مقالة منهجية

جمع واستخراج عينات من الهواء المهنية لتحليل الحمض النووي الفطرية

12.2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/56730

⸱

مايو 2, 2018

 ,  , 
1Allergy and Clinical Immunology Branch, Health Effects Laboratory Division, National Institute for Occupational Safety and Health, Centers for Disease Control and Prevention

في هذه المقالة

ملخص

تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة طريقة تستخدم في الدراسات الصحية المهنية لتحديد المخاطر الصحية. ويصف هذا البروتوكول استخراج الحمض النووي من عينات الهواء المهنية للتضخيم وتسلسل الفطرية للبحث عن المناطق. هذا النهج يكشف العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن التغاضي عنها بأساليب التقييم التقليدية.

الملخص

الأساليب التقليدية لتحديد التعرض الفطرية في البيئات المهنية، مثل الثقافة والنهج القائم على الفحص المجهري، لديها العديد من القيود التي أدت إلى استبعاد العديد من الأنواع. وقد أدت التطورات في هذا المجال على مدى العقدين الماضيين الباحثين في مجال الصحة المهنية إلى التحول إلى النهج المستندة إلى الجزيئية لتحديد المخاطر الفطرية. وأدت هذه الأساليب في الكشف عن العديد من الأنواع داخل البيئات الداخلية والمهنية التي لم يتم اكتشاف باستخدام الأساليب التقليدية. تفاصيل البروتوكول هذا نهج لتحديد التنوع الفطرية داخل الهواء عينات عن طريق استخراج الحمض النووي الجينومي والتضخيم وتسلسلها والتعريف التصنيفي للفطريات الداخلية نسخها مناطق فاصلة (البحث عن). نتائجه التسلسل في الكشف عن العديد من الأنواع الفطرية التي غير المكتشفة أو صعوبة في التعرف على مستوى الأنواع باستخدام الثقافة أو مجهرية. في حين أن هذه الأساليب لا توفر التدابير الكمية من عبء الفطرية، أنها توفر نهجاً جديداً لتحديد المخاطر ويمكن استخدامها لتحديد ثراء الأنواع العامة والتنوع داخل بيئة مهنية.

المقدمة

يمكن أن يؤدي التعرض الفطرية في البيئات الداخلية والمهنية المراضات الجهاز التنفسي، بما في ذلك التوعية بالحساسية والربو1. من المهم تحديد المخاطر الفطرية لتقييم المخاطر ومنع تعرض العمال. قد تكون هذه المخاطر الفطرية نتيجة لتلوث داخلي، تسرب الهواء الخارجي، أو الاضطرابات البيئية تؤدي إلى نقل المواد الفطرية في المناطق التي تكون فيها العمال الحالي2. وشملت الأساليب لتقييم التعرض الفطرية العينات الثقافة قابلة للاستمرار، فضلا عن تحديد مجهرية من الجراثيم الفطرية. هذه النهج العديد من القيود وغالباً ما تتجاهل العديد من الأنواع الفطرية التي يمكن أن تسهم في عبء الفطرية عموما3. يمكن تمييز النهج المستندة إلى الثقافة فقط تلك الكائنات الفطرية قابلة للتطبيق التي يمكن زراعتها في وسائل الإعلام المغذيات. يمكن مرتبك تحديد الجراثيم الفطرية على مستوى الأنواع عن طريق الفحص المجهري بجراثيم تقاسم مورفولوجيس مماثلة. كلتا الطريقتين تعتمد اعتماداً كبيرا على ميكولوجيستس لتحليل وتحديد الأنواع الفطرية، مع العديد من تبقى مجهولة.

ولتحسين المنهجيات الحالية المستخدمة في تحديد المخاطر المهنية وتقييم التعرض، تحولت العديد من الباحثين للتقنيات الجزيئية. وقد كشفت عن النهج القائم على التسلسل لتقييم التنوع الميكروبي داخل البيئات الداخلية والمهنية نطاقا أوسع من الأنواع الفطرية التي واجهت مقارنة بأساليب مثل الفحص المجهري والثقافة قابلة للتطبيق3،4 ،5. ويصف الطريقة المعروضة هنا عينات الهواء من البيئات المهنية واستخراج الحمض النووي للتعرف على الإخطار المحتملة الفطرية. ويتم إنجاز تحديد المخاطر بالتسلسل النووي ريبوسومال مباعدة يدون الداخلية، أو للبحث عن، المناطق اختلافاً كبيرا بين الفطريات واستخدمت عادة للتمييز بين الأنواع الفطرية6،7، 8،9. العديد من الأنواع الموجودة في إعدادات المهنية، مثل بعض الأنواع المنتمية للأسرة في اللغات باسيديوميكوتا، لا يمكن تبينه في الثقافة قابلة للحياة ومن الصعب التفريق بين مجهريا. لوحظت هذه الفطريات في الوفرة النسبية عالية داخل البيئات الداخلية والمهنية المقررة حسب تسلسلها الفطرية للبحث عن مناطق3،،من410. وقدمت لها تسلسل معرفة أكبر إلى تنوع الفطريات مصادفة داخل البيئات الداخلية والمهنية.

