. Ong, W. Q., Citron, Y. R., Sekine, S., Huang, B. Live Cell Imaging of Endogenous mRNA Using RNA-Based Fluorescence "Turn-On" Probe. ACS Chem. Biol. , (2016).
    14. Golding, I., Paulsson, J., Zawilski, S. M., Cox, E. C. Real-time kinetics of gene activity in individual bacteria. Cell. 123 (6), 1025-1036 (2005).
    15. Golding, I., Cox, E. C. Chapter 8 Spatiotemporal Dynamics in Bacterial Cells: Real-Time Studies with Single-Event Resolution. Methods Cell Biol. 89 (8), Elsevier Inc. (2008).
    16. So, L. H., Ghosh, A., Zong, C., Sepulveda, L. A., Segev, R., Golding, I. General properties of transcriptional time series in Escherichia coli. Nat. Genet. 43 (6), 554-560 (2011).
    17. Spahn, C., Endesfelder, U., Heilemann, M. Super-resolution imaging of Escherichia coli nucleoids reveals highly structured and asymmetric segregation during fast growth. J. Struct. Biol. 185 (3), 243-249 (2014).
    18. Sliusarenko, O. Microbetracker software. Mol Microbiol. 80 (3), 612-627 (2012).
    19. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol. Syst. Biol. 2, 8(2006).
    20. Arbel-Goren, R., et al. Transcript degradation and noise of small RNA-controlled genes in a switch activated network in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6707-6720 (2016).
    21. Brandt, U. A two-state stabilization-change mechanism for proton-pumping complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1807 (10), 1364-1369 (2011).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

    طلب إذن

    الوسوم

    Single molecule FISHE coli mRNA labelingvisualizationFluorescent oligonucleotide probesBacterial cell fixationPermeabilization protocolHybridization bufferAgarose gel mountingFluorescence microscopySTORM imaging

    مقالات ذات صلة