يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

حقن إينتراميوكارديال توجيه ضربات القلب التباين عن طريق الجلد وتسليم خلية في نموذج الإكلينيكية كبير

11K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56699

⸱

يناير 21, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Cardiovascular and Metabolic Research, School of Biological Sciences, University of Reading, 2Departamento de Medicina y Cirugía Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 3Institute of Virology and Immunology (IVI), 4Departamento de Anatomía y Anatomía Comparada, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia, 5Unidad de Trasplante Hematopoyético y Terapia Celular, Departamento de Hematología, Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca, IMIB, Universidad de Murcia

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

رواية الاستراتيجيات العلاجية في الطب التجديدي القلب تتطلب دراسات شاملة ومفصلة في نماذج حيوانية السريرية كبيرة قبل أن يمكن النظر لاستخدامها في البشر. هنا، نبدي تقنية حقن إينتراميوكارديال توجيه ضربات القلب تباين عن طريق الجلد في الأرانب، الذي قيمة بالنسبة لفرضية اختبار فعالية هذه العلاجات الجديدة.

الملخص

الخلية والعلاج الجيني مثيرة والاستراتيجيات الواعدة غرض التجديد القلب في الإعداد لفشل القلب مع انخفاض كسر قذفي (هفريف). قبل أن يمكن النظر في استخدام، ونفذت في البشر، مطلوبة في نماذج حيوانية كبيرة الدراسات السريرية واسعة النطاق لتقييم سلامة وفعالية، ومصير إينجيكتاتي (مثلاً، الخلايا الجذعية) مرة واحدة سلمت في عضلة القلب. نماذج القوارض الصغيرة توفر مزايا (مثلاً، الفعالية، الانقياد للتحوير الوراثي من حيث التكلفة)؛ ومع ذلك، نظراً للقيود الملازمة لهذه النماذج، ترجمة النتائج التي توصلت إليها في هذه نادراً ما إلى العيادة. على العكس من ذلك، نماذج حيوانية كبيرة مثل الأرانب، بمزايا (مثلاً، الكهربية القلبية مماثلة بالمقارنة مع البشر والحيوانات الكبيرة الأخرى)، مع الاحتفاظ بتوازن جيد فعالة من حيث التكلفة. وهنا، نحن توضح كيفية تنفيذ تقنية حقن (IMI) توجيه ضربات القلب إينتراميوكارديال تباين عن طريق الجلد، التي يتم كسبها، وجيد التحمل وآمنة وفعالة جداً في التنفيذ الهادف إينجيكتاتيس، بما في ذلك الخلايا، في مواقع عدة داخل عضلة القلب نموذج أرنب. لتنفيذ هذه التقنية، ونحن أيضا استفادت من نظام تخطيط صدى القلب السريرية متاحة على نطاق واسع. بعد وضع في الممارسة البروتوكول الموصوفة هنا، سوف تصبح باحث بالمعرفة الأساسية بالموجات فوق الصوتية المختصة في أداء هذا الأسلوب تنوعاً وكسبها للاستخدام الروتيني في التجارب، وتهدف إلى اختبار الفرضية قدرات للمداواة التجدد القلب في نموذج أرنب. متى تحقق الكفاءة، يمكن تنفيذ الإجراء بأكمله خلال 25 دقيقة بعد أنايسثيتيزينج الأرنب.

المقدمة

العلاجات الخلية والجينات هي مثيرة ووضع استراتيجيات لتجديد/إصلاح عضلة القلب المصابين في هفريف من أي وقت مضى. وقد عدد قليل من الدراسات مقارنة الفعالية (مثلاً، معدل احتفاظ الخلية) طرق مختلفة لإيصال الخلية، التي أظهرت استمرار تفوق IMI عبر طرق إينتراكوروناري أو عن طريق الحقن الوريدي1،2 , 3 , 4 , 5-وهكذا، ليس من المستغرب أن نسبة كبيرة من الدراسات على نماذج متعدية للعلاج بالخلايا الجذعية لعضلة القلب المتضررة، تسليم إينجيكتاتي عبر IMI المضطلع بها في إطار العرض مباشرة في صدر فتح إجراء6،7 . بيد أن هذا النهج قد العديد من القيود، بما في ذلك طبيعة الغازية من الإجراء، الذي ينطوي على خطر وفيات الإجرائية المحيطة (غالباً ما يبلغ)8. وبالإضافة إلى ذلك، IMI ضمن طريقة العرض المباشر لا يلغي إمكانية حقن غير مقصود في تجويف البطين. في الممارسة السريرية IMI أثناء جراحة الصدر المفتوحة يمكن أن يكون وسيلة مناسبة لإيصال خلية العلاجية، مثلاً، خلال الشريان التاجي الالتفافية جراحة الاختلاس (تحويل)؛ ومع ذلك، هذا النهج قد لا يكون المناسبة لإيصال خلية في اعتلال عضلة القلب العالمية غير الدماغية المنشأ (مثلاً، هفريف الثانوي لاعتلال عضلة القلب الناجم عن انثراسيكلين (أيكم)).