ووصف البروتوكول هنا تفاصيل الطرق المستخدمة لجمع واستخراج، وتضخيم الفطرية للبحث عن مناطق من بيوايروسولس لتحليل تسلسل. وهذا النهج يستخدم المعهد الوطني "السلامة المهنية" والصحة (هي) الإعصار مرحلتين الأيروسول العينات لجمع الجسيمات في الهواء. ووضعت هذه العينات لجمع بيوايروسولس ومنفصلة للاستنشاق (دي فور القطر الأيرودينامية ميكرومتر) وغير للاستنشاق (> 4 ميكرومتر الأيرودينامية القطر) الجسيمات، التي تسمح بتحديد هوية الكائنات الفطرية داخل البيئات المغلقة التي أكثر يحتمل أن يكون استنشاقه بعامل11. تتوفر العينات الجوية الأخرى، بما في ذلك أخذ العينات من الإعصار، في الأسواق التي لديها القدرة على جمع الجسيمات داخل النطاق للاستنشاق (< 4 ميكرومتر) باستخدام عوامل تصفية12،13. وفي المقابل، يفصل عينات الأيروسول إعصار مرحلتين هي الأنواع الفطرية استناداً إلى طول القطر الأيرودينامية في أنابيب المتاح، والبولي بروبيلين الذي يمكن معالجته فورا لطلبات المتلقين للمعلومات14.

ترد تفاصيل عمليات استخراج الحمض النووي وتضخيم للبحث عن المناطق الفطرية في هذا البروتوكول. وضعت منهجيات الاستخراج المقدمة خصيصا لاستخراج الحمض النووي من الفطريات والبكتيريا، كما العديد من مجموعات تجارية تستهدف خلايا الثدييات، والبكتيريا، أو على وجه التحديد الخمائر15. يتم اختيار أجهزة الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة تستند على التغطية الشاملة لكل 1، الفطرية والمناطق 2،4،5. يسمح وضع تسلسل لهذه المناطق للمقارنة بين العديد من تسلسل للبحث عن راهن، بما في ذلك التسلسل المنطقة 1، أو 2 في منطقة أو مناطق كل من 1، و 2،. تنوع الفطرية لعينات من الهواء جمعت في استخدام الإعداد داخلي تظهر هذه الأساليب، الكشف عن عدد كبير من تسلسلات وضعها في يعج أسكوميكوتا وباسيديوميكوتا، فضلا عن تسلسلات أخرى تنتمي إلى أقل المهيمنة يعج الفطرية، مثل زيجوميكوتا. أن لم يتم التقاط التنوع الكبير في تسلسل الفطرية المحددة باستخدام هذا النهج باستخدام منهجيات تحديد المخاطر التقليدية مثل الزراعة أو الفحص المجهري. تسلسل الفطرية للبحث عن مناطق توفر طريقة محسنة تحديد المخاطر الفطرية وتسمح بفهم أفضل للتعرض الفطرية داخلي والمهنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1-إعداد العينات الهباء الجوي هي

ملاحظة: هو أخذ العينات الهباء الجوي هي عينة أيروسول مرحلتين إعصار الذي يجمع بيوايروسولس باستخدام أنابيب أخذ العينات اثنين وعامل تصفية تترافلوروايثيلين (PTFE).

