مقالة منهجية

أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

DOI:

10.3791/56742

⸱

يناير 12, 2018

 ,  , 
1Centre for Regenerative Medicine, Department of Life Sciences, University of Modena and Reggio Emilia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحقيق إدماج مورثة فائدة مستقرة في الجينوم البشري نظام النائمة للتنظيم ترانسكريبتيونالي. وترد إعداد التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة، وتوصيل في المختبر للخلايا البشرية والمقايسة الجزيئية في الخلايا ترانسدوسيد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينقول النائمة (س. ب) نظام تكامل غير فيروسية مع أثبتت فعاليتها لنقل الجينات والجينوم الوظيفي. لتحسين إليه ينقول SB، يعملون ترانسبوساسي مفرط التنظيم ترانسكريبتيونالي (SB100X)، والمستندة إلى T2 ينقول. عادة، يتم توفير ترانسبوساسي وينقول عابر من تعداء بلازميد والتعبير SB100X تحركها مروج تأسيسي. وهنا، يمكننا وصف طريقة فعالة لتوصيل المكونات بينالي الشارقة إلى الخلايا البشرية التي مقاومة للعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية تعداء، التحكم في التعبير SB100X وإدماج [ستبلى] مورثة للفائدة (غوي) من خلال SB "قص ولصق" إليه. يتم التعبير عن ترانسبوساسي مفرط رقابة مشددة من جانب النظام على تيت، تستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير الجيني منذ عام 1992. الجينات للاهتمام هو محاط يكرر مقلوب (الأشعة تحت الحمراء) من ينقول T2. يتم حزم كلا العنصرين بينالي الشارقة في التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة عابر تنتج في الخلايا HEK293T. الخلايا البشرية، أما من خطوط الخلايا أو الخلايا الأولية من الأنسجة البشرية، في المختبر ترانسدوسيد عابر مع النواقل الفيروسية. عند إضافة الدوكسي (دوكس، التتراسيكلين التناظرية) في المتوسط الثقافة، يقاس الضبط الدقيق للتعبير ترانسبوساسي والنتائج في على تكامل طويلة الأمد للجينات للفائدة في جينوم الخلايا المعالجة. هذا الأسلوب يتسم بالكفاءة وتنطبق على خط الخلية (مثل خلايا هيلا) والخلايا الأولية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية البشرية)، ويمثل بالتالي أداة قيمة للهندسة الوراثية ونقل الجينات العلاجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم بالفعل استخدام ترانسبوساسي SB100X مفرط بالإضافة إلى ينقول المستندة إلى T2 في الجينات السريرية العلاج التطبيقات1،2،3، الجينوم التعديلات4،5، و المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية) إعادة برمجة6،7. عادة، مكونات SB توفرها عابر تعداء بلازميد ومروج تأسيسي قوية التعبير عن ترانسبوساسي محركات الأقراص. ومع ذلك، يظل تقديم النظام المكون الثاني على الرغم من تحسين أساليب جديدة من تعداء، تحديا للعديد من التطبيقات. وهكذا، قد وضع بروتوكول جديد بإيصال اهتماما متزايداً. بالإضافة إلى طرق تعداء بلازميد8 ومرناً9، الفيروسية التسليم استناداً إلى أدينوفيرال10،11، مرتبطة بالغدد الفيروسية (إف)12، باكولوفيروس13، جاماريتروفيرال14 وناقلات لينتيفيرال15 وقد اقترح في الماضي. جدير بالذكر أن نظام الاختيار يجب أن تضمن عملية تسليم عابر لمكونات SB دون التكامل بين النواقل الفيروسية. ومع ذلك، التعبير التأسيسي من ترانسبوساسي يثير الشواغل المتعلقة بالسلامة بسبب خطر ريهوبينج لا يمكن السيطرة عليها ينقول.