شك في أن مرض القلب الاقفاري (IHD) هو السبب الأكثر شيوعاً هفريف (~ 66%)10من9،؛ ومع ذلك، غير الدماغية اعتلال عضلة القلب، بما في ذلك أيكم، ما زال يؤثر على نسبة كبيرة من المرضى الذين يعانون من هفريف (33%)9 . والواقع أن التقدم الذي أحرز مؤخرا في علم الأورام السريري أسفرت عن أكثر من 10 مليون من الناجين من السرطان في الولايات المتحدة الأمريكية وحدها11، مع تقديرات لعدد مماثل في أوروبا، وتمشيا مع اتجاه العام نحو تحسين البقاء على قيد الحياة لمرضى السرطان12 ،13. وهكذا، استكشاف فوائد العلاجات رواية مثل زرع الخلايا الجذعية لغير الدماغية اعتلال عضلة القلب، فضلا عن تجريب طريق فعالة وكسبها من الخلايا الجذعية التسليم بأهمية قصوى، نظراً للعدد المتزايد من المرضى تتأثر كارديوتوكسيسيتي الثانوي على أدوية السرطان.

من المذكرة، فرضية اختبار دراسات استخدام الخلايا الجذعية العلاج تهدف إلى إصلاح/تجديد عضلة القلب المتضررة كثيرا ما تنطوي على استخدام القوارض الصغيرة (مثلالفئران والجرذان). غالباً ما تتطلب هذه النماذج تكلفة عالية التردد نظم الموجات فوق الصوتية لتقييم وظيفة عضلة القلب، وعادة ما تكون مجهزة بمحولات المصفوفة الخطية التي لديها بعض القيود المتأصلة المرتبطة بها (مثلاً، صدى)14. ومع ذلك، قد نماذج أخرى مثل الأرانب، تمثل نموذجا الإكلينيكية كبيرة، بعض المزايا لاختبار الفرضية لعلاجات الخلايا الجذعية في هفريف. وهكذا، خلافا للفئران والجرذان، الأرانب الحفاظ على نظام النقل+ 2 Ca والكهربية الخلوية التي يشبه البشر وسائر الحيوانات الكبيرة (مثلالكلاب والخنازير)15،16،17 ،،من1819. وهناك ميزة أخرى، هي على الانقياد للقلب بالموجات فوق الصوتية التصوير باستخدام غير مكلفة نسبيا ونظم ضربات القلب السريرية متاحة على نطاق واسع مجهزة بمحولات الصفيف المرحلة ذات تردد عال نسبيا، مثلاً، 12 ميجاهرتز، مثل تلك التي كثيرا ما تستخدم في أمراض القلب في الأطفال حديثي الولادة وطب الأطفال. تسمح هذه النظم التصوير مشخصين ممتازة مع أحدث التكنولوجيا، وأنها تستفيد من تفوق التوافقي التصوير20. وعلاوة على ذلك، اختبار الفرضيات واسعة إمكانات العلاج التجديدي القلب (مثل، العلاج بالخلايا الجذعية)، السلامة، كفاءة، إمكانات كارديوميوجينيك، كذلك تقييم مصير إينجيكتاتي مرة واحدة سلمت إلى عضلة القلب، إلزامية قبل أن يمكن اعتبار للاستخدام البشري، وأنها تتطلب استخدام نماذج حيوانية الإكلينيكية الكبيرة، مثل،من17أرنب19. هنا، يمكننا وصف أسلوب كسبها لإيصال خلية عن طريق IMI التباين عن طريق الجلد-ضربات القلب تسترشد باستخدام نظام تخطيط صدى القلب سريرية، التي تهدف إلى العلاج القائم على زرع الخلايا الجذعية لاعتلال عضلة القلب غير الدماغية20 . كما يصف لنا فوائد الحبر الهند (InI، تعرف أيضا باسم الصين الحبر) كالموجات فوق الصوتية على النقيض عامل و في الموقع الراسم من إينجيكتاتي في قلب الأرنب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

التجارب الموضحة هنا كانت وافقت عليها "لجنة البحوث الأخلاقية" التابعة لجامعة مورسيا، إسبانيا، وأجريت وفقا للتوجيه 2010/63/الاتحاد الأوروبي من "المفوضية الأوروبية". تم إجراء الخطوات الموضحة ضمن البروتوكولات التشغيل القياسية التي كانت جزءا من خطة العمل، وأدوا ليس فقط لغرض تصوير الفيديو المصاحبة لهذه الورقة.

1-إعداد الخلايا وناقلات التعبير الثدييات

ملاحظة: هنا، نحن بإيجاز وصف بروتوكول لإعداد وتعداء خط الخلية (الجنينية البشرية 293 (HEK-293) الكلي؛) ومع ذلك، ينبغي أن تكون الخلية المناسبة بروتوكولات معينة لنوع الخلية التي تهم الأمثل (مثلالخلايا الجذعية).

