يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

المراقبة والتحليل من تطرف تشتت رامان المزودة بسطح

7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56729

⸱

يناير 11, 2018

1Department of Chemistry, Kwansei Gakuin University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تحليل تطرف رامان المزودة بسطح التشتت بسبب المشي العشوائي لجزيء واحد على سطح فضة باستخدام قوانين السلطة.

الملخص

من جزيء واحد مفترق نانواجريجاتي فضة، يلاحظ الوميض رامان المزودة بسطح نثر (SERS). هنا، يقدم بروتوكول حول كيفية إعداد SERS-النشط الفضي نانواجريجاتي وتسجيل فيديو لبعض البقع وامض في الصورة المجهرية، وتحليل الإحصاءات وامض. في هذا التحليل، يستنسخ قانون سلطة التوزيعات الاحتمالية للأحداث مشرق بالنسبة إلى المدة التي ستستغرقها. التوزيعات الاحتمالية للأحداث المظلمة مزودة بقانون طاقة مع دالة آسيه. معلمات قانون الطاقة تمثل السلوك الجزيئي في الدول الساطعة والمعتمة على حد سواء. ويمكن تقدير نموذج عشوائي سيرا على الأقدام وسرعة الجزيء عبر كامل سطح الفضة. فإنه من الصعب تقدير حتى عند استخدام المتوسطات ومهام ترابط تلقائي، وتصوير SERS القرار فائقة. في المستقبل، تحليلات القانون السلطة ينبغي أن تقترن بالتصوير الطيفي، لأن أصول تطرف لا يمكن تأكيده بهذا الأسلوب تحليل وحدها.

المقدمة

رامان المزودة بسطح نثر (SERS) هي حساسة للغاية رامان الطيفي من سطح معدن النبيلة. منذ الطيف رامان، يوفر معلومات مفصلة حول بنية جزيئية استناداً إلى مواقف الذروة الحادة، من خلال وسائط الذبذبات من المجموعات الوظيفية في الجزيئات، يمكن أن يحقق في المعلومات من جزيء واحد على سطح معدني استخدام SERS1،،من23. من نانواجريجاتي فضة مع أدسورباتي على مستوى جزيء واحد، يلاحظ إشارة وامض1،2،،من34،،من56، 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16، والطيف يتقلب1،2،3،4،،من56،،من78، 9،10،،من1112،،من1314. يمكن أن يكون الوميض الناجم عن جزيء واحد يتحرك عشوائياً داخل وخارج حقل (م) كهرومغناطيسية معززة مفترق نانواجريجاتي فضة نانومتر الحجم. ولذلك، يعتبر تطرف أدلة بسيطة للكشف عن جزيء واحد، بالمقارنة مع تقنية استخدام توزيع بواسون SERS و3،2،ثنائية-أكثر من17. بيد أن آليات تفصيلية من الطيف الوامض ومتقلبة، والتي قد تعتمد بشدة على سلوك الجزيئية على سطح Ag، لا تزال مثيرة للجدل.

في دراسات سابقة، تطرف SERS قد تم تحليلها باستخدام الدالة ترابط تلقائي، الذي يمكن حساب معامل الانتشار وتركيز الجزيئات تتحرك وخارجها تعزيز م ميدان12،13،14 . وعلاوة على ذلك، درجة انحراف المعياري تم تسويتها، الذي يمثل عدم الاستقرار في كثافة المجموع، مستمدة من صورة إشارة15مرة. بيد أن هذه النهج التحليلي قد يكون استناداً إلى سلوك جزيئات قليلة. وفي المقابل، في تصوير فائقة قرار تطرف SERS، يمكن أن يكون السلوك جزيء واحد في حقل م تعزيز حددت16. ومع ذلك، يمكن الحصول على هذه التقنيات هذه المعلمات فقط في حقل م معززة. ويمكن تمثيل سلوك عشوائي من جزيء واحد داخل مجموعة واسعة (على سبيل المثال، في تطرف SERS) كقانون قوة بدلاً من متوسط4،5،،من67،8 ،،من910،11، مماثلة للأسفار وامض من أشباه الموصلات واحد كم دوت (QD)18،19. باستخدام قوة القانون تحليل4،5،6،،من78،9،10،11، والسلوك الجزيئي ويمكن تقدير في مشرق الدولة (في مجال طب الطوارئ المعززة) والدولة الظلام10؛ هذا هو، يمكن تقدير سلوك الجزيء على كامل سطح الفضة.