ولذلك، تنظيم النسخي SB100X بنظام على تيت المكرر هو التحدي الأول. مروج تيت مراعية معدلة، التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال المروج المتقدمة الحد الأدنى الفيروس المضخم للخلايا (CMV) الأصلي مع المروج (-81) الحد الأدنى من الجينات تيميديني كيناز (المعارف التقليدية) من فيروس "الحلأ البسيط"-1 (هامبورغ-1)16، هو استنساخ المنبع كدنا SB100X (pTetOTKSB100X). تحور عكس-التتراسيكلين-ترانساكتيفاتور rtTA2s-أعرب عن M217 تحت سيطرة قوي التأسيسي المروج (المروج فوسفوجليسيراتي، PGK) المستنسخة في بلازميد مختلفة (بتشل-PGKrtTA2S-M2). عند إضافة إلى متوسط الثقافة، يربط دوكس rtTA2s-المغير M2 والحبال المروج تيت المعقدة، أو الناتجة عن ذلك في شكل محكم التنظيم الاستقراء من التعبير SB100X18.

التحدي الرئيسي الثاني ينشأ من تعداء الكفاءة البشرية الابتدائية الخلايا بالعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية. لكفاءة تسليم ترانسبوساسي في الخلايا البشرية مقاومة تعداء، SB100X و rtTA2s-شرائط التعبير M2 يتم حزم في اثنين التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة (إيدلفس)19: إيدلفتكسب و IDLVrtTA2s- M2. يتم إنتاج النواقل الفيروسية عابر كناقلات الجيل الثالث في الخلايا HEK293T20 وبسيودوتيبيد مع بروتين سكري ز فيروس التهاب الفم فيسسيكولار (منظمة-ز)، الذي يمنح طائفة عريضة من العدوى. ناقل الجزيئات هي تتركز تنبيذ فائق ومعاير بفيروس نقص المناعة البشرية-1 "اسكت" إيمونوكابتوري p24. جسيمات ناقلات الرصاصية مع بوليبريني ترانسدوسي خطوط الخلايا والخلايا الأولية، وهي المحتضنة مع الخلايا المستهدفة في وجود أو عدم وجود دوكس. تفعيل مدمني المخدرات من التعبير SB100X في الخلايا ترانسدوسيد تقاس بكمية RT-PCR (قرة-PCR)18.

تحويل غوي (مثلاً، أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) إلى جينوم الخلية المستهدفة بمجرد يتجلى التعبير ينظم تيت SB100X، يتبع الأحداث الجزيئية وضوح المخططة ب باك وميكيلسن21. ثالث إيدلف ناقلات تحمل كاسيت تعبير لحكومة الهند استنساخ بين مصلحة الضرائب T2-ينقول (IDLVT2) وقد شيدت وتعبئتها كما هو مذكور أعلاه. وأخيراً، يمكن استخدام ثلاث ناقلات إيدلف كفاءة ترانسدوسي الخلايا البشرية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية) في المختبر وإدماج غوي حضور الدوكسيسيكلين18.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-والبلازميدات المستخدمة

ملاحظة: بلازميد بتشل-PGKrtTA2S-M2 كان يرجى قدمها الأستاذ زابافيجنا (جامعة مودينا وريدجو إميليا، مودينا، إيطاليا). بلازميد pCMVSB100X تحمل الترميز تسلسل ترانسبوساسي مفرط وبلازميد ينقول pT2/البوسنة والهرسك قدمت تفضلت بزين Z. إيفيكس (معهد بول ايرليك، أنغن، ألمانيا)، والأستاذ الدكتور زهير إيزفاك (ماكس ديلبروك مركز "الطب الجزيئي"، برلين، ألمانيا).

  1. لجميع أشكال الاستنساخ في الإشريكيّة القولونية (كولاي)، اتباع استراتيجية الاستنساخ لإجراءات الاختيار وإنزيم التقييد أو [بكر] تضخيم الجزء استنساخ.
    ملاحظة: يلخص الجدول 1 جميع والبلازميدات المستخدمة في هذا البروتوكول. وتقدم وصفاً والمراجع لكل بلازميد.

2. إنتاج النواقل الفيروسية

ملاحظة: يتم إنتاج جميع ناقلات المرض الفيروسي في غطاء واقية على مستوى احتواء BSL2 السلامة الأحيائية، وفقا للقواعد المؤسسية والأنظمة.