  1. الحفاظ على الخلايا HEK-293 في ارتفاع الجلوكوز دولبيكو تعديل المتوسطة النسر (دميم) وتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% (FCS)، بيروفات صوديوم 1%، 2 مم الجلوتامين، 1% البنسلين/ستربتوميسين، والمحتضنة في 37 درجة مئوية في جو هوميديفيد التي تحتوي على 5 في المائة شركة2 . عندما تكون الخلايا الفرعية المتلاقية، تقسيم بنسبة 1:3.
  2. بدء تقسيم الخلايا من يسفط وسائل الإعلام، ثم يغسل مرة واحدة مع الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS) وإزالة برنامج تلفزيوني الزائدة واحتضان ثم مع 2.5 مل 0.5 × حمض التربسين-الإيثيلين (يدتا) (دقيقة 5، 37 درجة مئوية).
    1. إضافة وحدة تخزين واحدة من وسائل الإعلام دميم (تستكمل كما هو موضح أعلاه) وقف رد الفعل ومن ثم فصل الخلايا من يسفط ببطء لطف صعودا وهبوطاً مع ماصة إلكترونية.
  3. ثم قم بنقل تعليق خلية إلى حاوية مناسبة (مثلاً، 15-50 مل الأنبوبة المخروطية أجهزة الطرد المركزي). الطرد المركزي في دلو سوينغ (100 x ز) وتجاهل المادة طافية وتغسل بيليه مرتين مع PBS العقيمة.
  4. ريسوسبيند بيليه في وسائط الإعلام دميم الطازجة والبذور كثافة خلية ملائمة (مثلاً، 1 × 106 خلايا في قارورة2 75 سم) في قوارير الثقافة الطازجة أو صحون كبيرة وفقا للممارسات المختبرية المحلية.
    1. استبدال وسائط الإعلام القائمة مع وسائط جديدة كل يومين.
      ملاحظة: ناقل التعبير مستمدة من pIRES1hyg واستخدامها طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة كما هو موضح سابقا21. p(EGFP) IRES1hyg تم إنشاؤها بواسطة سوبكلونينغ كدنا اجفب كما بامهي + نوتي إدراج من بيجفب-N1 إلى بامهي + نوتي هضمها pIRES1hyg21.
  5. قبل تعداء، يوم 1 البذور HEK-293 الخلايا في كثافة 0.5 × 105 خلايا/سم2 في لوحات زراعة الأنسجة أيضا 12 أو 24.
  6. في يوم تعداء، إعداد مجمعات كاشف تعداء الحمض الدهني في أنابيب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 منفصلة (1 أنبوب في البئر).
    1. ابدأ بإضافة 250 ميليلتر من المصل انخفاض متوسط في كل أنبوب، ثم قم بإضافة 4 ميكروغرام الحمض النووي (المزيج بلطف).
    2. بعد ذلك إضافة 250 ميليلتر من مزيج معدّة مسبقاً من 10 ميليلتر دهن تعداء كاشف و 250 ميليلتر من المصل انخفاض المتوسط، لكل أنبوبة (المزيج بلطف مرة أخرى).
    3. وأخيراً، المضي قدما في ترانسفيكتيونس، التي تفرخ الخلايا HEK-293 مع الحمض الدهني تعداء كاشف المجمعات ح 4، وثم استبدال المتوسطة دميم تستكمل كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1، 1)، واحتضانها ل h. 48 آخر إجراء التحديد المخدرات مستقرة ترانسفيكتانتس مع 100 ميكروغرام/مل هيجروميسين باء
  7. فصل الخلايا HEK-293 مع التربسين كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1، 2). بعد الغسيل الخلايا في برنامج تلفزيوني العقيمة، ريسوسبيند في وسيلة مناسبة (مثلاً، 10% v/v InI في برنامج تلفزيوني)، لتحقيق تركيز خلية الأخيرة من 5 × 106/mL.

2-إعداد الأرنب

ملاحظة: وضع الأرنب ومحول ل IMI ليس الأمثل لتقييم وظيفة القلب للحيوان ومورفولوجيا. وبالتالي، فمن المستحسن لإجراء فحص كامل مشخصين20 قبل IMI (انظر أدناه)، وفي وقت لاحق النقاط حسب تعريف التصميم التجريبي. وسيهدف هذا لتقييم خصائص خط الأساس التشريحية والوظيفية للقلب في الحيوان الذي سوف تلقي حقنه، وأيضا بتقييم الآثار، IMI في وظيفة القلب.

  1. إجراء هذا الفحص على نحو أعمى واتباع المبادئ التوجيهية "اللجنة تخطيط صدى القلب" للكلية الأمريكية للطب الباطني البيطري، والرابطة الأمريكية للمجتمع الأوروبي تخطيط صدى القلب "تصوير القلب والأوعية الدموية" 22 , 23 , 24.
  2. الحصول على تتبع متزامنة 1-يؤدي رسم قلب (ECG) طوال فترة الدراسة كاملة مشخصين.
  3. تخدير الأرنب مع الكيتامين 10 مغ/كغ، جنبا إلى جنب مع ميديتوميديني 200 ميكروغرام/كغ، العضلي (الدردشة) الحقن.
  4. التحقق من مستوى التخدير بعد 10-20 دقيقة بعد الإدارة للتخدير.
  5. استخدام ماكينة قص شعر إزالة شعر صدره على نطاق واسع (مثل، أسفل الرقبة للمنطقة الفرعية إكسيفويد) (الشكل 1A).
  6. حلق مناطق إضافية من 1-2 سم2 في الوجه الداخلي حق فوريليمب (منطقة ميديوكوبيتال)، وكل أطرافه هند (منطقة ميديوتيبيال) (الشكل 1B).
  7. ضع لاصق ECG أقطاب في منطقتي حلق من أطرافه بشكل متزامن رصد ضربات القلب أثناء الإجراء (الشكل 1).
  8. ضع الحيوان في موقف ضعيف استلقاء على بطانية حرارية، مع أطرافه الممدودة باستخدام الشريط الجراحي المرفقة بالجدول (الشكل 1).
    1. تأكد من أن يتم استعرضوا أذنيه إلى الوراء خلف الرأس/ظهره الأرنب، وهو موقف الذي أقل من أن الأمامية، حيث يساعد ذلك على الحفاظ على الموضع الصحيح من القفص الصدري للحيوان طوال فترة الإجراءات.
  9. السماح للحيوان للتنفس تلقائياً حين تدير الأكسجين بقناع الوجه طوال الإجراء بأكمله (100 ٪، 2-3 لتر في الدقيقة).

figure-protocol-1
رقم 1. إعداد الأرنب IMI. (أ) قص الشعر من الصدر؛ (ب) قص الشعر من أطرافه؛ (ج) إرفاق أقطاب وموقف الأرنب مع الساقين الممدودة على بطانية حرارية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3-عن طريق الجلد على النقيض IMI توجيه ضربات القلب تقنية في الأرنب

