لوسيفراس "التكامل بالتصوير الإنزيم" في أوراق نيكوتيانا بينثاميانا "تحديد عابر ديناميات التفاعل" البروتين-بروتين

بغية تنسيق النمو مع بيئتها، تطورت نباتات أنيقة مسارات إشارات الشعور، ترانسدوسي، وتستجيب لمنبهات إرسال الإشارات. مثل العدائين في سباق التتابع، هي البروتينات اللاعبين اللازمة في توصيل الإشارة النبات. وقد اعترف على نطاق واسع أن التفاعل البروتين-بروتين (PPI) يلعب دوراً رئيسيا للاتصالات الخلوية. الفسفرة البروتين، أسيتيليشن، والتدهور كلها تعتمد على التفاعل بين بروتين المستهدف والأنزيمات في تعديل البدنية. على سبيل المثال، جاسموناتي زيم-المجال البروتين (JAZ) البروتينات الأسرة تتفاعل مع عامل النسخ MYC2 وقمع النشاط الترانسكربتي^1،2. ونظرا لأهمية PPI، استكشاف البروتين على نطاق واسع وقد تم إينتيراكتوميس في النباتات مؤخرا^3،،من⁴⁵. وتكشف هذه النتائج إينتيراكتومي كذلك الشبكة التنظيمية المعقدة التي تنسق الوظائف الخلوية المتنوعة.

وهناك بعض النهج المتبعة لرصد PPI. والرزن هجين (Y2H) الخميرة اثنين هو الأسلوب الأكثر استخداماً للكشف عن نقطة في البوصة. Y2H سهل لأداء، ومناسبة لاختبار سريع لدراسة تفاعلات البروتين. Y2H يستخدم أيضا على نطاق واسع لفحص الشركاء التفاعل غير معروف للبروتين محددة من الفائدة. ومع ذلك، لأنه يتم Y2H تماما في الخميرة، أنه لا يمكن أن تعكس السيناريو الحقيقي في مصنع الخلايا ويصل ارتفاع معدلات إيجابية كاذبة. استراتيجية مماثلة أخرى هي المقايسة المنسدلة. وبصفة عامة، اثنين من البروتينات هي أعرب وتنقيته من خلايا الإشريكيّة القولونية ثم مختلطة ومعطلة للكشف عن تفاعلات البروتين. على الرغم من أن هذا الأسلوب لا تستغرق وقتاً طويلاً، فإنه لا يمكن الحصول على في فيفو نتائج التفاعل أما. الأغراض في فيفو التفاعل، co-إيمونوبريسيبيتيشن (شركة للملكية الفكرية) هو التحليل الأكثر شعبية، مما يتطلب جسم عالية الجودة إلى إيمونوبريسيبيتاتي البروتين من الفائدة، ولا يمكن استبعاد إمكانية القياسية غير المباشرة. وعلاوة على ذلك، بسبب الإجراءات المعقدة التجريبية في شركة للملكية الفكرية، عادة ما تختلف النتائج مع الخبرة الفردية.

إلى حد كبير دفع مراسل على أساس إعادة تشكيل فحوصات الكشف عن في فيفو PPI. وتشمل هذه الأساليب fluorescence الرنين الطاقة نقل (بكى)⁶و bimolecular fluorescence التكامل (بيفك)⁷والتكامل لوسيفراس اليراع التصوير المقايسة (نادي لايونز الدولي)⁸. على الرغم من أن هذه النهوج الثلاثة أفضل من شركة للملكية الفكرية لكي تعكس المباشرة في فيفو PPI والحنق وبيفك مجاهر محددة للكشف عن إشارات الأسفار بحاجة إلى ولا يمكن بسهولة قياس كثافة التفاعل. وفي المقابل، نادي لايونز الدولي يستفيد من لوسيفراس اليراع، الذي سوف توهج بعد التفاعل مع ما لوسيفرين الركيزة. الأهم من ذلك، يمكن تحديد كثافة PPI من قيمة النشاط لوسيفراس. وهكذا، يشير نادي لايونز الدولي ليس فقط عما إذا كانت البروتينات هما التفاعل أو لا، ولكن يقدم أيضا معلومات عن ديناميات التفاعل على المعاملة. على الرغم من أن هناك بعض الأساليب المتبعة لرصد التفاعل القوى المحركة (استناداً إلى التحولات الرنين أو الاستقرار الحرارية السطحية مأكل مثل الطحين)^9،10، تتطلب هذه النهج الصكوك الحساسة أو وضع العلامات المحددة. على النقيض من ذلك، أسهل لتنفيذ والكشف عن نادي لايونز الدولي.