  1. وتستكمل الثقافة ملتصقة HEK293T الخلايا في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو مع 10% هيكلوني المصل و 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين الجلوتامين 2 مم.
  2. اليوم 0: إعداد خمس إعداد لوحات/الفيروسية 15 سم والبذور 5.5x106 خلايا في 30 مل الوسط.
  3. يوم 1: تعداء
    1. قبل البدء تعداء، إعداد 100 مل من المحلول الملحي المخزن المؤقت x HEPES 2 (HBS):
      كلوريد الصوديوم (م 5) 5.6 مل
      حبيس (1 م) مل 10.0
      غ2هبو4 (0.5 م) 0.3 مل
      تعقيم المياه مل 84.1
      ضبط للأس الهيدروجيني 7.1 مع 37% HCl.
      ملاحظة: يمكن تخزين 2 x HBS في 4 درجات مئوية. درجة حموضة دقيق أمر بالغ الأهمية لكفاءة تعداء. مجموعة الرقم الهيدروجيني الأمثل هو 7.10 إلى 7.12.
    2. إزالة المتوسطة وإضافة 22.5 مل/طبق من ح 4 متوسطة جديدة قبل تعداء.
    3. ترانسفيكت الخلايا HEK293T مع بلازميد نقل بلازميد التغليف pMD.Lg/pRRE.D64VInt، بلازميد المغلف-ترميز pMD2.G وبرسف Rev (الجدول 1) وفقا للكمية/اللوحة التالية:
      نقل ميكروغرام بلازميد 25.00
      pMD.Lg/pRRE.D64VInt 16.25 ميكروغرام
      pMD2.G 8.75 مكغ
      برسف-القس 6.25 ميكروغرام
      ملاحظة: يتم إعداد بلازميد السلطات الوطنية المعينة وفقا لبروتوكول CsCl الموصوفة من مانياتس22 ، أو باستخدام مجموعة مواد تنقية بلازميد خالية من الذيفان.
      1. ريسوسبيند 56.25 ميكروغرام للحمض النووي (مزيج البلازميدات 4) في 1.125 مل الماء المعقم وإضافة 125 ميليلتر من 2.5 م كاكل2 (الحل A).
      2. إضافة مل 1.250 من 2 x HBS إلى أنبوب الطرد مركزي مخروطية عقيمة 15 مل (حل ب).
      3. إضافة الحل (مل 1.250) ب (1.250 مل) دروبويسي بينما محتدما مع 1 أو 2 مل ماصة (حل تعداء، إجمالي حجم مل 2.500).
      4. احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
      5. استخدام ميكروبيبيتي P1000، توزيع كل من حل تعداء (2.500 مل) أحادي الطبقة خلية دروبويسي.
    4. تبني بين عشية وضحاها في حاضنة ثقافة خلية على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.
  4. يوم 2: إزالة المتوسطة وإضافة 15 مل متوسطة جديدة (راجع الخطوة 2، 1).
  5. يوم 3: تجميع وتركيز المادة التي تحتوي على الجسيمات لينتيفيرال طافية.
    1. جمع المادة طافية (~ 70 مل) من كل (n = 5) تصفية transfected خلايا لوحات، من خلال 0.45 ميكرومتر بس تصفية وتعبئة أنابيب بوليالومير 2 (1 بوصة × 3.5 بوصة)/الفيروسية إعداد.
    2. تركز الجزيئات متجه تنبيذ فائق في 106,000 س ز ح 2.5، عند 15 درجة مئوية مع الفرامل.
    3. فورا بعد وقف تنبيذ فائق (لتجنب استثارة بيليه في الأنبوب)، بلطف صب المادة طافية في حاوية تحتوي على 10 ٪ التبييض وتعليق الكريات مرئية بالكاد 2 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x (+ 1% جيش صرب البوسنة). هذا أمر طبيعي كما بيليه واضحة وصغيرة جداً. استخدام ناقل مركزة طازجة أو الكوة وتخزين الاستعدادات الفيروسية في-80 درجة مئوية.
      تنبيه: يحتوي المادة طافية على جزيئات لينتيفيرال التي يجب أن تكون أبيض دقيق قبل التخلص من النفايات واقية.
  6. إلى تيتراتي إعداد ناقلات الأمراض الفيروسية، استخدام أدوات إيمونوكابتوري p24 "اسكت" فيروس نقص المناعة البشرية-1 وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    ملاحظة: لتوحيد إنتاج النواقل الفيروسية، ويمكن استخدام الكواشف المستندة إلى الدهنية. ومع ذلك عيار النواقل الفيروسية يعتمد اعتماداً كبيرا على كفاءة تعداء ونقاء بلازميد الحمض النووي.