  1. تنظيف وتطهير الجلد من القفص الصدري مع حل القائم على الكلورهيكسيدين.
    1. استخدم أسلوب العقيم طوال الإجراء بأكمله، وفقا لأفضل الممارسات الراهنة.
    2. كلما كان ذلك ممكناً، وإذا كان ذلك ممكناً بشكل معقول، تنفيذ إجراء عقيمة تماما، بما في ذلك على سبيل المثال لا الحصر، استخدام المواد المعقمة مثل العباءات، والقفازات، والستائر الجرح الجراحي، عقيمة خلع الملابس المادية للجدول، فضلا عن عقيمة بالموجات فوق الصوتية غطاء محول الطاقة وجل العقيمة بالموجات فوق الصوتية. وهذا سوف يقلل إلى أدنى حد خطر إدخال العوامل الممرضة للحيوان تلقي IMI، والممارسة المتبعة في الإعداد السريرية (مثلاً، أثناء ثقب القلب).
      ملاحظة: من المستحسن المضي دائماً وفقا للوائح المحلية والوطنية لبحوث الحيوان المطبقة على المؤسسات المحلية والقطرية من الممارسة.
  2. تطبيق هلام انتقال الموجات فوق الصوتية في الصدر و/أو إلى محول، ومع محول طاقة الحبل حول رقبة المجرب، إجراء فحص سريع نافذة من القلب للحيوان، والتي غالباً ما تكون مفيدة لتصور التشريح، وأن تخطط IMI.
  3. ضع محول يدوياً في 4th-6th ربية الفضاء، 2-3 سم بعيداً عن خط باراستيرنال الحق مع حالات من زاوية ~ 90 ° فيما يتعلق بالجانب الأيمن من الجدار الصدري (الشكل 2A).
  4. ضبط موقع محول بالنسبة إلى مساحة ربية، فضلا عن الصورة وزاوية دورسوفينترال لتحسين طريقة عرض محور قصيرة تم تعديل على مستوى العضلات الحليمية. تحدد في هذا الرأي البطين الأيمن (RV) والبطين الأيسر (LV)، وحاجز إينتيرفينتريكولار (الحبس)، والجدار الخلفي (الأسبق)، فضلا عن أنتيرولاتيرال (AL) والعضلات الحليمية بوستيروميديال (م) (الشكل 2).
    1. لها مجال رؤية واسع بزيادة عمق باستخدام عنصر التحكم المناسب في النظام (مثلاً، زر، والاتصال الهاتفي).
    2. إيلاء اهتمام خاص للحصول على صورة متناظرة في هذا الرأي، فضلا عن التمايز المناسبة من معالم للوفلر وابيكارديال، وتعديل إذا لزم الأمر، من خلال الصورة الأمثل عناصر التحكم (مثلاً، الربح).
  5. حالما يتم الحصول على رأي مشخصين الأمثل (الشكل 2)، الحفاظ على هذا الموقف خلال الفترة المتبقية من هذا الإجراء، في حين يقوم عامل ثان IMI (انظر أدناه).
    1. في حين عقد محول، تجنب إخفاء علامة الاتجاه محول الطاقة، التي ينبغي دائماً أن تواجه إلى الأمام، مما يسمح المحاذاة مع الإبرة في الخطوات اللاحقة (الشكل 2 أ، ج).
  6. مع إبرة 24-ز يعلق على حقنه 1 مل، مكان الإبرة قريبة من جلد هيميثوراكس اليسرى في موقف متماثل النسخ المتطابق من محول. ثم، يدوياً محاذاة الإبرة مع علامة الاتجاه محول طاقة بزاوية ~ 90° (الشكل 2)، والنهوض ببطء بالإبرة من خلال الجلد وداخل تجويف الصدر.
    ملاحظة: إدخال إبرة عن طريق الجلد في هذا الموقف والتوجه يسهل تصور الإبرة في طائرة شعاع الموجات فوق الصوتية (الشكل 2D، هاء)، مما يسمح للرصد في الوقت الحقيقي، وعند الضرورة، تعديل موقع الإبرة بالنسبة للمنطقة المستهدفة لعضلة القلب (الشكل 2 ز، ح).
  7. مع معلومات سرية في الموقع الهدف، تقديم ببطء في إينجيكتاتي (تصل إلى 0.25 مل في موقع الحقن) خلال 10-30 ثانية (الشكل 2E)، حين تراجعه ببطء لطف الإبرة أثناء الحقن زيادة حجم عضلة القلب معاملة.
    1. InI استخدام 10% (v/v) المخفف في برنامج تلفزيوني لتوحيد أسلوب، تتبع في الموقع حين اكتساب الكفاءة، فضلا عن تأكيد نجاح استهداف جميع المواقع IMI أربعة داخل عضلة القلب بإجمالي علم الأمراض والتشريح المرضى (انظر نتائج الممثل). متى تحقق الكفاءة، يمكن أن يتم استبدال InI إذا رغبت بعامل تباين الموجات فوق الصوتية تجارية مناسبة.
      ملاحظة: تسليم 10% (v/v) InI المخفف في برنامج تلفزيوني أما مع أو بدون الخلايا في عضلة القلب النتائج في هايبريتشوجينيسيتي ترانسمورال (أي، صدى مظهر مشرق) في موقع الهدف من الحقن (الشكل 2 هاء، واو). كثيرا ما لوحظ تباطؤ عابرة أو تسارع معدل ضربات القلب، المرتبطة بانكماش بطيني سابق لأوانه (مثلاً، معزولة، وشعرية وثلاثة توائم) حتى من أول اتصال من الإبرة مع ابيكارديوم، وكذلك أثناء و/أو بعد وقت قصير من IMI. ومع ذلك، توضع لا عدم انتظام ضربات القلب تهدد حياتهم، والتأثيرات السلبية الحادة التي نادراً ما يلاحظ استخدام يصل إلى 0.25 مل (1.25 × 106 خلايا) من إينجيكتاتي لكل موقع الحقن IMI (انظر نتائج الممثل و المناقشة).
  8. إجراء بعض التغييرات الطفيفة في الإصابة الإبرة من زاوية حسب الضرورة لإتمام حقن 0.25 مل لكل موقع من مواقع IMI الأربع المستهدفة (ثلاثة في اليسار بطيني مجاناً الجدار (لففو) وواحدة في مركز الحبس الاحتياطي).
  9. بعد إكمال الإجراء IMI توجيه ضربات القلب التباين عن طريق الجلد، تقييم ضربات القلب (مثلاً، عن طريق تخطيط القلب المسلسل التتبع و/أو ح 24 ECG هولتر)، وإجراء مسح إطار تسلسلي مشخصين للتحقق من عدم وجود المضاعفات، حتى الحيوان هو تعافي تماما من التخدير، وفقط ثم نقل إلى غرفة في دائرة ضوء.
    1. هنا، نحن نستخدم ح 24 هولتر تخطيط القلب لرصد آثار IMI مع InI على إيقاع القلب ح 24. لهذا، نحن مقارنة مجموعة من الأرانب 6 مع النمط العادي الظاهري (فريق عادي) ومجموعة من الأرانب 6 التي تلقت الإدارة عن طريق الحقن الوريدي من ميتوتريكسات (كارديوتوكسيك انثراسيكلين المخدرات، تستخدم عادة لعلاج السرطان؛ مجموعة دوكس) بجرعة 2 مغ/كغ/الأسبوع لمدة 8 أسابيع، وثم كلا الأفواج تلقي IMI مع InI.

