ويصف هذا البروتوكول طريقة جديدة للتحقيق في شكل من أشكال نيوروستيموليشن الكيميائية من ووليماونت الفئران شبكية العين في المختبر مع غلوتامات العصبي. نيوروستيموليشن الكيميائية يعتبر بديلاً واعداً نيوروستيموليشن الكهربائية التقليدية من الخلايا العصبية الشبكية لعلاج لا رجعة فيه العمى الناجم عن الأمراض التنكسية مستقبله.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
منهجية للمحاكاة البيولوجية الكيميائية نيورومودوليشن من الفئران شبكية العين مع العصبي الغلوتامات في المختبر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
علم الأمراض التنكسية يسبب العمى لا يمكن إصلاحه عن طريق الفقدان التدريجي لخلايا مستقبله في الشبكية. هي الأطراف الاصطناعية الشبكية معاملة ناشئة لعلم الأمراض التنكسية التي تسعى إلى استعادة الرؤية بشكل مصطنع تحفيز الخلايا العصبية الشبكية الباقين على قيد الحياة على أمل الحصول على الإدراك البصري مفهومة في المرضى الذين. الأطراف الاصطناعية الشبكية الحالية أثبتت النجاح في استعادة الرؤية المحدودة للمرضى باستخدام صفيف أقطاب كهربائياً تحفيز الشبكية ولكن تواجه حواجز مادية كبيرة في استعادة عالية الحدة، الرؤية الطبيعي للمرضى. نيوروستيموليشن الكيميائية باستخدام أجهزة الإرسال العصبية الأصلية هو حفز المحاكاة البيولوجية بديلة للكهرباء، ويمكن تجاوز القيود الأساسية المرتبطة بالأطراف الاصطناعية الشبكية باستخدام نيوروستيموليشن الكهربائية. على وجه التحديد، نيوروستيموليشن الكيميائية لديها القدرة على استعادة الرؤية أكثر طبيعية مع أكويتيس البصرية مماثلة أو أفضل للمرضى عن طريق حقن كميات ضئيلة جداً من أجهزة الإرسال العصبية، العوامل الطبيعية نفس الاتصال المستخدمة من قبل الشبكية سينابسيس الكيميائية، في قرار أكثر دقة بكثير من الأطراف الاصطناعية الكهربائية الحالية. ومع ذلك، هناك كنموذج تحفيز غير مستكشفة نسبيا، لا بروتوكول المنشأة لتحقيق التحفيز الكيميائي لشبكية العين في المختبر. والغرض من هذا العمل هو توفير إطار تفصيلي لتحقيق التحفيز الكيميائي الشبكية للمحققين الذين يرغبون في دراسة إمكانات neuromodulation الكيميائية الشبكية أو ما شابه الأنسجة العصبية في المختبر. في هذا العمل، نحن وصف الإعداد التجريبية ومنهجية لاستخلاص العقدة الشبكية الخلية (كمبوديا) سبايك ردود مماثلة للبصرية الخفيفة الردود في البرية من نوع ومستقبله-وتحولت ووليمونت الفئران شبكية العين عن طريق حقن تسيطر وحدات التخزين من غلوتامات العصبي في الفضاء سوبريتينال استخدام الزجاج ميكروبيبيتيس وجهاز مخصص موائع جزيئية متعددة المنافذ. هذه المنهجية والبروتوكول عامة كافية تكييفها ل neuromodulation باستخدام أجهزة الإرسال العصبية الأخرى أو حتى غيرها من الأنسجة العصبية.
المقدمة
علم الأمراض التنكسية، مثل التهاب الشبكية الصباغي، والمتعلقة بالعمر البقعي، هي أهم أسباب فقدان البصر القابلة للتوريث و غير قابل للشفاء حاليا1،2. على الرغم من أن هذه الأمراض تنشأ من مجموعة متنوعة من طفرات وراثية محددة، تتميز الأمراض التنكسية مستقبله كمجموعة بالفقدان التدريجي لخلايا مستقبله في الشبكية، مما يسبب العمى في نهاية المطاف. فقدان photoreceptors المشغلات على نطاق واسع يعيد البناء في جميع أنحاء الشبكية ولكن الباقين على قيد الحياة الخلايا العصبية الشبكية، بما في ذلك الخلايا ثنائية القطب ورجكس، تظل سليمة ووظيفية نسبيا حتى في مراحل متقدمة من مستقبله تنكس3 ،،من
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية الواردة بدليل "مجلس البحوث الوطني" لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. بروتوكولات المناولة والقتل الرحيم الحيوان تم استعراضها والموافقة عليها "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة إلينوي في شيكاغو.
1. نماذج حيوانية
- الجرذان البرية من نوع طويلة-إيفانز
- شراء فأر يوم 24-32 قديمة "طويلة إيفانز مقنعين" البرية من نوع الجنس أما التي أثيرت مع إيقاع ليلة يوم/ح 12 قياسية.
- تكييف الظلام الفئران بوضعه في غرفة مظلمة تماما ح 1 قبل بداية التجربة.