  1. أمام الجمعية العامة، تفتيش دقيق العينات. فحص العينات للتأكد من أنه غير معطوب، مسامير كل في مكان ودافئ، وختم الشريط حول التماس يتكون من اثنين نصفين غير سليمة. فحص العينات الدائري التأكد من أنه ليس لديه أي النكات، الشقوق أو الدموع وأن لديها طلاء خفيف جداً للشحوم سيليكون.
    ملاحظة: يتضمن أخذ العينات تصفية PTFE 3 ميكرومتر 37 ملم في البوليسترين أو تصفية ثلاث قطع البولي بروبلين كاسيت.
    1. تجميع كاسيت عامل تصفية حسب وضع السليلوز أو لوحة دعم مرشح البلاستيك (المضمنة مع عوامل التصفية) على سطح الشبكية قطعة قاعدة (انظر الشكل 1). استخدام الملقط تصفية لوضع عامل التصفية على رأس لوحة دعم مرشح مع الجانب جمع مواجها لأعلى.
    2. ختم شرائط عامل التصفية استخدام صحفي اليدوي أو هوائي. إغلاق اليد سوف تسمح للهواء تسرب حول المرشح وتقليل كفاءة جمع. إدراج قطعة على شكل حلقة (قلنسوة التمديد)، واستخدام الصحافة لدفعها إلى أسفل محكم وبشكل متساو. اضغط لأسفل قلنسوة التمديد على عامل التصفية محكم ما يكفي لضمان عدم تسرب الهواء حول عامل التصفية.
      ملاحظة: لا يستخدم أثناء أخذ العينات قطعة أكبر من الكاسيت لكن يجب حفظه لتغطية التصفية مجرد الانتهاء من أخذ العينات.
    3. تناسب كاسيت المجتمعون على الجزء العلوي من أخذ العينات، ودفعها إلى أسفل قدر الإمكان. لف قطعة من الشريط 19 مم (3/4 بوصة) حول الجزء الخارجي من كاسيت تصفية وأخذ العينات لعقد تصفية الكاسيت في مكان والعمل كختم النسخ احتياطي لمنع تسرب.
    4. برغي كل أنبوب محكم وتام في العينات حتى أنها قيعان والتفاف ختم الشريط حول كل أنبوبة بمثابة ختم ثانوية ضد تسرب.
      ملاحظة: الأنبوب الأول، أنبوب البولي بروبلين 15 مل، تجمع جزيئات غير للاستنشاق مع قطر الأيرودينامية > 4 ميكرومتر. الأنبوب الثاني، أنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبلين 1.5 مل، تجمع جزيئات للاستنشاق بين 1 و 4 ميكرومتر. الجسيمات الصغيرة المتبقية، < 1 ميكرومتر، تجمع على PTFE تصفية (انظر الشكل 2).
  2. معايرة تدفق الهواء من خلال أخذ العينات هي مع جرة معايرة قبل كل استخدام الاختلافات في عوامل التصفية والعينات سوف تتسبب في تدفق الهواء تختلف.
    1. لاستخدام جرة معايرة، إدراج تركيب نظام للجرة إلى الجزء العلوي من كاسيت تصفية ومكان أخذ العينات في الجرة، وختم الجرة.
    2. قم بتوصيل جرة معايرة مقياس تدفق معايرة ومضخة أخذ العينات. تحويل مقياس تدفق والسماح لها بالاحماء لبضع دقائق. علما بأن مقياس تدفق دائماً يجب أن يكون لديك عامل تصفية تعلق على مدخل لها لتجنب تلويث مقياس تدفق وأخذ العينات.
    3. تشغيل المضخة أخذ العينات، والسماح ليتم تشغيله لبضع دقائق للاحماء، وتحقيق الاستقرار.
    4. ضبط المضخة لتعيين معدل التدفق الصحيح في 3.5 لتر في الدقيقة.
      ملاحظة: يتم تعيين معدل التدفق لعينات الأيروسول هي عادة إلى 3.5 لتر في الدقيقة. هذا معدل التدفق، وأخذ العينات يتطابق مع معايير إيزو ACGIH/الجسيمات للاستنشاق أخذ العينات16. يمكن استخدام معدلات التدفق الأخرى إذا قطع مختلفة الأحجام المرجوة أو تقليل مستوى الضوضاء، إلا أن تدرك أن إذا كان يتم استخدام معدل تدفق مختلفة، ثم أخذ العينات سوف لم تعد مطابقة للمعايير للاستنشاق أخذ العينات.
    5. عند الانتهاء من المعايرة، وإيقاف تشغيل المضخة ومقياس تدفق.

2. أخذ العينات الهباء الجوي ثابتة وشخصية

  1. إعداد العينات الهباء الجوي هي أما العينات المجال الشخصي أو ثابتة.
    ملاحظة: أخذ العينات ثابت يشير إلى استخدام العينات الهباء الجوي في حين أنها موصولة إلى ترايبود أو أي جهاز آخر عقد (انظر الشكل 3)، كما مقابل الشخصي أخذ العينات عند أخذ العينات ومضخة هي التي شنت على الشخص قيد الدراسة (انظر الشكل 4).
    1. لأخذ العينات من منطقة ثابتة، تبقى تجري دراسة العينات أقرب وقت ممكن إلى منطقة محددة. الاحتفاظ العينات بعيداً عن مداخل الهواء ومداخل الغرف والأماكن التي قد تكون في مسار تدفق الهواء.
      ملاحظة: تركيزات الهباء الجوي يمكن أن تختلف اختلافاً كبيرا حتى عبر مسافات قصيرة، لا سيما إذا كان مصدر الهباء الجوي في الغرفة17.
    2. لأخذ العينات الشخصية، إعداد العينات داخل منطقة التنفس للشخص. إرفاق العينات بطيه صدر السترة أو الكتف أو الصدر، ووضع مضخة أخذ العينات في وسطه أو في حقيبة تحمل على ظهر.
      ملاحظة: منطقة التنفس عادة يفترض أن يكون نصف الكرة 30 سم المحيطة بانف الشخص التي استقيت منها غالبية الهواء خلال استنشاق17.
  2. تأكد من أن العينات الأنابيب من الواضح جيدا من مداخل العينات وأن لا شيء هو إعاقة المداخل أو تتداخل مع تدفق الهواء إلى العينات. لا يجب أخذ العينات أنابيب مقروص أو متلوي. سوف يتسبب أي انسداد المضخة لإيقاف.
  3. قم بتشغيل المضخات. بعد دقيقة أو دقيقتين، تحقق إذا ما زالت تشغل المضخات.
    ملاحظة: الجوية إجراء أخذ العينات لفترات زمنية تتراوح بين أقل من 10 دقيقة لنوبة عمل كامل ح 8، تبعاً للبيئة10،،من1819. النتائج المعروضة في الشكل 6 هي الممثل لمدة 60 دقيقة أخذ العينات في بيئة داخلية.
  4. بعد الانتهاء من أخذ عينات الهواء، جمع عينة أنابيب والتصفية. إزالة الشريط الختم وفك الأنابيب، وكاب لهم. مكان قطعة ثالثة من كاسيت تصفية أكثر من عامل التصفية. تخزين العينات في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للمعالجة.