figure-protocol-2
الشكل 2 . حقن إينتراميوكارديال توجيه ضربات القلب التباين عن طريق الجلد في الأرنب. (A) وضع محول في هيميثوراكس الحق بزاوية ~ 90 °. (ب) صورة تمثيلية لطريقة عرض المحور قصيرة parasternal (بسكس) من القلب على مستوى العضلات الحليمية في الأرنب. (ج) محاذاة الإبرة بزاوية ~ 90 ° بالنسبة إلى علامة الاتجاه محول طاقة. (د) موقع الإبرة في الموقع المستهدف في طريقة عرض بسكس القلب (لاحظ أن الإبرة هو تصور بسهولة في طائرة شعاع الموجات فوق الصوتية). (E و F) دليلاً هايبريتشوجينيسيتي في موقع الهدف عند حقن إينتراميوكارديال مع الحبر الهند (رؤوس الأسهم تسليط الضوء على هايبريتشوجينيسيتي ترانسمورال). (ز) موقع عرضي من الإبرة في قاعة LV (رؤوس الأسهم تسليط الضوء على رمح إبرة). Repositioning (ح) من الإبرة للجدار الحر LV (رؤوس الأسهم تسليط الضوء على رمح إبرة). رف = البطين الأيمن؛ LV = البطين الأيسر؛ الحبس = حاجز إينتيرفينتريكولار؛ PW = الجدار الخلفي؛ نادي = العضلات الحليمية أنتيرولاتيرال؛ م = بوستيروميديال العضلات الحليمية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4-نشر تحليلات IMI