المبدأ لنادي لايونز الدولي هو أن نصفي الأمينية الطرفية ومحطة الكربوكسيل من لوسيفراس (اسمه لوك ن أو ج-لوك، على التوالي) كانت تنصهر مع البروتين أ وب، وهذه الانصهار اثنين في نفس الوقت أعرب البروتينات في الخلايا النباتية. إذا كان A البروتين يتفاعل مع البروتين ب، ثم سيعاد نصفي لوسيفراس أن إنزيم لوسيفراس نشطة. ويمكن الكشف عن نشاط لوسيفراس مع luminometer أو كاميرا CCD. ليس من الضروري الحصول على ترانسفورمانتس مستقرة لنادي لايونز الدولي؛ التعبير عابرة ما يكفي للحصول على نتيجة تفاعل عالية الجودة.

عصابة من نوع E3 ubiquitin ليجاسى التأسيسي فوتومورفوجينيك 1 (COP1) تتفاعل مع عدد ضخم عوامل النسخ ويعزز تدهورها من خلال بروتوزوم 26S¹¹. بعض هذه العوامل COP1 التي تستهدف النسخ هي إيجابية المنظمين فوتومورفوجينيسيس. في الظلام، يتفاعل COP1 مع القامع phytochrome A-105 1 (SPA1)، الذي يعزز النشاط COP1 E3⁸. بعد تصور الضوء، سوف تلغي فوتوريسيبتورس التفاعل COP1-SPA1 تكبح النشاط COP1 واستقرار ثم COP1 ركائز^12،،من¹³¹⁴. يوضح هذا المثال الأهمية البيولوجية لدراسة نقطة في البوصة وتحديد الديناميات PPI.

1-إعداد النباتات (8 أسابيع)

1. وضع 50 نيكوتيانا بينثاميانا البذور في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل واحد يحتوي على 1 مل 5% ناكلو والحل Triton X-100 (V/V) 0.1% وإجازة لمدة 5 دقائق لتعقيم البذور.
2. وقف البذور في 200 ميليلتر من الماء المعقم وشطف البذور مع الماء المعقم 5 مرات.
3. بدقة مكان البذور الفردية على السطح من مرض التصلب العصبي المتعدد-أجار المتوسطة (1 l: 1 × الأملاح Murashige & سكوغ، السكروز 10 جرام، درجة الحموضة 5.8 (كوه)، 1% أجار) مع نصائح الجميلة ومخزن ألواح متوسطة في 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام لمزامنة الإنبات.
   ملاحظة: لتجنب التلوث بميكروب، تنفيذ هذه الخطوة على مقاعد البدلاء نظيفة. فإنه ليس من الضروري أن يهز الأنبوب أثناء التعقيم.
4. وضع لوحات متوسطة تحت ظروف النمو الطبيعي (22 درجة مئوية، µmolm 80-90^-2s^-1 الأبيض شدة الضوء) لمدة 10 أيام، ومن ثم نقل الشتلات نبتت في التربة.
   ملاحظة: تأكد من إدراج جذور الشتلات في التربة، ولا تضر الجذور. تغطي صينية بغطاء بلاستيكي شفاف بين عشية وضحاها للحفاظ على رطوبة.
5. زراعة النباتات في غرفة نمو التي تسيطر عليها على ح 16/8 ح ضوء/الظلام دورة و 70% رطوبة. 7-أسبوع نباتات بينثاميانا أ على استعداد للتسلل أجروباكتيريومتوميفاسينس (الشكل 1أ).
   ملاحظة: المياه والنباتات ومكافحة الآفات حسب الحاجة للحفاظ على صحة النباتات.

2-عابر التعبير في أوراق بينثاميانا أ (7-10 أيام)