3-استخراج الحمض النووي من عينات من الهواء

  1. استخراج الحمض النووي (جدنا) من كل مرحلة من العينات هي BC251. معالجة الهواء أخذ عينات من أنابيب جمع وتصفية كل على حدة للسماح بتحديد الهباء الميكروبية للاستنشاق وغير للاستنشاق في العينة.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، ثلاث مراحل يمكن جنبا إلى جنب واستخراج إذا كانت العدوى عينة صغيرة جداً.
    1. في الفئة الثانية السلامة البيولوجية مجلس الوزراء أو الاندفاق الصفحي نظيف مقاعد البدلاء، أسيبتيكالي إزالة عامل التصفية. مسح كاسيت أخذ العينات أسفل استخدام الإيثانول 70% ونقب فتح كاسيت أخذ العينات باستخدام أداة فتح كاسيت. استخدام رافعة عامل تصفية لدفع لوحة تصفية ودعم صعودا. فهم عامل التصفية باستخدام الملقط التصفية ووضعه في طبق بتري معقم. قطع عامل التصفية إلى 6 قطع متساوية ووضعها في أنبوب 2 مل المعززة التي تحتوي على 300 ملغ الزجاج الخرز (0.2-0.5 مم).
    2. ضع الأنبوب الذي يحتوي على عامل التصفية في النتروجين السائل لمدة 30 ق ثم ضعه مباشرة في الخالطون طاحونة حبة مبلغ 4.5 m/s لمدة 30 ثانية.
    3. كرر الخطوة 3.1.2 مرة أو مرتين حتى يتم تمزيقه عامل التصفية. قد تظل القطع الصغيرة من تصفية سليمة. إضافة 0.5 مل من تحلل المخزن المؤقت (م 4 اليوريا، 200 ملم تريس، 20 مم كلوريد الصوديوم، حمض الإيثيلين 200 ملم (يدتا)، الرقم الهيدروجيني 7.4).
    4. أضف 0.3 مل من تحلل المخزن المؤقت إلى 15 مل وأنابيب عينات الهواء 1.5 مل. دوامة الأنبوب ل 10-15 ثانية بينما تستقيم وثم آخر 10-15 ثانية مقلوب. نقل محتويات كل أنبوبة لأنابيب 2 مل المعززة التي تحتوي على 300 ملغ الزجاج الخرز.
      ملاحظة: معظم المواد التي تم جمعها في كل أنبوب أخذ العينات سوف تتراكم قرب الجزء العلوي من الأنبوب.
    5. معالجة جميع الأنابيب في الخالطون طاحونة حبة في 4.5 m/s s والطرد المركزي 30 منهم في 20,000 x ز لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية. نقل سوبيرناتانتس إلى أنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل والطرد المركزي هذه الأنابيب في 20,000 ز x مرة أخرى لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية. كرر هذه الخطوة.
  2. إضافة 30 ميليلتر من تحلل كاشف (انظر الجدول للمواد) لكل أنبوب واحتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. إضافة 0.2 مل من المخزن المؤقت ملزم (اليوريا 10 م، م 6 جوانيداين-HCl، 10 مم تريس-HCl، 20% X-100 تريتون، pH 4.4) والبروتيناز ك (100 ميكروغرام/مل) كل أنبوب واحتضان هذه الأنابيب في 70 درجة مئوية للحد الأدنى 10 إضافة 100 ميليلتر من الايزوبروبانول لكل أنبوبة.
  4. نقل الحلول استخراج إلى أنابيب تصفية ألياف زجاجية (700 قدرة ميليلتر) توضع في أنابيب جمع 2 مل والطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب جمع 2 مل جديدة.
  5. إضافة 0.5 مل من مثبطات إزالة المخزن المؤقت (م 5 جوانيداين-HCl، 20 مم تريس-HCl، الرقم الهيدروجيني 6-6، 38% إيثانول) لكل أنبوبة والطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب جمع 2 مل جديدة.
  6. إضافة 0.5 مل من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (20 ملم كلوريد الصوديوم، 2 مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، الإيثانول 80%) لكل أنبوبة والطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب جمع 2 مل جديدة. كرر هذه العملية.
  7. الطرد المركزي أنابيب جمع في 20,000 x ز مين 1 إضافية عند 22 درجة مئوية لإزالة أي المخزن المؤقت غسيل المتبقية. تجاهل هذه الأنابيب جمع ووضع أنابيب التصفية في أنابيب مجموعة جديدة.
  8. إضافة 100 ميليلتر الحارة (إيه سيفن زيرو درجة مئوية) شطف المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl، الأس الهيدروجيني 8.5) لكل أنبوبة واحتضانها لهم في درجة حرارة الغرفة لأجهزة الطرد المركزي كحد أدنى 1-2 أنابيب جمع في العاشر 20,000 ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية. نقل أنابيب التصفية فارغة إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل وإعادة تطبيق الواتس من الخطوة 3.8. احتضان في درجة حرارة الغرفة لدقيقة 1-2 أجهزة الطرد المركزي في 20,000 x ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام الواتيس فورا للخطوة 4 أو المخزنة في-20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. ويمكن تخزين الحمض النووي لتصل إلى سنة في-20 درجة مئوية. من المستحسن أن تخزين الحمض النووي في-80 درجة مئوية إذا كان مطلوباً التخزين على المدى الطويل.