  1. القيام بتحليل نسيجية لعينات أنسجة القلب من الأرانب.
    1. إصلاح الأنسجة ح 24 في فورمالدهايد 10%، تليها الجفاف مع زيادة تركيزات الإيثانول على النحو التالي:
      • 1 x في 70% (60 دقيقة)
      • 1 x في 95% ethanol/5% الميثانول (60 دقيقة)
      • 1 x 100 في المائة (60 دقيقة)
      • 1 x 100 في المائة (90 دقيقة)
      • 1 x 100 في المائة (120 دقيقة)
      ملاحظة: جميع إينكوبيشنز أعلاه تجري في درجة حرارة الغرفة (RT). ثم، استبدال مرتين مع 100 ٪ زيلين نفط (1 ح، RT)، وأخيراً تضمين في البارافين في خطوتين (60 دقيقة، 58 درجة مئوية)25.
    2. تنفيذ 4-5 ميكرومتر الأنسجة الأقسام مع مبضع25. تحميل المقاطع على الشرائح.
    3. القيام بتلوين الهيماتوكسيلين ويوزين وماسون لأساليب تريتشرومي25،،من2627.
  2. أقسام الأنسجة من زرع القلوب، تنفيذ إيمونوهيستوتشيميستري للكشف عن الخلايا EGFP(+) HEK-293 (مثلاً، استخدام الأسلوب (ABC) معقدة عبدين-البيوتين)، بإيجاز:
    1. إزالة الشمع 4-5 ميكرومتر سميكة قلب المقاطع في 100 ٪ زيلين نفط (10 دقيقة، في RT). ترطيب الأنسجة بالغسيل مع تناقص حلول تركيز الإيثانول (x 2 في 100% (2 دقيقة)؛ x 2 في 95% (2 دقيقة)؛ س 1 في % 70 (2 دقيقة)؛ س 1 في 50% (2 دقيقة)؛ و x 1 في 30% (2 دقيقة)؛ 1 x ddH2س (2 دقيقة)) في الرايت
    2. أداء تثبيط البيروكسيديز الذاتية التي تغطي الأقسام مع 100 ميليلتر من 3 ٪ ح2س2 مخفف في (الميثانول (أعدت مع 5 مل حل الأسهم 30 ٪ ح2س2، وإضافة الميثانول تصل إلى إجمالي حجم 50 مل) احتضان 30 دقيقة، RT)، وثم يغسل بالغمر بالمياه المالحة تريس مخزنة (TBS؛ ودرجة الحموضة 7.6).
    3. أداء مستضد فضحه عن طريق العلاج الأنزيمي، التي تغطي الأقسام مع 100 ميليلتر من 0.1% برنس (أعدت مع ز 0.01 برنس المخفف في 10 مل TBS) (احتضان 12 دقيقة، RT)، ثم يغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
    4. احتضان في الحل (مصل الماعز العادي بمعدل 10% في تبس) حظر استخدام 100 ميليلتر كل شريحة (30 دقيقة, RT)، وتغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
    5. احتضان مع الدجاج الأخضر المضادة البروتين الفلورسنت (التجارة والنقل) كجسم الأولية (1: 500 في تبس) (ح 1، 30 درجة مئوية)، وتغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
    6. احتضان مع جسم الثانوية بيوتينيلاتيد الماعز-مكافحة-الدجاج مفتش (1: 250 في تبس) (ح 1، 30 درجة مئوية)، وثم يغسل مع TBS (5 دقائق، RT).
    7. احتضان مع مجمع عبدين-البيوتين (20 دقيقة، 30 درجة مئوية) ومن ثم تسمية باستخدام تيتراهيدروتشلوريدي 3,30-ديامينوبينزيديني (DAB) (RT، 5-10 دقيقة).
    8. وأخيراً، يذوي بالغسيل في زيادة تركيزات الإيثانول (س 1 في 30% (2 دقيقة)؛ س 1 في 50% (2 دقيقة)؛ س 1 في % 70 (2 دقيقة)؛ x 2 في 95% (2 دقيقة)؛ x 2 في 100% (2 دقيقة)) في الرايت، أقسام كونتيرستين باستخدام أسلوب الهيماتوكسيلين ويوزين25، وثم تحميل الشرائح الغطاء. وتشمل إيجابية وسلبية فضلا عن ضوابط ايستب.
      ملاحظة: بروتوكول مختصر الموصوفة أعلاه ليس المقصود للاستخدام العام إيمونوهيستوتشيميستري؛ الأمثل للأنسجة للفائدة وشروط أمر ضروري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

التباين عن طريق الجلد IMI توجيه ضربات القلب مع InI:

استخدام البروتوكول الموصوفة أعلاه، وبعد تحديد المواقع المثلى غيض الإبرة أكده تخطيط صدى القلب وحقن بدأت، هايبريتشوجينيسيتي ترانسمورال لوحظ أثناء تسليم InI (10% v/v في برنامج تلفزيوني) (الشكل 2E) ، كذلك وقت قصير بعد IMI للمنطقة المستهدفة (الشكل 2 واو). عندما IMI كان متبوعاً مباشرة بالقتل الرحيم وإزالة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وكان الهدف الأساسي لتطوير تقنية مينيملي التي يمكن استخدامها لإيصال الخلايا الجذعية في عضلة القلب من الأرانب (كبيرة حجم الإكلينيكية حيوان نموذجا)17،18، بينما الاستفادة من الاستخدام نظام متاحة بسهولة في كثير من السريرية التصوير غير مكلفة نسبيا ومراكز البحوث. هنا، نعرض، باستخدام نظام تخطيط القلب السريري، ويساعده InI، عامل متاح على نطاق واسع، مع كل من الموقع تتبع قدرات وخصائص اتشوجينيك، والتباين عن طريق الجلد الناجح توجيه ضربات القلب IMI فعالة جداً في إيصال ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون مونفورت شيلا، بريندا مارتينيز، كارلوس Micó، ألبرتو مونيوز، ومانويل مولينا للدعم الممتاز أثناء جمع البيانات، و "كارلوس بوينو" لتزويد الخلايا EGFP(+) HEK-293. وأيد هذا العمل جزئيا: مؤسسة Séneca، ص دي وكالة العلوم التكنولوجيا، المنطقة دي مورسيا، إسبانيا (ج ت) (منح عدد: 11935/PI/09)؛ العلاج دي الأحمر Celular، إيسسيي الفرعية. جرال. Redes، دي PN السادس أنا + د + أنا 2008-2011 (لا منحة. RD12/0019/0001) (جم)، تشترك في تمويله التمويل الهيكلي من "الاتحاد الأوروبي" (FEDER) (جم)؛ وجامعة ريدينغ، المملكة (AG، غيغابايت) المتحدة (التمويل المركزي). وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات والتحليل، وقرار نشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام الموجات فوق الصوتية HD11 XEالقلب 10670267فيليبس.
S12-4PhilipsB01YgG4-12 ميجاهرتز محول صفيف الطور
جل نقل بالموجات فوق الصوتية (أكواسون)مختبرات باركيت ، شركةN 01-08
Vasovet 24GBraunREF 381212  ؛ قسطرة فوق الإبرة
Omnifix-F 1 مل حقنةبراون9161406V
Imalgene (الكيتامين)MerialRN 9767الوصفة البيطرية ضرورية
Domtor (Medetomidine)EsteveCN 570686.3وصفة طبية بيطرية ضرورية
وسادة
تدفئة Faber-Castel TG1Faber-Castel16 33 99الهند (الصين) الحبر
هولتر SyneflashEla الطبيةSF0003044S24 ساعة هولتر نظام تخطيط القلب.
أقطاب كهربائية مستشعر أزرق & reg ؛أمبو (مخدر)VLC-00-S هولترأقطاب تخطيط القلب.
MicrotomeLeica BiosystemsRM2155
مجهرأوليمبوسCO11
ABC VectorVector LaboratoriesPK-6200Avidin Biotin Complex Kit.
الجسم المضاد للدجاج المضاد ل GFPInvitrogenA10262الجسم المضاد الأساسي.
مختبرات ناقلاتالأجسام المضادة IgG المضادة للماعز البيوتينيلBA-9010الجسم المضاد الثانوي.
3،30-ديامينوبنزيدين رباعي هيدروكلوريد (DAB)DAKO (Agilent)S3000
مجهر مضانكارل زايس
التصوير المجهري		Zeiss AX10 Axioskop
هولتر ECGElamedicalSyneflash SF0003044S
Dulbecco ' s وسيط النسر المعدل (DMEM)   ؛فيشر ساينتفيك11965084
10٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS)فيشر ساينتفيك11573397
0.05٪ حمض التربسين - إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)فيشر ساينتفيك25300054
ليبوفاكتامين 2000 (كاشف تعداء الدهون)فيشر ساينتفيك11668019
وسط مصل مخفض (Opti-MEM)فيشر ساينتفيك31985070
هيجروميسين بكالبيوكيم (ميرك)400051
زيلين (نسيجي)فيشر ساينتيفيكX3S-4
محلول بيروكسيد الهيدروجين (H2O2)سيجماH1009
برونازفيشر ساینتفيك53-702-250KU
نظام تخطيط صدى Elite