3-توصيل خطوط الخلايا البشرية (مثل خلايا هيلا)

ملاحظة: خلايا هيلا تستزرع في متوسطة النسر معدلة دولبيكو لتستكمل مع مصل العجل الجنين 10% و 100 يو/مليلتر البنسلين-ستربتوميسين الجلوتامين 2 مم. ويلخص الجدول 1 جميع موجهات المستخدمة في هذا البروتوكول. ويرد وصف لكل ناقل. توصيل خلايا هيلا يسمح تحقق تنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي في الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين. قد تكون متعلقة اختلاف جرعة إيدلف المتجهات المعايرة الجسيمات ونوع الخلية الهدف.

  1. اليوم 0: البذور 2 × 105 خلايا في 3 مل متوسط لكل بئر من لوحة 6-جيدا. إعداد 4 آبار.
  2. يوم 1: توصيل خلايا هيلا.
    1. لكل حالة، وتمييع ناقلات لينتيفيرال إلى وحدة تخزين نهائي لمتوسطة 1 مل (انظر الملاحظة أعلاه) حضور 10 ميكروليتر من بوليبريني (التركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل):
      تمييع جيدا #1: يسخرون من الخلايا ترانسدوسيد (مراقبة سلبية).
      تمييع جيدا #2: ناقل إيدلفتكسب (2,600 نانوغرام p24).
      تمييع لآبار #3، #4: ناقل إيدلفتكسب (2,600 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2s-ناقلات M2 (9,600 نانوغرام p24).
    2. إزالة المتوسطة من كل بئر حيث كانت خلايا هيلا مطلي في اليوم 0 وإضافة تخفيف لينتيفيرال متجه إلى المقابلة جيدا.
    3. سبينوكولاتي لوحة 6-جيدا في غ س 754 لمدة 45 دقيقة في 20-25 درجة مئوية، وثم نقل لوحة 6-جيدا إلى خلية ثقافة حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    4. بعد ح 6، استبدال ناقلات تحتوي على المتوسط بمتوسطة جديدة في جميع الآبار وإضافة الدوكسي إلى 1 ميكرومتر في شكل جيد #4. وضع اللوحة حاضنة ثقافة خلية في 37 درجة مئوية ح 48.
  3. يوم 3: إعداد بيليه خلية لاستخراج الحمض النووي الريبي.
    1. قبل فصل الخلايا، تعد حلاً عامل التربسين (س 1):
      2.5% التربسين (10 x) مل 5.0
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 5 ملم) 0.5 مل
      1 × مل 44.5 برنامج تلفزيوني
    2. حل العامل التربسين الحارة في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تخزين التربسين العامل الحل عند 4 درجة مئوية.
    3. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x. إضافة 0.5 مل حل عملي التربسين قبل حرارة 37 درجة مئوية لكل بئر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة 7 (في حاضنة ثقافة خلية).
    4. بعد الاحتضان، إضافة 0.5 مل المحتوية على مصل متوسطة لكل بئر لإلغاء تنشيط التربسين وجمع الخلايا في أنبوب الطرد مركزي. أشطف جيدا مرة واحدة مع 3 مل من س 1 برنامج تلفزيوني كل، والطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 240 x ز.
    5. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 240 x ز وتجاهل المادة طافية. استخدام الكريات الخلية الطازجة التي يتم جمعها أو تخزينها في-80 درجة مئوية. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الكريات لأداء شبه كمي RT-PCR (راجع الخطوة 6).

4-توصيل الخلايا الأولية البشرية (على سبيل المثال، الكيراتينيه)

ملاحظة: يتم المصنف الكيراتينيه الأولية البشرية على دكت المشع 3T3-J2 الخلايا (وحدة تغذية طبقة)23، هدية نوع من براندون يان (لوزان، لوزان، سويسرا).