4-تضخيم الحمض النووي ريبوسومال الفطرية

  1. استخدام كبسولة تفجير الفطرية العالمي لتضخيم في المناطق 1 و 2 من جدنا المستخرجة.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول، زوج التمهيدي Fun18Sf (-تجكتكتكاكجاجات 5 '-3')/ITS4R (-تككتككجكتاتجاتاتجك 5 '-3') تستخدم لتوفير تغطية أكبر من4،5مناطق للبحث عن. يمكن استخدام مجموعات التمهيدي الأخرى، مثل تلك التي تضخيم المناطق ITS1 أو ITS2 وحدها.
    1. إعداد بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) لكل عينة في ثلاث ردود ميليلتر 50 في أنابيب PCR معقم 0.5 مل أو لوحات بكر 96-جيدا كما يلي: 5 ميليلتر من قالب استخراج الحمض النووي (من الخطوة 3)، ميليلتر 33.3 بكر الصف المياه، 5 ميليلتر من المخزن المؤقت x PCR 10 ، 1.5 ميليلتر من 50 مم مجكل2، 1 ميليلتر من 10 مم 2 '--ديوكسينوكليوسيدي 5-تريفوسفاتيس، 0.5 ميليلتر من 20 ميكرومتر Fun18Sf التمهيدي إلى الأمام، 0.5 ميليلتر من 20 ميكرومتر ITS4R عكس التمهيدي وميليلتر 0.2 من بوليميراز الدنا بوليميراز.
    2. القيام بردود فعل في cycler حرارية: تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق؛ 6 دورات تمسخ (96 درجة مئوية، 30 s) الصلب (50 درجة مئوية، 45 ثانية) وتمديد التمهيدي (72 درجة مئوية، 3 دقيقة)؛ دورات 20 من تمسخ (96 درجة مئوية، 30 s)، انلينغ (50 درجة مئوية، 45 ثانية)، وتمديد التمهيدي (72 درجة مئوية، 1 دقيقة)؛ وإبقاء تمديد التمهيدي في 72 درجة مئوية للحد الأدنى 10 الخلائط رد الفعل عند 4 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
  2. الجمع بين ردود فعل بكر ثلاث نق باستخدام مجموعة أدوات تنقية غشاء مطاطي والسليكا.
    ملاحظة: يسمح هذا الإجراء لإزالة مكونات بكر (كبسولة تفجير، دنتبس، إنزيمات، أملاح، إلخ.) والملوثات الأخرى من الأعمال التحضيرية تضخيم الحمض النووي.
    1. الجمع بين ثلاثة ردود فعل لكل عينة (إجمالي 150 ميليلتر) في أنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل. إضافة ربط المخزن المؤقت (م 5 جوانيداين-HCl، الايزوبروبانول 30 ٪) في وحدة تخزين 5 x (750 ميليلتر) ومزيج الحل قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً عشر مرات.
    2. إضافة 450 ميليلتر من خليط تدور الأعمدة التي توضع في أنابيب جمع والطرد المركزي هذه الأنابيب في س 17,900 ز لتجاهل س. 30 في فيلتراتيس. إضافة ميليلتر 450 المتبقية على الأعمدة والطرد المركزي في س 17,900 ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.
      ملاحظة: تحتوي الأعمدة تدور على غشاء السليكا التي تسمح الامتزاز من الحمض النووي للأعمدة.
    3. تجاهل في فيلتراتيس وإضافة 750 المخزن المؤقت للغسيل ميليلتر (مم تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، الإيثانول 80% من 10) إلى أعمدة الدوران. الطرد المركزي الأعمدة في 17,900 س ز لمدة 30 ثانية عند 22 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه العملية إزالة الملوثات من تفاعل PCR المذكورة أعلاه.
    4. تجاهل filtrate والطرد المركزي الأعمدة الفارغة في 17,900 س ز لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية.
      ملاحظة: هذه الخطوة هي لإزالة أي بقايا الغسيل المخزن المؤقت التي قد تتداخل مع تطبيقات المتلقين للمعلومات.
    5. نقل أعمدة الدوران لأنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل. إضافة ميليلتر 45 شطف المخزن المؤقت (10 ملم تريس Cl، الأس الهيدروجيني 8.5) واحتضان هذه الأنابيب في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 أجهزة الطرد المركزي الأعمدة تدور في 17,900 س ز لمدة 1 دقيقة عند 22 درجة مئوية.
    6. استخدام الحمض النووي التيد فورا للخطوات 4 و 5 أو تخزينها في-20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين في أمبليكونس لتصل إلى سنة في-20 درجة مئوية. من المستحسن أن تخزين الحمض النووي في-80 درجة مئوية إذا كان مطلوباً التخزين على المدى الطويل.