لهذا الأسلوب، يتم نانواجريجاتيس الفضة الغروية المستخدمة4،5،،من67،،من89،10،11. وتظهر هذه نانواجريجاتيس مختلف نطاقات الرنين () مترجمة مأكل مثل الطحين السطحية التي تؤثر على الحقول الكهرومغناطيسية معززة بقوة عندما تكون متحمس عند أطوال موجية معينة. وهكذا، يمكن فورا الحصول على فضية نشطة SERS جسيمات نانوية موجودة في تعليق غرواني، وبعض البيانات. في حالة النانو البسيطة، التي لها أحجام محددة، والأشكال، والترتيبات، اعتماد LSPR SERS وامض يمكن إخفاء أخرى الاعتماد7؛ إلا وهي إذا تم استخدام نانوستروكتوري جيدة أو سيئة إلى LSPR، المعلمات سوف تكون ثابتة، وسوف تكون مخفية الاعتماد الأخرى لذلك. وقد استخدمت تحليل قانون الطاقة لاكتشاف الاعتماد المختلفة من SERS وامض من الفضة الغروية نانواجريجاتيس4،5،6،،من78، 9 , 10 , 11.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد نموذج

  1. إعداد الجسيمات النانوية الغروية الفضة 20
    1. إلى اختﻻق الجسيمات النانوية الغروية الفضة، حل 0.030 ز من نترات الفضة و 0.030 ز من سترات صوديوم ثنائي هيدرات في 150 مل من الماء في قارورة 200 مل قاع جولة.
    2. تجمع في قارورة مع مكثف ارتداد (ديمروث).
    3. إثارة الحل في قارورة مع شريط محرض وآثاره مغناطيسية. ثم الحرارة الحل إثارة في قارورة في حمام زيت عند 150 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
      ملاحظة: سوف تتحول الحل الرمادي الأصفر، ثم درب التبانة.
    4. كول التعليق في درجة حرارة الغرفة، والحفاظ على التعليق في قارورة مغطاة برقائق الألومنيوم في ثلاجة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً في البروتوكول في هذه المرحلة. استخدم الجسيمات النانوية الغروية، بعد تخزينها في ثلاجة، في غضون شهر واحد.
  2. إعداد نموذج للملونة المتعددة تطرف الانبعاثات 11
    1. إلى استعداد شريحة مجهر وتغسل صفيحة زجاج بالماء والصابون باليد وشطفه بالماء.
    2. إضافة بولي-L-يسين 0.1% محلول مائي للوح الزجاج، وإزالة الحل مع منفاخ.
    3. إضافة تعليق غرواني الفضة إلى اللوحة الزجاجية، وإزالة التعليق مع منفاخ.
    4. أرفق منطقة إسقاط على اللوحة الزجاجية بقلم مانع سائل.
    5. قطره الماء المقطر على اللوحة الزجاجية، وتغطية ذلك مع لوحة زجاج آخر إنشاء شريحة مجهر ومنع المياه من التبخر.
  3. إعداد نموذج لرتابة SERS وامض الملونة 7 , 8 , 9 , 10
    1. إلى استعداد شريحة مجهر وتغسل صفيحة زجاج بالماء والصابون باليد وشطفه بالماء.
    2. مزيج تعليق غرواني فضي مع صبغة ثياسيانيني أو ثياكاربوسيانيني (25 أو 4 ميكرومتر، على التوالي) ومحلول كلوريد الصوديوم (10 مم) بنسبة حجم من 2:1:1.
    3. إسقاط تعليق عينة على لوح الزجاج، وإزالة التعليق مع منفاخ.
    4. أرفق منطقة إسقاط على اللوحة الزجاجية بقلم مانع سائل.
    5. إسقاط محلول مائي لكلوريد الصوديوم (1 م) على اللوحة الزجاجية شل جسيمات نانوية فضية، وتغطية ذلك مع لوحة زجاج آخر لإنشاء لوحة شرائح مجهر ومنع الحل من التبخر.