1. تسليم 150 نانوغرام من البلازميدات (بلازميد التحكم بجاد-ها-لوك ومتجه فارغة بلازميد شيدت لنادي لايونز الدولي الاعتداء، وفي هذه الحالة كنا نلوك pCAMBIA1300 و pCAMBIA1300-كلوك للبناء بلازميد) في الخلية المختصة A. tumefaciens سلالة GV3101 مع الأسلوب انهانسر القياسية.
2. الثقافة A. tumefaciens في بيرتاني لوريا (رطل) أجار المتوسطة (1 l: 10 جرام كلوريد الصوديوم، خلاصة الخميرة ز 5، تريبتوني ز 10، 1.5% أجار) التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل من الريفامبيسين في 28 درجة مئوية لمدة 4 أيام.
   ملاحظة: يعتمد اختيار المضادات الحيوية على الناقل وسلالة A. tumefaciens المستخدمة.
3. تطعيم واحدة واحدة مستعمرة توميفاسينس أ من كل لوحة إلى 3 مل من رطل متوسطة السائلة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل من الريفامبيسين وتهز 220 لفة في الدقيقة عند 28 درجة مئوية عن 24 ساعة لنشر ثقافة الخلية.
4. نقل ميليلتر 75 من ثقافة البكتيرية في 15 مل المتوسطة السائل رطل الطازجة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين و 50 ميكروغرام/مل من الريفامبيسين، إذابته بمقدار 200. الثقافة البكتيريا 220 لفة في الدقيقة عند 30 درجة مئوية لحوالي 8 ساعات، حتى OD₆₀₀ ما بين 0.5 إلى 1.0.
5. نقل ثقافة A. tumefaciens السائلة في أنابيب الطرد المركزي 15 مل والطرد المركزي في س 4,000 ز و 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة تجاهل المادة طافية وتعليق بيليه في 15 مل من محلول التحول غسل بيليه.
6. تدور الأنبوب في 4,000 س ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، وتجاهل المادة طافية. كرر الخطوة الغسيل مرة أخرى.
7. ريسوسبيند بيليه في 5 مل من محلول التحول والحفاظ على ح 2 في درجة حرارة الغرفة. ضبط كثافة A. tumefaciens بيليه الخلايا مع الحل التحول حتى يكون التركيز النهائي OD₆₀₀ 0.5 أو عينتين ميكس مع حجم متساو لتفاعلات البروتين إقران اختبار.
8. التسلل الخلايا مع وقف التنفيذ إلى 4^ال أن يترك^ال 7 مع حقنه needleless 1 مل (الشكل 1ب-ج). بعد تسلل، تغطي النباتات فورا بغطاء بلاستيكي أسود ووضع الدرج في الظلام ح 12. وبعد ذلك، تنمو النباتات كالمعتاد لمدة 2 إلى 4 أيام قبل الكشف عن الأنشطة لوك.
   ملاحظة: اختيار أوراق صحية ذات حجم مماثل. التسلل من أربع مناطق مختلفة في ورقة واحدة على ما يرام.

3-الكشف عن نشاط لوسيفراس (يوم واحد)

ملاحظة: هناك طريقتان لمراقبة نشاط لوسيفراس. واحد يقوم على التصوير، والآخر قياس كمي النشاط لوسيفراس.

1. أسلوب التصوير
   1. فصل جريد تسلل ووضع كراسة كاملة على مرض التصلب العصبي المتعدد-أجار المتوسطة.
   2. رذاذ لوسيفرين العامل المخزن المؤقت على سطح أوراق أداكسيال مع زجاجة رذاذ 50 مل. الحفاظ على هذه المواد في الظلام لمدة 5 دقائق إخماد الكلوروفيل السيارات-الأسفار.
   3. استخدام الضوء المنخفض تبريد اتفاقية مكافحة التصحر التصوير جهاز (تبريد إلى-30 درجة مئوية) لالتقاط الصور (الشكل 2). وقت التعرض المقدمة في ضوء 50 مرض التصلب العصبي المتعدد، ووقت الكشف عن التﻷلؤ 1 دقيقة.
      ملاحظة: تعديل المعلمات وفقا لدليل الجهاز. وسيعزز درجات حرارة أقل نسبة الضوضاء إشارة تحسين جودة الصورة.
2. وبدلاً من ذلك، قياس التﻷلؤ مباشرة مع لومينوميتير تجارية.
   1. بعناية قطع الشظايا ليف (حوالي 0.25 سم²) من منطقة التسلل من أوراق بينثاميانا أ وتزج القرص ليف في 100 ميليلتر من المياه في لوحة بيضاء 96-جيدا (الشكل 3).
   2. إضافة 10 ميليلتر لوسيفرين العامل المخزن المؤقت، وتترك لمدة 5 دقائق. ثم إجراء علاجات محددة لدراسة ديناميات التفاعل البروتين.
      ملاحظة: اكتشاف التﻷلؤ مع luminometer في نقاط زمنية مختلفة للحصول على ديناميات النشاط لوسيفراس، التي تمثل حركية تفاعلات البروتين البروتين تحت معاملة معينة. ومزايا هذا الأسلوب لاختبار عدد كبير من البروتين أزواج في وقت واحد. للذين لا يملكون لومينوميتير تجارية، دراسة وفرة البروتين لوسيفراس بوصمة عار الغربية، ولذلك يشير إلى كوانتيتيفيلي النشاط لوك. إذا كان الضوء لا يشترط بالضرورة، مجرد إبقاء اللوحة في لومينوميتير وقياس التﻷلؤ في نقاط زمنية مختلفة. خلاف ذلك، نقل اللوحة إلى غرفة نمو خلال الفجوة الكشف. للحصول على نتائج مهمة إحصائيا، استخدم replicates البيولوجية ثلاثة على الأقل. على الرغم من أن تتنوع أنشطة لوك من مناطق مختلفة من عمليات التسلل، تنسجم أنماطها المتغيرة بعد التطبيع.