  1. تنمو خلايا الفأر السويسري 3T3-J2 في "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو وتستكمل مع المانحين 10% مصل البقر والبنسلين U/mL 50-ستربتوميسين الجلوتامين 4 مم (3T3 المتوسطة).
  2. تنمو الخلايا الكيراتينيه مطلي على خلايا المشع دكت 3T3-J2 في المتوسط كفاد و "تعديل النسر المتوسطة" دولبيكو و F12 وسائط مزيج في لحم الخنزير (3:1) تحتوي على مصل بقرى الجنين (10%)، الجلوتامين (2%) الأنسولين (5 ميكروغرام/مل)، (الأدنين، البنسلين-ستربتوميسين (1%) 0.18 مم)، الهيدروكورتيزون (0.4 ميكروغرام/مل)، والسمية الكوليرا (0.1 nM)، و triiodothyronine (2 نانومتر).
  3. اليوم 0: البذور 3 × 105 دكت المشع الخلايا 3T3-J2، تضعف سابقا في 3T3 المتوسطة إلى تركيز نهائي 1 × 105 خلايا/مل، في كل من لوحة 6-جيدا جيدا. إعداد الآبار 9.
  4. يوم 1: توصيل من الخلايا الكيراتينيه الأولية
    ملاحظة: توصيل من الخلايا الكيراتينيه يسمح التحديد الكمي لتنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي في الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين (بواسطة qRT-PCR) والتحقق من التكامل من "حكومة الهند" (التجارة والنقل) في الخلايا الهدف (بواسطة سيتوفلوريميتريك تحليل).
    1. قبل فصل الخلايا، تعد الحل العامل التربسين:
      0.5% التربسين-يدتا (10 x) مل 5.0
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 5 ملم) 0.5 مل
      1 × مل 44.5 برنامج تلفزيوني
    2. حل العامل التربسين الحارة في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. تخزين التربسين العامل الحل عند 4 درجة مئوية.
    3. لفصل الخلايا الكيراتينيه سوبكونفلوينت في الثقافة، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1 x وإضافة 1 مل من محلول العامل التربسين المعالجون مسبقاً لكل بئر. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في حاضنة الثقافة الخلية.
    4. بعد الاحتضان، ريسوسبيند خلايا جيدا جيدا ونقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد مركزي الذي يحتوي على 2 مل المحتوية على مصل المتوسطة (إذا كان لا يزال يتم إرفاق العديد من الخلايا، احتضانها مين إضافية عند 37 درجة مئوية). أشطف جيدا مرة واحدة مع 3 مل 1 x متوسط جديدة أو برنامج تلفزيوني كل وإضافة الحل شطف الأنبوب الطرد المركزي مع تعليق خلية.
    5. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
    6. تغسل الخلايا مع 5 مل من 1 x PBS، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
    7. في أنبوب البولي بروبلين 15 مل، تمييع الكيراتينيه 1.6x105 في 1 مل متوسطة كفاد، تمييع واحدة لكل حالة.
    8. تمييع ناقلات لينتيفيرال في 1 مل متوسطة كفاد حضور 20 ميكروليتر من بوليبريني (تركيز النهائي 8 ميكروغرام/مل في وحدة تخزين نهائي لمل 2):
      تخفيف لآبار #1، #2، #3: يسخرون من الخلايا ترانسدوسيد (مراقبة سلبية دون المتجهات).
      تخفيف لآبار #4، #5: ناقل إيدلفتكسب (13,000 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2s-ناقلات M2 (48,000 نانوغرام p24).
      تخفيف لآبار #6، #7، #8، #9: ناقل إيدلفتكسب (13,000 نانوغرام p24) + IDLVrtTA2s-ناقلات M2 (48,000 نانوغرام p24) + ناقل IDLVT2 (9,160 نانوغرام p24).
    9. ترانسدوسي الخلايا في تعليق بإضافة كل تمييع متجه لينتيفيرال (1 مل) إلى تعليق keratinocyte المقابلة (الكيراتينيه 1.6x105 في 1 مل).
    10. إزالة المتوسطة من دكت المشع 3T3-J2 الخلايا المصنفة في اليوم 0 ولوحة ترانسدوسيد الكيراتينيه (1.6x105 الكيراتينيه في 2 مل) لهم. وبعد ترانسدوسينج فضلا عن المضي قدما في المرحلة التالية.
    11. احتضان عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ومن ثم نقل الخلايا إلى 37 درجة مئوية في ثقافة الخلية الحاضنة ح 6.
      ملاحظة: هل لا الكيراتينيه سبينوكولاتي الأولية، كما البقاء والانتشار ستتأثر بشدة.
    12. بعد ح 6، إضافة 1 مل متوسطة كفاد لكل بئر. أضف 1 ميكرومتر الدوكسي (تركيز النهائية) في الآبار #5 و #8 و #9. إعادة الخلايا إلى 37 درجة مئوية.
  5. يوم 2: استبدال المتوسطة كفاد مع 3 مل متوسطة كيه سي مع 10 نانوغرام/مل مماثلة.
  6. يوم 3: تريبسينيزي ويغسل خلايا من آبار #1 و #4 و 5 # كما هو موضح من قبل (انظر 4.4.1 إلى 4.4.6). تجميد الخلايا الكريات في-80 درجة مئوية لاستخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي لتحليل qRT PCR (راجع الخطوة 7).
  7. تريبسينيزي الخلايا من جيدا #2، #6 و #8 كما هو موضح في الخطوات 4.4.1 إلى 4.4.5 وإجراء تحليل سيتوفلوريميتريك للتعبير التجارة والنقل (راجع الخطوة 5).
  8. الحفاظ على الثقافة من آبار #3 و #7 و #9 دوبلينجس على الأقل 3-4، كافية لإضعاف الأمم المتحدة المتكاملة لناقلات الأمراض IDLVT2 (5 أيام للبشرية الكيراتينيه الابتدائي مطلي في تغذية طبقة).
  9. يوم 6: 5 أيام تقريبا وظيفة توصيل، تريبسينيزي الخلايا (انظر الخطوات 4.4.1 إلى 4.4.5) من آبار #3، #7، و 9 # لإجراء تحليل سيتوفلوريميتريك للتعبير بروتينات فلورية خضراء (راجع الخطوة 5).
    ملاحظة: تتأثر الكفاءة توقيت وتوصيل التجربة عالية حسب نوع الخلية الأولية وتقلب من العينات التي تم جمعها.