- الفئران S334ter-3
- عبور ألبينو المعدل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن استخدام هذا البروتوكول لحفز كيميائيا شبكية العين العادية، والبرية من نوع فضلا عن مستقبله شبكية العين، على الرغم من كبير الخلوية يعيد البناء الناجمة عن فقدان photoreceptors تدهورت. قبل أن تبدأ التجارب مع أما مستقبله تدهورت أو البرية من نوع شبكية العين، وضرورة تسجيل وتنشيط المعدات (الشكل 1 و الشكل 2) فتا وبما (الشكل 5) يجب تنظيف للتقليل إلى أدنى حد الضجيج في كل قناة قطب كهربائي (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة المعروضة هنا يوضح نموذج تحفيز العصبية فريدة من نوعها، حيث يتم تحفيز الخلايا العصبية الشبكية كيميائيا عن طريق حقن المواد الكيميائية العصبي الأصلية في الطبقة تحت السطحية لشبكية العين في المختبر. يوفر هذا الأسلوب التحفيز الكيميائي العديد من الفوائد عبر تقنية التحفيز الكهربائي التقليدية، بما في ذلك الانتقائية وخصوصية تركيز عالية من الخلايا العصبية المستهدفة. البروتوكول أعلاه تفاصيل صغيرة كيف حقن حجم هوائي من غلوتامات العصبي تسليمها القرب من الخلايا العصبية الشبكية المستهدفة باستخدام أما ميكروبيبيتي زجاج أحاد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيده المعروضة في الورقة العمل "المؤسسة الوطنية للعلوم"، الحدود الناشئة في مجال البحوث والابتكار (NSF-أفري) برنامج منح رقم 0938072. محتويات هذه الورقة هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية لجبهة الخلاص الوطني. الكتاب أيضا نود أن نشكر الدكتور سامسون حلمي لعمله في تصميم واختبار الإعداد التجريبية الأولى للتحفيز الكيميائي والسيد اشوين راغوناثان لعمله تصميم واختلاق، وتقييم الجهاز موائع جزيئية متعددة المنافذ المستخدمة في هذه الدراسة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة ، أنظمة متعددة القنوات ذات التخطيط المثقب | ، GmbH | 60pMEA200 / 30iR-Ti-pr | http://www.multichannelsystems.com/products/microelectrode-arrays/60pmea20030ir-ti |
| MEA مضخم | للصوت أنظمة متعددة القنوات ، GmbH | MEA1060-Inv | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv |
| التروية السفلية لأنظمة pMEA | متعددة القنوات ، GmbH | MEA1060-Inv- (BC) -PGP | http://www.multichannelsystems.com/products/mea1060-inv-bc-pgp |
| 3 محاور Micromanipulator Micromanipulator | Sutter Instruments ، Novاتو ، CA | MP-285 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mp285.html |
| Micromanipulator System | Control Instruments ، Novاتو ، CA | MPC-200 | https://www.sutter.com/MICROMANIPULATION/mpc200.html |
| Gantry Style حامل مناور دقيق مع شريحة خطية | Sutter Instruments ، Novاتو ، CA | MT-75 / LS | https://www.sutter.com/STAGES/mt75.html |
| حاقن الضغط متعدد القنوات القابل للبرمجة ذو 8 قنوات | OEM: أداة MicroData ، S. Plainfield ، NJ البائع: Harvard Apparatus UK | PM-8000 أو PM-8 | OEM: http://www.microdatamdi.com/pm8000.htm البائع: https://www.harvardapparatus.co.uk/webapp/wcs/stores/servlet/product_11555_10001_39808_-1 _HAUK_ProductDetail |
| Axopatch 200A دمج الأجهزة الجزيئية لمضخم التصحيح المشبك | ، Sunnyvale ، CA | تم استبدال Axopatch 200A Axopatch 200A بطراز أحدث Axopatch 200B: https://www.moleculardevices.com/systems/axon-conventional-patch-clamp/axopatch-200b-amplifier | |
| مشبك التصحيح | الأجهزة الجزيئية headstage ، Sunnyvale ، CA | CV 201A | http://mdc.custhelp.com/app/answers/detail/a_id/16554/~/axopatch-200a%3A-selection-cv-headstage |
| مجموعة نفايات الفراغ | ALA Scientific Instruments ، Farmingdale ، NY | VMK | http://alascience.com/product/vacuum-waste-kit/ |
| حامل الماصة | Warner Instruments ، Hamden ، CT | QSW-A10P | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=915 |
| مسحوب مسبقا 10 مو ؛ ماصات زجاجية دقيقة بقطر طرف | m أدوات الدقة العالمية ، ساراسوتا ، فلوريدا | TIP10TW1 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/make-selection-pre-pulled-glass-pipettes-plain/ |
| تكبير مجهر مجهر | نيكون ، طوكيو ، اليابان | SMZ-745T | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ745 |
| حامل ذراع المجهر مع كرة خطية مزدوجة ذراع تحمل | Old School Industries، Inc. ، Dacono ، CO | OS1010H-16BB | http://www.osi-incorp.com/productdisplay/dual-linear-ball-bearing-arm |
| Zoom Stereoscope مع C-LEDS Hybrid LED Stand | Nikon ، طوكيو ، اليابان | SMZ-445 | https://www.nikoninstruments.com/Products/Stereomicroscopes-and-Macroscopes/Stereomicroscopes/SMZ445 |