يمكن إيراد ثلاث خطوات رئيسية في هذا البروتوكول التكامل لوسيفراس لدراسة البروتين-بروتين تفاعلات في فيفو، بما في ذلك نمو النبات، وتسلل التبغ، والانزيم لوسيفراس. أن الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو تسلل في السائل A. tumefaciens يترك أ. بينثاميانا (الشكل 1).

هنا مثال على فائدة هذا الأسلوب يؤكد jasmonate الحد من التفاعلات COP1-SPA1. كانت تنصهر النصفين الأمينية الطرفية ومحطة الكربوكسيل من لوسيفراس مع COP1 (COP1-نلوك) أو SPA1 (كلوك-SPA1)، على التوالي. COP1-SPA1 التفاعلات يؤدي تكامل لوسيفراس الفنية. النشاط لوسيفراس تم تصويرها بكاميرا CCD (الشكل 2)، ويمكن الكشف عن النشاط الأنزيمي مع لومينوميتير (الشكل 3). استبعاد إمكانية أن لوسيفراس نفسها ويتأثر بالعلاج، والجين لوسيفراس كامل طول (لوك) كان أيضا عابر المعرب عنها في أوراق بينثاميانا أ ليكون بمثابة عنصر تحكم. تم تعيين النشاط لوسيفراس قبل العلاج جاسموناتي (الوقت 0) ك 1 ومن ثم تم تطبيع كل قيمة النشاط لوسيفراس التي تم الحصول عليها تحت العلاج جاسموناتي مع مرور الوقت 0 للحصول على نشاط لوسيفراس النسبية (الشكل 4). وأظهرت النتائج أن التفاعلات COP1-SPA1 (تنعكس بواسطة النشاط لوسيفراس) تدريجيا انخفضت في الظلام، وتخفيض تلك المعاملة جا تفاعلاتها.

الشكل 1 . عملية تسلل بينثاميانا أ . 
(أ) أباكسيال وعرض أداكسيال من النباتات قبل تسلل. (ب) صورة تمثيلية لإظهار بروتوكول تسلل. (ج) أباكسيال وعرض أداكسيال من النباتات بعد تسلل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 2 . نشاط لوسيفراس في إطار اتفاقية مكافحة التصحر-كاميرا التصوير. 
(أ) صورة الممثل من نبات بينثاميانا أ واحد تحت حقل ضوء طبيعي. (ب) كشف التﻷلؤ إشارات تحت اتفاقية مكافحة التصحر-كاميرا لإظهار أنشطة لوسيفراس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3. صورة تمثيلية لإظهار كيفية قياس التﻷلؤ من قص أوراق الأقراص. 
تم قطع الأقراص ليف تسلل ووضعها في لوحة بيضاء 96-جيدا لقياس إشارات التﻷلؤ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 4 . الممثل ناتجة عن تحليل التكامل لوسيفراس عابر واحد. 
(أ) مدة العلاج (الوقت) والنتائج الأصلية لقيمة التﻷلؤ (لوك النشاط) أدرجت. وهناك ثلاثة replicates مستقلة لكل عينة. لإعداد هذا المخطط، كان تطبيع نشاط لوك في نقاط زمنية مختلفة في المعاملة مع مرور الوقت 0 كنشاط لوك النسبي.
(ب) التحديد الكمي النسبي لوك الأنشطة، تظهر التفاعلات COP1-SPA1 في الظلام تدريجيا انخفضت، التي يمكن الحد من مزيد من العلاج جا. شريط خطأ يشير إلى الانحراف المعياري (sd). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.