المراجع

  1. Hou, D., et al. Radiolabeled cell distribution after intramyocardial, intracoronary, and interstitial retrograde coronary venous delivery: implications for current clinical trials. Circulation. 112, I150-I156 (2005).
  2. Freyman, T., et al. A quantitative, randomized study evaluating three methods of mesenchymal stem cell delivery following myocardial infarction. Eur Heart J. 27, 1114-1122 (2006).
  3. Perin, E. C., et al. Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 44, 486-495 (2008).
  4. Dib, N., Khawaja, H., Varner, S., McCarthy, M., Campbell, A. Cell therapy for cardiovascular disease: a comparison of methods of delivery. J Cardiovasc Transl Res. 4, 177-181 (2011).
  5. Li, S. H., et al. Tracking cardiac engraftment and distribution of implanted bone marrow cells: Comparing intra-aortic, intravenous, and intramyocardial delivery. J Thorac Cardiovasc Surg. 137, e1221 1225-1233 (2009).
  6. Shiba, Y., et al. Human ES-cell-derived cardiomyocytes electrically couple and suppress arrhythmias in injured hearts. Nature. 489, 322-325 (2012).
  7. Chong, J. J., et al. Human embryonic-stem-cell-derived cardiomyocytes regenerate non-human primate hearts. Nature. 510, 273-277 (2014).
  8. Lu, C., et al. Autologous bone marrow cell transplantation improves left ventricular function in rabbit hearts with cardiomyopathy via myocardial regeneration-unrelated mechanisms. Heart vessels. 21, 180-187 (2006).
  9. McMurray, J. J., et al. ESC guidelines for the diagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012: The Task Force for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012 of the European Society of Cardiology. Developed in collaboration with the Heart Failure Association (HFA) of the ESC . Eur J Heart Fail. 14, 803-869 (2012).
  10. Sueta, C. A. The life cycle of the heart failure patient. Curr Cardiol Rev. 11, 2-3 (2015).
  11. Carver, J. R., et al. American Society of Clinical Oncology clinical evidence review on the ongoing care of adult cancer survivors: cardiac and pulmonary late effects. J Clin Oncol. 25, 3991-4008 (2007).
  12. Verdecchia, A., et al. Recent cancer survival in Europe: a 2000-02 period analysis of EUROCARE-4 data. Lancet Oncol. 8, 784-796 (2007).
  13. De Angelis, R., et al. Cancer survival in Europe 1999-2007 by country and age: results of EUROCARE--5-a population-based study. Lancet Oncol. 15, 23-34 (2014).
  14. Abu-Zidan, F. M., Hefny, A. F., Corr, P. Clinical ultrasound physics. J Emerg Trauma Shock. 4, 501-503 (2011).
  15. Del, M. F., Mynett, J. R., Sugden, P. H., Poole-Wilson, P. A., Harding, S. E. Subcellular mechanism of the species difference in the contractile response of ventricular myocytes to endothelin-1. Cardioscience. 4, 185-191 (1993).
  16. Pogwizd, S. M., Bers, D. M. Rabbit models of heart disease. Drug Discov Today Dis Mod. 5, 185-193 (2008).
  17. Gandolfi, F., et al. Large animal models for cardiac stem cell therapies. Theriogenology. 75, 1416-1425 (2011).
  18. Harding, J., Roberts, R. M., Mirochnitchenko, O. Large animal models for stem cell therapy. Stem Cell Res Ther. 4, 23(2013).
  19. Chong, J. J., Murry, C. E. Cardiac regeneration using pluripotent stem cells--progression to large animal models. Stem Cell Res. 13, 654-665 (2014).
  20. Talavera, J., et al. An Upgrade on the Rabbit Model of Anthracycline-Induced Cardiomyopathy: Shorter Protocol, Reduced Mortality, and Higher Incidence of Overt Dilated Cardiomyopathy. BioMed Res Int. 2015, 465342(2015).
  21. Bueno, C., et al. Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain. Cell Transplant. 22, 2017-2028 (2013).
  22. Sahn, D. J., DeMaria, A., Kisslo, J., Weyman, A. Recommendations regarding quantitation in M-mode echocardiography: results of a survey of echocardiographic measurements. Circulation. 58, 1072-1083 (1978).
  23. Thomas, W. P., et al. Recommendations for standards in transthoracic two-dimensional echocardiography in the dog and cat. Echocardiography Committee of the Specialty of Cardiology, American College of Veterinary Internal Medicine. J Vet Intern Med. 7, 247-252 (1993).
  24. Lang, R. M., et al. Recommendations for cardiac chamber quantification by echocardiography in adults: an update from the American Society of Echocardiography and the European Association of Cardiovascular Imaging. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 16, 233-270 (2015).
  25. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods Mol Biol. 1180, 31-43 (2014).
  26. Howat, W. J., Wilson, B. A. Tissue fixation and the effect of molecular fixatives on downstream staining procedures. Methods. 70, 12-19 (2014).