| نظام المجهر المقلوب | نيكون ، طوكيو ، اليابان | Eclipse Ti-E | https://www.nikoninstruments.com/Products/Inverted-Microscopes/Eclipse-Ti-E |
| أميس متوسط | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | A1420 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a1420 |
| حمض L-Glutamic (غلوتامات) | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، MO | G5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/mm/100291 |
| بيكربونات الصوديوم | سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري | S8761 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s8761 |
| طبق بتري 60 مم (طول 10 مم) | طبق بتري شفاف FB0875713A Fischer Scientific ، Waltham ، MA | ؛ https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875713a | |
| Jewelers # 5 Plumps | World Precision Instruments ، ساراسوتا ، فلوريدا | 555227F | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/555227f-jewelers-5-forceps-11cm-straight-titanium/ |
| شفرة مشرط قياسية # 24 | World Precision Instruments ، ساراسوتا ، فلوريدا | 500247 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500247-standard-scalpel-blade-24/ |
| مقبض مشرط # 4 | World Precision Instruments ، ساراسوتا ، فلوريدا | 500237 | https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/500237-scalpel-handle-4-14cm/ |
| Vannas Tubingen Dissection Scissors | World Precision Instruments ، ساراسوتا ، فلوريدا | 503378 https://www.wpiinc.com/products/laboratory-supplies/503378-vannas-tubingen-scissors-8cm-straight-german-steel/ | |
| مجموعة شبكة النايلون | Warner Instruments ، Hamden ، CT | NYL / MESH | https://www.warneronline.com/product_info.cfm?id=1173 |
| شبكة شرائح القيثارة | ALA Scientific Instruments ، Farmingdale ، NY | HSG-5AD | http://alascience.com/product/standard-harp-slice-grids/ |
| Ag / AgCl أنظمة بيليه القطب المرجعي | متعددة القنوات ، GmbH | P1060 | http://www.multichannelsystems.com/products/p1060 |
| 4 قنوات صمام يتم التحكم فيه نظام تروية الجاذبية | ALA الأدوات العلمية ، فارمينغديل ، نيويورك | VC3-4xG | http://alascience.com/product/4-channel-valve-controlled-gravity-perfusion-system/ |
| Zyla 5.5 sCMOS كاميرا مجهر | Andor Technology ، بلفاست ، المملكة المتحدة | Zyla 5.5 sCMOS | http://www.andor.com/scientific-cameras/neo-and-zyla-scmos-cameras/zyla-55-scmos |
| سلك فضي (50 & mu ؛ قطر م) | Fischer Scientific ، Waltham ، MA | AA44461G5 | https://www.fishersci.com/shop/products/silver-wire-0-05mm-0-002-in-dia-annealed-99-99-metals-basis-3/aa44461g5 |
| Tygon microbore tubing (قطر 1.6 مم) | Cole Parmer ، Vernon Hills ، IL | EW-06419-01 | https://www.coleparmer.com/i/tygon-microbore-tubing-0-020-x-0-060-od-100-ft-roll/0641901 |
| حامل أداة إمالة مع قنية | فولاذيةALA Scientific Instruments ، Farmingdale ، NY | TILTPORT | تم استخدام كل منها في التروية والشفط العلوي ؛ http://alascience.com/product/tilting-tool-holder-with-steel-cannula/ |
| Roscolux # 26 ورقة تصفية حمراء فاتحة | Rosco Laboratories Inc. ، 52 Harbour View ، Stamford ، CT | R2611 | الشركة المصنعة: http://us.rosco.com/en/products/catalog/roscolux البائع: https://www.bhphotovideo.com/c/product/43957-REG/Rosco_RS2611_26_Filter_Light.html |
| سميث & أمبير ويسون غالاكسي مصباح يدوي أحمر | سميث & ويسون ، 2100 شارع روزفلت ، سبرينغفيلد ، ماساتشوستس | 4588 | الشركة المصنعة: https://www.smith-wesson.com/ البائع: http://www.mypilotstore.com/mypilotstore/sep/4588 |
| MC_Rack Software | Multi Channel Systems ، GmbH | MC_Rack http://www.multichannelsystems.com/software/mc-rack | |
| Labview Software | National Instruments ، أوستن ، تكساس | Labview | http://www.ni.com/labview/ |
| NIS-Elements: Basic Research | Nikon ، طوكيو ، اليابان | NIS-Elements BR | https://www.nikoninstruments.com/Products/Software/NIS-Elements-Basic-Research |
المراجع
- Pascolini, D., Mariotti, S. P. Global estimates of visual impairment: 2010. Br J Ophthalmol. , (2011).
- Fritsche, L. G., Fariss, R. N., Stambolian, D., Abecasis, G. R., Curcio, C. A., Swaroop, A. Age-Related Macular Degeneration: Genetics and Biology Coming Together. Annu Rev Genomics Hum Ge....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