2-المراقبة من تطرف جسيمات فضة نانوية

  1. إضاءة عينة
    1. ضع لوحة زجاج العينة المعدة باستخدام بروتوكول 1.2 أو 1.3 في مرحلة المجهر المقلوب.
    2. إلقاء الضوء على لوحة الزجاج العينة باستخدام الضوء الأبيض من خلال الحقل المظلم المكثف، والتركيز على مختلف البقع الملونة (الأزرق، الأخضر والأصفر والأحمر) على لوحة الزجاج باستخدام عدسة الهدف (60 س).
    3. إلقاء الضوء على لوحة الزجاج عينة استخدام شعاع الموهنة، سلم بزاوية 30 درجة بالنسبة لسطح العينة، من صمام ثنائي ليزر كونتينووسوافي (cw) يتم ضخها حالة صلبة (الإحصاء) من خلال عامل تصفية تدخل.
    4. لاستخدام الإضاءة الليزر لمراقبة نانواجريجاتيس الفضي رتابة البقع الملونة نفس اللون المجاورة، نقل منطقة الإضاءة الليزر إلى المركز من طريقة العرض، والتركيز على البقع على لوحة الزجاج بضبط المرحلة في الاتجاه-z.
  2. المراقبة من تطرف
    1. إدراج عامل تصفية تمرير طويلة بعد العدسة الهدف، وتُضِيءُ لوحة زجاج العينة باستخدام شعاع ليزر cw والعسف تسليمها بزاوية 30 درجة بالنسبة لسطح العينة من خلال عامل تصفية تدخل.
    2. العثور تطرف البقع كما هو مبين في الشكل 1 (انظر أيضا الشكل S1 في المواد التكميلية) بالانتقال المرحلة في الاتجاهين x و y.
    3. تسجيل الفيديو من البقع وامض مع المجهر المقلوب، بالإضافة إلى كاميرا تبريد رقمية جهاز اقتران (CCD)، التي لديها قرار وقت 61-120 مللي ثانية، لمدة 20 دقيقة.