  27. Cohen, A. H. Masson's trichrome stain in the evaluation of renal biopsies. An appraisal. Am J Clin Pathol. 65, 631-643 (1976).
  28. Corti, R., et al. Real time magnetic resonance guided endomyocardial local delivery. Heart. 91, 348-353 (2005).
  29. Springer, M. L., et al. Closed-chest cell injections into mouse myocardium guided by high-resolution echocardiography. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H1307-H1314 (2005).
  30. Aoki, M., et al. Efficient in vivo gene transfer into the heart in the rat myocardial infarction model using the HVJ (Hemagglutinating Virus of Japan)--liposome method. J Mol Cell Cardiol. 29, 949-959 (1997).
  31. Guzman, R. J., Lemarchand, P., Crystal, R. G., Epstein, S. E., Finkel, T. Efficient gene transfer into myocardium by direct injection of adenovirus vectors. Circ Res. 73, 1202-1207 (1993).
  32. Magovern, C. J., et al. Direct in vivo gene transfer to canine myocardium using a replication-deficient adenovirus vector. Ann Thorac Surg. 62, 425-433 (1996).
  33. Suzuki, K., et al. Role of interleukin-1beta in acute inflammation and graft death after cell transplantation to the heart. Circulation. 110, II219-II224 (2004).
  34. Fukushima, S., et al. Direct intramyocardial but not intracoronary injection of bone marrow cells induces ventricular arrhythmias in a rat chronic ischemic heart failure model. Circulation. 115, 2254-2261 (2007).
  35. Miller, L. W., Taylor, D. A., Willerson, J. T. Stem Cell and Gene Therapy for Cardiovascular Disease. , Academic Press. 13-23 (2016).
  36. Fargas, A., Roma, J., Gratacos, M., Roig, M. Distribution and effects of a single intramuscular injection of India ink in mice. Ann Anat. 185, 183-187 (2003).
  37. Dib, N., et al. Recommendations for successful training on methods of delivery of biologics for cardiac regeneration: a report of the International Society for Cardiovascular Translational Research. JACC Cardiovasc Interv. 3, 265-275 (2010).
  38. Mu, Y., Cao, G., Zeng, Q., Li, Y. Transplantation of induced bone marrow mesenchymal stem cells improves the cardiac function of rabbits with dilated cardiomyopathy via upregulation of vascular endothelial growth factor and its receptors. Exp Biol Med (Maywood). 236, 1100-1107 (2011).
  39. Giraldo, A., et al. Percutaneous intramyocardial injection of amniotic membrane-derived mesenchymal stem cells improves ventricular function and survival in non-ischaemic cardiomyopathy in rabbits. Eur Heart J. 36, 149(2015).
  40. Giraldo, A., et al. Allogeneic amniotic membrane-derived mesenchymal stem cell therapy is cardioprotective, restores myocardial function, and improves survival in a model of anthracycline-induced cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 19, 594(2017).
  41. Prendiville, T. W., et al. Ultrasound-guided transthoracic intramyocardial injection in mice. J Vis Exp. , e51566(2014).
  42. Laakmann, S., et al. Minimally invasive closed-chest ultrasound-guided substance delivery into the pericardial space in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 386, 227-238 (2013).
  43. Hasenfuss, G. Animal models of human cardiovascular disease, heart failure and hypertrophy. Cardiovasc Res. 39, 60-76 (1998).
  44. Ponikowski, P., et al. Depressed heart rate variability as an independent predictor of death in chronic congestive heart failure secondary to ischemic or idiopathic dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 79, 1645-1650 (1997).
  45. Nolan, J., et al. Prospective study of heart rate variability and mortality in chronic heart failure: results of the United Kingdom heart failure evaluation and assessment of risk trial (UK-heart). Circulation. 98, 1510-1516 (1998).
  46. Galinier, M., et al. Depressed low frequency power of heart rate variability as an independent predictor of sudden death in chronic heart failure. Eur Heart J. 21, 475-482 (2000).
  47. Sheng, C. C., Zhou, L., Hao, J. Current stem cell delivery methods for myocardial repair. BioMed Res Int. 2013, 547902(2013).
  48. Kim, R. J., et al. The use of contrast-enhanced magnetic resonance imaging to identify reversible myocardial dysfunction. N Engl J Med. 343, 1445-1453 (2000).
  49. Perin, E. C., et al. Transendocardial, autologous bone marrow cell transplantation for severe, chronic ischemic heart failure. Circulation. 107, 2294-2302 (2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

eGFP
حقن إينتراميوكارديال توجيه ضربات القلب التباين عن طريق الجلد وتسليم خلية في نموذج الإكلينيكية كبير
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.