5-التحقق من الفطرية التضخيم للبحث عن استخدام التفريد [اغروس] هلام

  1. المدلى بها 1% [اغروس] هلام يحتوي على 1 ميكروغرام/مل اثيديوم بروميد. يحل [اغروس] في الغليان 1 × العازلة تريس-خلات-يدتا (تاي). مرة واحدة وقد بردت الحل إلى حوالي 50 درجة مئوية، إضافة بروميد اثيديوم وتصب جل المدلى بها.
  2. بعد وقد وطدت [اغروس] هلام، تزج الهلام في 1 x TAE وإعداد أمبليكونس يتم تحميله على الهلام. إلى 8 ميليلتر من تضخيم الحمض النووي، إضافة 2 ميليلتر من 5 × تحميل المخزن المؤقت.
    ملاحظة: يمكن تعديلها تبعاً لتركيز المخزن المؤقت المطلوب تحميل وحدات التخزين هذه.
  3. تحميل العينات، كل ميليلتر 10، على جل جنبا إلى جنب مع سلم الحمض النووي للرجوع إليها في الحجم. تشغيل الهلام في 75 الخامس (6 V/سم) لما يقرب من 90 دقيقة وتصور العصابات، ينظر إليه عادة ما بين 750 والضوء 000 1 قاعدة زوج، باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (انظر الشكل 5).

6-تسلسل وتحليل الفطرية للبحث عن المناطق

  1. تسلسل جدنا المستخرج أو تضخيم المناطق عن الفطرية وتحليل تسلسل استخدام الأساليب الحالية والمناسبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويمكن تقييم توزيع الأنواع داخل بيئة استخدام الوفرة النسبية عن طريق تحديد عدد الحيوانات المستنسخة أسامة كل تحديد في عينات الهواء. الرقم 6 مخطط كرونا تمثل الأنواع وه موضوعة داخل بيئة داخلية بعد 60 دقيقة لأخذ العينات من الهواء. ويمكن ملاحظة أن البيئة يحتوي على مجموعة متنوعة من الأنواع داخل يعج الفطرية الرئيسية اثنين، وأسكوميكوتا، وباسيديوميكوتا، فضلا عن الأنواع المنتمية للأسرة في اللغات زيجوميكوتا (ميكروسبوروس رهيزوبوس). الأساليب التقليدية لتقييم متحيزة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تحديد التنوع الفطرية داخل بيئة مهنية باستخدام النهج القائم على التسلسل تحسن تقييم المخاطر الفطرية بتحديد الهوية والتعرض. وقد يسمح باستخدام هذا النهج للكشف عن العديد من الأنواع الفطرية الإضافية التي غالباً ما لا يتم الكشف عن استخدام الثقافة أو أساليب التقييم القائم على الفحص المجهري. طريقة لأخذ العينات بيوايروسولس من البيئات المهنية وداخلي واستخراج الحمض النووي من عينات الهواء للتضخيم وتسلسل يرد هنا. قرارات بشأن التنوع الفطرية باستخدام هذه الأساليب يعتمد اعتماداً كبيرا على: استخراج الحمض النووي (1) ناجحة وكاملة من الهواء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