3-تحليل تطرف SERS

  1. اشتقاق من الوقت الشخصية من الفيديو
    1. في البرنامج الذي يتحكم كاميرا CCD، قم بفتح ملف الفيديو.
    2. لتحديد البقع وامض ومنطقة مظلمة، اسحب المناطق التي تغطي المناطق مع أو بدون بقع في صورة الفيديو بشكل منفصل.
    3. أن تستمد إشارة الوقت كثافة البقع وامض، والمناطق المظلمة في شريط الفيديو، حدد التحليل الزمني في التحليل، وانقر فوق حساب في إطار التحليل الزماني .
    4. حفظ البيانات كملف نصي.
  2. تحليل للشخصية الوقت
    1. تسطيح خط أساس الزمني بطرح الشخصية الوقت من منطقة مظلمة و/أو تركيب مع دالة متعدد الحدود، كما هو مبين في الأرقام 2 ألف و 2 باء.
    2. تقييم كثافة أساس متوسط يتكون من حوالي 2000 نقطة و أناقاعدةوانحراف المعياري لدرجات الأساس، σ، كما هو مبين في الأرقام 2 و 2D.
    3. التمييز بين الأحداث مشرق من أحداث الظلام باستخدام كثافة أكبر من عتبة أناقاعدة + 3σ، وتسجيل مدة كل حدث. في الشكل 3، على سبيل المثال، تسجيل الحدث من 0 إلى 3.5476 s كحدث الظلام (مع مدة t = 3.5476 s)، وتسجيل الحدث من 3.5476 إلى 4.0981 s كحدث مشرق (مع مدة t = 0.5505 s). كرر الإجراء كما هو مبين في الجدول 1.
    4. حساب عدد الأحداث مشرقة ومظلمة لكل فترة، كما أعرب عنه في الأسطر الأولى والثانية من الجدول 2.
    5. مجموع عدد الأحداث لكل فترة، باستثناء الأحداث أقصر من المدة t. كما أعربت في الأسطر الثاني والثالث من الجدول 2، على سبيل المثال، مجموع عدد الأحداث كل فترة (باستثناء الأحداث ل t = 0.0612 s) ك 41 + 18 + 9 +... النتيجة يساوي مجموع ل t = 0.1223 ثانية، أي 103.
    6. القسمة المجموع كل مدة، وتطبيع هذه. كما ورد في الجدول 2، على سبيل المثال، تقسيم ملخص للمدة t = 0.0612 s من s مدة 0.0612. والنتيجة هي 3,351.5791. ثم تقسيم الناتج على مجموع النتائج في السطر الرابع في الجدول 2. يتم اشتقاق التوزيع الاحتمالي لتكون 0.64494.
    7. ارسم التوزيعات الاحتمالية للأحداث مشرق فعلى(t) ضد بهم مدة تي في رسم بياني لوغاريتم لوغاريتم، واحتواء سجل10ففي(t) بسجل10 (figure-protocol-1) للاستدلال قوة القانون α الأسعلى لتطرف بقعة معينة. إذا كان فعلى(t) مزودة ب figure-protocol-2 ، السطر المجهزة ينحرف عن المؤامرات في قيم صغيرة من فعلى(t)، كما هو موضح بالخط المنقط في الشكل 4أ.
    8. ارسم التوزيعات الاحتمالية لإحداث الظلام فقبالة(t) ضد بهم مدة تي في رسم بياني لوغاريتم لوغاريتم، واحتواء سجل10فقبالة(t) بسجل10( figure-protocol-3 للاستدلال قوة القانون α الأسقبالة واقتطاع وقت τ من تطرف نفس البقعة. إذا كان فقبالة(t) مزودة ب figure-protocol-4 ، ينحرف منحنى المجهزة من المؤامرات في قيم صغيرة من فقبالة(t).
    9. كرر 3.2.1 إلى 3.2.8 لغيرها من مناطق وامض في شريط الفيديو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

من نانواجريجاتيس الفضي مع بولي-L-يسين أعدها بروتوكول 1.2، لاحظ البقع وامضة متعددة الألوان من SERS والمزودة بسطح الأسفار، كما هو مبين في الشكل 111. وفي المقابل، لوحظت رتابة البقع الملونة وامض من SERS نانواجريجاتيس الفضة مع جزيئات الصبغ أعدها بروتوكول 1.37،،من89،10. هناك نوعان من النتائج "السلبية": نتائج مستمرة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من مفرق نانواجريجاتي الفضة، ينبعث SERS. وبالتالي، نحن بحاجة إلى إعداد نانواجريجاتيس بدلاً من الجسيمات النانوية الغروية، التي تغطيها مع الأنيونات سترات. تتشكل المجاميع الفضية من التمليح على الأثر التي تم إنشاؤها بواسطة إضافة بولي-L-يسين-NH3+ وهو أصل SERS، أو الكاتيونات نا+ من كلوريد الصوديوم، كما هو مبين في الشكل S2 من المواد التكميلية. وعلاوة على ذلك، لإلقاء الضوء على العديد من المواقع في منطقة واسعة، يتم تسليم شعاع الليزر غير مركزة بزاوية 30 درجة بالنسبة لسطح العينة، من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس له علاقة بالكشف عن صاحب البلاغ.