5-سيتوفلوريميتريك تحليل الكيراتينيه الابتدائية ترانسدوسيد

ملاحظة: سيتوميتير تدفق تكوينه باستخدام ليزر أزرق (488 نانومتر)، ليزر أحمر (633 نانومتر) ومرشحات ليعمل الكشف عن الأسفار التجارة والنقل، وآسيا والمحيط الهادئ (انظر الجدول المواد).

  1. لتمييز الخلايا الكيراتينيه من طبقة وحدة تغذية 3T3-J2، الماوس التسمية ترانسدوسيد الكيراتينيه منفصلة في يوم 3 ويوم 6 (انظر الخطوات 4.7 و 4-9) مع APC [مونوكلونل]-مترافق تغذية المضادة الأجسام المضادة.
    1. إعداد 4 مل من تلطيخ المخزن المؤقت لكل عينة:
      5% FBS 200 ميكروليتر
      500 مم يدتا (التركيز النهائي = 2.5 ملم) 20 ميكروليتر
      برنامج تلفزيوني 1 x 3780 ميكروليتر
    2. يغسل خلايا منفصلة مع 1 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية.
    3. في أنبوب لاقتناء التدفق الخلوي، ريسوسبيند 5 × 104 خلايا في 100 ميكروليتر من المخزن المؤقت المصبوغة وإضافة 2 ميكروليتر من الأجسام المضادة التغذية (01:50). يخلط جيدا واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد في الظلام.
    4. وبعد 30 دقيقة، يغسل مع 2 مل من تلطيخ المخزن المؤقت. الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 580 x ز وتجاهل المادة طافية. ريسوسبيند في 200 ميكروليتر من تلطيخ المخزن المؤقت.
    5. الحصول على إشارات APC والتجارة والنقل ب تحليل سيتوفلوريميتريك18. بروتينات فلورية خضراء+ خلية جزء صغير من السكان خلية الجيش الشعبي الكونغولي– تشير إلى الخلايا الكيراتينيه ترانسدوسيد.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، إصلاح العينة الملون قبل التدفق الخلوي مع بارافورمالدهيد 2% في برنامج تلفزيوني 1 x ومخزن في 4 درجات مئوية في الظلام حتى التشغيل.
  2. تحليل بيانات التدفق الخلوي بالتآمر النسبة بين النسبة المئوية للتجارة والنقل+الخلايا عند نقطة النهاية (5 أيام) والنسبة المئوية للتجارة والنقل+الخلايا أيام 2 وظيفة توصيل، تطبيع لمستوى المتبقية من IDLVT2-ترانسدوسيد الخلايا.