النتائج والاستنتاجات الواردة في هذا التقرير هي آراء المؤلفين ولا تمثل بالضرورة الموقف الرسمي للمعهد الوطني للسلامة المهنية والصحية، ومراكز "مكافحة الأمراض" والوقاية.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل جزئيا اتفاق مشترك بين الوكالات هي بين نيس (AES12007001-1-0-6).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
NIOSH BC251 جهاز أخذ عينات الإعصار الحيويNIOSHBC251جهاز أخذ العينات NIOSH غير متاح تجاريا بعد. يرجى الاتصال ب William Lindsley ، دكتوراه (wlindsley@cdc.gov) للحصول على معلومات حول الحصول على أنابيب
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة NIOSH مع أغطية لولبيةFisher Scientific02-681-3731.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة من مادة البولي بروبيلين لأخذ عينات الهواء ؛ يجب أن يتطابق الخيوط العلوية اللولبية مع خيوط جهاز أخذ العينات NIOSH
Falcon 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطيةCorning35209615 مل لأخذ عينات الهواء
شريط فينيل غرفة نظيفة ، سهل الإزالة ، شريط مانع للتسرب بعرض 1/4 بوصةMcMaster-Carr76505A1
تصفية ، ستايرين شفاف ، 37 ممSKC Inc.225-3LF3 قطع (بدون فلتر). يحتوي على: قاعدة كاسيت ، قلنسوة تمديد ، غطاء كاسيت ومقابس مدخل / مخرج مرشحات
غشاء فلوروبور كارهة للماء PTFE ، 3.0 وميكرو ؛ م ، 37 ممEMD MilliporeFSLW03700يحتوي على: 37 مم ، 3.0 وميكرو ؛ m مرشحات PTFE ومنصات الدعم
ملقط مرشح فيشربراندفيشر ساينتفيك09-753-50ملقط مرشح
نموذج 502 دقيق PanaPressPanaVise502مكبس كاسيت هوائي مصنوع من مكبس الشجرة الدقيق
سكوتش سوبر 33 + شريط كهربائي من الفينيلMcMaster-Carr76455A21شريط 19 مم
معايرة متعددة الأغراض ،SKC كبير شركه.225-112جرة معايرة
PCXR4 Sample PumpSKC Inc.224-PCXR4مضخة أخذ العينات
مقياس الجريان الكتلي 4140TSI Inc.4140مقياس التدفق
Roche High Pure PCR Template KitRoche Diagnostics11796828001Kit المستخدمة لاستخراج الحمض النووي الجيني. يحتوي على: عازلة التحلل ، المخزن المؤقت الملزمة ، البروتيناز K ، المخزن المؤقت لإزالة المثبطات ، عازلة الغسيل ، عازلة الميلون ، أنابيب تصفية الألياف الزجاجية وأنابيب تجميع 2 مل
فيشربراند 2 مل أنابيب غطاء لولبي من مادة البولي بروبيلين المقواة مع أغطيةفيشر ساينتفيك153401622 مل أنابيب مقواة لتجانس الخرزة
الخرز الزجاجي ، غسول بالحمض ، 212-300 وميكرو ؛ مSigma-AldrichG1277الخرز الزجاجي
مطحنة حبة فيشر العلمية 24 الخالطفيشر Scientific15-340-163مخالط الخرزة
كاشف تحلل الخلايا البائية CelLytic ، كاشفالتحلل10X Sigma-AldrichC8740
Platinum Taq polymeraseInvitrogen10966-018يحتوي على: بوليميراز البلاتين Taq ، 10X عازلة PCR (بدون MgCl2) ، 50 ملي مولار MgCl2 ، موسع KB
dNTP MixInvitrogen18427-08810 ملي مولار dNTP مزيج
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106Kit المستخدمة لتنقية الأمبليكونات الفطرية. يحتوي على: Buffer PB (مخزن مؤقت ملزم) ، Buffer PE (مخزن مؤقت للغسيل) ، Buffer EB (مخزن مؤقت للشطف) ، صبغة مؤشر الأس الهيدروجيني (اختياري) ، وصبغة تحميل GelPilot
Owl EasyCast Mini Gel Electrophorese SystemThermo FisherB1 أو B2
TrackIt 1 KB Plus DNA LadderThermo Fisher10488-085سلم الحمض النووي
شريط كاسيت أخذ العينات جرة Universal