شكر وتقدير

بفضل المؤلف الأستاذ يوسف اوزاكي (جامعة Kwansei Gakuin) والدكتور ت. إيتو (المعهد الوطني للعلوم الصناعية المتقدمة والتكنولوجيا) لمناقشة مثمرة لهذا العمل. وأيد هذا العمل كاكينهي (معونات ج البحوث العلمية) من وزارة التربية والتعليم، والثقافة والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (رقم 16 ك 05671).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نترات الفضة ، 99.8٪واكو194-00832
ثنائي هيدرات سترات ثلاثي الصوديوم ، 99. ٪واكو191-01785
محلول مائي بولي إل ليسين ، 0.1٪سيجما ألدريتشP8920
3،3 '-ديسولفوبروبيل ثياسياسينين ثلاثي إيثيل أمينمختبرات هايشيبارا للكيمياء الحيويةNK-2703نوع من أصباغ
الثياسيانين3،3'-ثنائي إيثيل -5،5 '-ثنائي كلورو-9-ميثيل ثياكرباوسيانين ملح اليودمختبرات هاياشيبارا للكيمياء الحيويةSMP-9نوع من أصباغ الثياكاروبوسيانين
كلوريد الصوديوم ، 99.5٪واكو191-01665
مكثف ديمروثإيواكي61-9722-22مطارد من حمام زيت AS ONE
CorningDC-420D
AdvantechOS-220
لوحة زجاجيةMatsunamiS-1112مجهر شريحة
منفاخHozanZ-288منفضة الهواء
قلم مانع السوائلDaido SangyoLIQUID BLOCKER (Super Pap Pen). قلم حاجز مسعور جاهز للاستخدام مصمم لتطبيقات الكيمياء المناعية
المجهر المقلوبأوليمبوسIX-70
عدسة موضوعيةأوليمبوسLCPlanFl 60 مرة ؛NA 0.7
مكثف المجالالمظلم أوليمبوس U-DCDNA 0.8 & ndash ؛ 0.92
كاميرا CCD الرقمية المبردةHamamatsuORCA-AGالتي تسيطر عليها برنامج Aqua Cosmos
Software لكاميرا CCD الرقمية المبردةHamamatsuAquaCosmosالمستخدمة أيضا لاشتقاق الملامح الزمنية من البقع الوامضة في الفيديو  
كاميرا CCD ملونةELMOTNC-C920غير مستخدمة لتحليل
نظام ليزرDPSSRGB NovaPro532-75& lambda ؛ = 532 نانومتر ؛
60 ميجاوات (يتوافق مع كثافة طاقة تبلغ 600 واط / سم 2)
مرشح التداخلSemrockLL01-532-12.5
مرشح التمرير الطويلSemrockBLP01-532R-25
برنامج لتمييز وعد الأحداث الساطعة / المظلمةخادمةالمبرمجة بواسطة C ++
Software للتركيب من خلال قانون الطاقةLightStoneOrigin6.1
المنزل