6-شبه كمي RT-PCR

ملاحظة: استخدم بكر cycler حرارية.

  1. استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من ترانسدوسيد أو التحكم في الخلايا باستخدام مجموعة مواد تنقية الجيش الملكي النيبالي، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن تخزين إجمالي الجيش الملكي النيبالي في-80 درجة مئوية.
  2. توليف كدنا في رد فعل 20 ميليلتر استخدام 100 نانوغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي، ومجموعة المنتسخة العكسية، وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
    ملاحظة: يمكن تخزين كدنا في-20 درجة مئوية.
  3. كبسولة تفجير تصميم محددة ل SB100X، rtTA2s-M2 وجابده (جين التدبير المنزلي).
    تصاميم مقترحة:
    SB الأمام التمهيدي:-جككاكتكاجكاجاجاج 5 '-3'
    SB عكس التمهيدي:-جتجتجاجاكككاتتجك 5 '-3'
    rtTAM2 إلى الأمام التمهيدي:-جاكجاكاجااكتكجكتك-3 5''
    rtTAM2 عكس التمهيدي:-تاكككججاجكاتجتكا 5 '-3'
    جابده الأمام التمهيدي:-جاككاكاجتككاتجككاتكاك 5 '-3'
    جابده عكس التمهيدي: 5 '–ككاككاكككتجتجكتجتاج–3'
  4. إجراء PCR في حجم رد نهائي من 50 ميليلتر. على وجه الخصوص، التجمع في كل أنبوبة بكر رد فعل التالي:
    كدنا (1:5 إضعاف) (من الخطوة 6، 2) 1.00 ميليلتر
    إلى الأمام التمهيدي (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
    عكس التمهيدي (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
    دنتبس (10 ميكرون الأسهم) 1.00 ميليلتر
    المخزن المؤقت (+ مجكل2) (الأسهم 10 x) 5.00 ميليلتر
    بوليميراز بوليميراز (5 أسهم يو/ميليلتر) 0.25 ميليلتر
    ميليلتر الماء المعقم 40.75
  5. استخدام البرنامج التالي من cycler الحرارية: 1 دورة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم تمضي إلى 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 58 درجة مئوية لمدة 30 s، و 72 درجة مئوية لمدة 30 ق لدورات SB100X 34، 32 دورات ل rtTA2s-M2 ، و 25 دورات جابده.
  6. إعداد 1% [اغروس] هلام. حل ز 1 من [اغروس] في 100 مل TBE 1 × (10 x الأسهم المخفف في الماء المعقم)، في الكأس أو قارورة. تذوب في فرن ميكروويف، يحوم كل دقيقة حتى يذوب تماما [اغروس]. بارد [اغروس] ذاب حتى تصل إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية، ثم قم بإضافة 5 ميليلتر اثيديوم بروميد (الأوراق المالية 10 ملغ/مل). صب ذاب [اغروس] في علبة جل المجتمعين بمشط، لصب جل.
  7. تحميل عينات (10 ميليلتر في كل) على [اغروس] هلام وإجراء التفريد.
  8. إذا رغبت في ذلك، الحصول على صورة جل وإجراء تحليل دينسيتوميتريك على عصابات PCR.