المراجع

  1. Mendell, M. J., Mirer, A. G., Cheung, K., Tong, M., Douwes, J. Respiratory and allergic health effects of dampness, mold, and dampness-related agents: a review of the epidemiologic evidence. Environ Health Perspect. 119 (6), 748-756 (2011).
  2. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. 14 (4), 285-293 (2017).
  3. Green, B. J., Lemons, A. R., Park, Y., Cox-Ganser, J. M., Park, J. H. Assessment of fungal diversity in a water-damaged office building. J Occup Environ Hyg. , (2016).
  4. Pitkaranta, M., et al. Analysis of fungal flora in indoor dust by ribosomal DNA sequence analysis, quantitative PCR, and culture. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 233-244 (2008).
  5. Rittenour, W. R., et al. Internal transcribed spacer rRNA gene sequencing analysis of fungal diversity in Kansas City indoor environments. Environ Sci Process Impacts. 16 (1), 33-43 (2014).
  6. Martin, K. J., Rygiewicz, P. T. Fungal-specific PCR primers developed for analysis of the ITS region of environmental DNA extracts. BMC Microbiol. 5, 28(2005).
  7. Monard, C., Gantner, S., Stenlid, J. Utilizing ITS1 and ITS2 to study environmental fungal diversity using pyrosequencing. FEMS Microbiol Ecol. 84 (1), 165-175 (2013).
  8. Op De Beeck, M., Lievens, B., Busschaert, P., Declerck, S., Vangronsveld, J., Colpaert, J. V. Comparison and validation of some ITS primer pairs useful for fungal metabarcoding studies. PLoS One. 9 (6), e97629(2014).
  9. Toju, H., Tanabe, A. S., Yamamoto, S., Sato, H. High-coverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples. PLoS One. 7 (7), e40863(2012).
  10. Lemons, A. R., et al. Microbial rRNA sequencing analysis of evaporative cooler indoor environments located in the Great Basin Desert region of the United States. Environ Sci Process Impacts. , (2017).
  11. Cao, G., Noti, J. D., Blachere, F. M., Lindsley, W. G., Beezhold, D. H. Development of an improved methodology to detect infectious airborne influenza virus using the NIOSH bioaerosol sampler. J Environ Monit. 13 (12), 3321-3328 (2011).
  12. Soo, J. C., Lee, T., Kashon, M., Kusti, M., Harper, M. Quartz in coal dust deposited on internal surface of respirable size selective samplers. J Occup Environ Hyg. 11 (12), D215-D219 (2014).
  13. Wang, C. H., et al. Field evaluation of personal sampling methods for multiple bioaerosols. PLoS One. 10 (3), e0120308(2015).
  14. Lindsley, W. G., Schmechel, D., Chen, B. T. A two-stage cyclone using microcentrifuge tubes for personal bioaerosol sampling. J Environ Monit. 8 (11), 1136-1142 (2006).
  15. Rittenour, W. R., Park, J. H., Cox-Ganser, J. M., Beezhold, D. H., Green, B. J. Comparison of DNA extraction methodologies used for assessing fungal diversity via ITS sequencing. J Environ Monit. 14 (3), 766-774 (2012).
  16. ACGIH. Documentation of the threshold limit values and biological exposure indices. Appendix C: Particle size-selective sampling criteria for airborne particulate matter. , 7th ed, American Conference of Governmental Industrial Hygienists. (2001).
  17. Rodes, C. E., Thornburg, J. W. Aerosols handbook: measurement, dosimetry, and health effects. Ruzer, L. S., Harley, N. H. , CRC Press. (2005).
  18. Broadwater, K., et al. Investigating a persistent odor at an aircraft seat manufacturer. J Occup Environ Hyg. 13 (10), D159-D165 (2016).
  19. Couch, J., et al. Health Hazard Evaluation Program: Evaluation of Potential Hazards during Harvesting and Processing Cannabis at an Outdoor Organic Farm. Report No. 2015-0111-3271. , U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, National Institute for Occupational Safety and Health. Cincinatti, OH. (2017).
  20. Feinstein, L. M., Sul, W. J., Blackwood, C. B. Assessment of bias associated with incomplete extraction of microbial DNA from soil. Appl Environ Microbiol. 75 (16), 5428-5433 (2009).
  21. Keswani, J., Kashon, M. L., Chen, B. T. Evaluation of interference to conventional and real-time PCR for detection and quantification of fungi in dust. J Environ Monit. 7 (4), 311-318 (2005).
  22. Bellemain, E., Carlsen, T., Brochmann, C., Coissac, E., Taberlet, P., Kauserud, H. ITS as an environmental DNA barcode for fungi: an in silico approach reveals potential PCR biases. BMC Microbiol. 10, 189(2010).
  23. Farrelly, V., Rainey, F. A., Stackebrandt, E. Effect of genome size and rrn gene copy number on PCR amplification of 16S rRNA genes from a mixture of bacterial species. Appl Environ Microbiol. 61 (7), 2798-2801 (1995).
  24. Vesper, S., et al. Development of an Environmental Relative Moldiness index for US homes. J Occup Environ Med. 49 (8), 829-833 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NIOSH ITS

مقالات ذات صلة