المراجع

  1. Qian, X. M., Nie, S. M. Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from fundamental mechanisms to biomedical applications. Chem. Soc. Rev. 37, 912-920 (2008).
  2. Pieczonka, N. P. W., Aroca, R. F. Single molecule analysis by surfaced-enhanced Raman scattering. Chem. Soc. Rev. 37, 946-954 (2008).
  3. Kneipp, J., Kneipp, H., Kneipp, K. SERS -a single-molecule and nanoscale tool for bioanalytics. Chem. Soc. Rev. 37, 1052-1060 (2008).
  4. Kitahama, Y., Ozaki, Y. Analysis of blinking SERS by a power law with an exponential function. Frontiers of Surface-Enhanced Raman Scattering: Single-Nanoparticles and Single Cells. , Wiley. Chichester. Chapter 6 (2014).
  5. Kitahama, Y. Truncated Power Law Analysis of Blinking SERS. Frontiers of Plasmon Enhanced Spectroscopy Volume 1 (ACS Symposium series Vol. 1245). , American Chemical Society. Washington DC. Chapter 4 (2016).
  6. Bizzarri, A. R., Cannistraro, S. Lévy Statistics of Vibrational Mode Fluctuations of Single Molecules from Surface-Enhanced Raman Scattering. Phys. Rev. Lett. 94, 068303(2005).
  7. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Power-law analysis of surface-plasmon-enhanced electromagnetic field dependence of blinking SERS of thiacyanine or thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, 7439-7448 (2011).
  8. Kitahama, Y., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of excitation laser intensity dependence of blinking SERRS of thiacarbocyanine adsorbed on single silver nanoaggregates by using a power law with an exponential function. Chem. Commun. 47, 3888-3890 (2011).
  9. Kitahama, Y., Enogaki, A., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Truncated power law analysis of blinking SERS of thiacyanine molecules adsorbed on single silver nanoaggregates by excitation at various wavelengths. J. Phys. Chem. C. 117, 9397-9403 (2013).
  10. Kitahama, Y., Araki, D., Yamamoto, Y. S., Itoh, T., Ozaki, Y. Different behaviour of molecules in dark SERS state on colloidal Ag nanoparticles estimated by truncated power law analysis of blinking SERS. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, 21204-21210 (2015).
  11. Kitahama, Y., Nagahiro, T., Tanaka, Y., Itoh, T., Ozaki, Y. Analysis of blinking from multicoloured SERS-active Ag colloidal nanoaggregates with poly-L-lysine via truncated power law. J. Raman. Spectrosc. 48, 570-577 (2017).
  12. Habuchi, S., et al. Single-Molecule Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy of the Enhanced Green Fluorescent Protein. J. Am. Chem. Soc. 125, 8446-8447 (2003).
  13. Weiss, A., Haran, G. Time-Dependent Single-Molecule Raman Scattering as a Probe of Surface Dynamics. J. Phys. Chem. B. 105, 12348-12354 (2001).
  14. Emory, S. R., Jensen, R. A., Wenda, T., Han, M., Nie, S. Re-examining the origins of spectral blinking in single-molecule and single-nanoparticle SERS. Faraday Discuss. 132, 249-259 (2006).
  15. Itoh, T., Iga, M., Tamaru, H., Yoshida, K., Biju, V., Ishikawa, M. Quantitative evaluation of blinking in surface enhanced resonance Raman scattering and fluorescence by electromagnetic mechanism. J. Chem. Phys. 136, 024703(2012).
  16. Willets, K. A. Super-resolution imaging of SERS hot spots. Chem. Soc. Rev. 43, 3854-3864 (2014).
  17. Dieringer, J. A., Lettan, R. B., Scheidt, K. A., Van Duyne, R. P. A Frequency Domain Existence Proof of Single-Molecule Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 129, 16249-16256 (2007).
  18. Cichos, F., von Borczyskowski, C., Orrit, M. Power-law intermittency of single emitters. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 12, 272-284 (2007).
  19. Tang, J., Marcus, R. A. Mechanisms of fluorescence blinking in semiconductor nanocrystal quantum dots. J. Chem. Phys. 123, 054704(2005).
  20. Lee, P. C., Meisel, D. Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem. 86, 3391-3395 (1982).
  21. Krichevsky, O., Bonnet, G. Fluorescence correlation spectroscopy: the technique and its applications. Rep. Prog. Phys. 65, 251-297 (2002).
  22. Hess, S. T., Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Biological and Chemical Applications of Fluorescence Correlation Spectroscopy: A Review. Biochemistry. 41, 697-705 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

SERS CCD
المراقبة والتحليل من تطرف تشتت رامان المزودة بسطح
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.