7-الكمية RT-PCR (قرة-PCR)

ملاحظة: يعمل "نظام الكشف عن تسلسل" التجارية. [بكر] كبسولة تفجير، ومسبار 6-كاربوكسيفلوريسسين (الاتحاد الماليزي) لنازعة 3-فوسفات جليسيرالديهيدي (جابده) يتم شراؤها تجارياً.

  1. للرجعية-النسخ، راجع الخطوة رقم 6، 2.
  2. استخدام البرمجيات لتصميم أجهزة الإشعال والتحقيق المحددة ل SB100X.
    التصميم المقترح:
    SB.2 إلى الأمام التمهيدي:-جاجاجككاكتجكتككااا 5 '-3'،
    SB.2 عكس التمهيدي:-ككككاتجتجكاجتجكا 5 '-3'
    التحقيق في الاتحاد الماليزي SB:-كاتاجااجككاجاكتاكج 5 '-3'
  3. إجراء PCR الوقت الحقيقي في لوحات 96-جيدا مع مزيج سيد بكر وخلط كبسولة تفجير + التحقيق، في حجم رد نهائي من 25 ميليلتر. على وجه الخصوص، النظر في الرد التالي لكل بئر:
    كدنا (01:10 إضعاف في الماء المعقم) 1.00 ميليلتر
    2 × ميليلتر ميكس ماجستير 12.50
    كبسولة تفجير + 20 x مسبار مزيج ميليلتر 1.25
    ميليلتر الماء المعقم 10.25
    ملاحظة: تنفيذ جميع ردود الفعل في ثلاث نسخ. لمنع الأخطاء بيبيتينج، إعداد مزيج لردود على الأقل n + 3 (دون كدنا). قاسمة استخدام ماصة متعددة القنوات.
  4. تشغيل PCR الوقت الحقيقي باستخدام البرنامج التالي: 1 دورة في 95 درجة مئوية عن 10 دقيقة، ثم دورات 40 من 95 درجة مئوية ل 15 s و 60 درجة مئوية 1 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
  5. تحليل بيانات qRT PCR بتطبيع التعبير النسبي (RQ القيمة) من SB100X إلى مستوى جابده من نفس العينة كدنا بالكميCT ΔΔ–2، استخدام برمجيات تحليل البيانات النموذجية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الإجراء المعروضة هنا، ثلاث ناقلات إيدلف تحمل مكونات بينالي الشارقة ينظم (SB100X، rtTA2S-ينقول M2 وبروتينات فلورية خضراء-T2) تم تعبئتها واستخدامها لكفاءة تقديم وتنظيم أحكام نظام بينالي الشارقة في الخلايا البشرية. ويبين الشكل 1A مخطط في المختبر توصيل خلايا هيلا، الذي أجرى لتقييم تنظيم النسخي س. ب ترانسبوساسي مع الجرعة أفضل مزيج من موجهات إيدلف اثنين (ذكر في الجدول 2). تنظيم النسخي SB100X كان يقاس قرت-بكر (

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، يمكننا وصف منهجية متاحة على نطاق واسع لإدماج غوي ستابلي في جينوم الخلايا المستهدفة الجمال النائم-بوساطة تبديل. على الرغم من أن وضع نظام بينالي الشارقة لتوفير أسلوب فاجيناليس للتحرير الجينوم، تسليم كفاءة إليه التكامل (ترانسبوساسي وينقول T2) إلزامي. ولذلك، استخدام نظام بينالي الشارقة على الخلايا الأولية لا يكاد ترانسفيكتابل، جرت متابعة عملية تسليم فيروسية لمكونات SB في السنوات الأخيرة10،،من1215. غير أن أيا من النواقل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر الأستاذ زابافيجنا وجامعة مودينا ريجيو إميليا، مودينا، إيطاليا لتزويدنا بما بتشل-PGKrtTA2S-بلازميد M2. ونعترف أيضا زين Z. إيفيكس (معهد بول الريش، أنغن، ألمانيا)، والأستاذ الدكتور زهير إيزفاك (ماكس ديلبروك مركز "الطب الجزيئي"، برلين، ألمانيا) والبلازميدات pCMVSB100X و pT2/البوسنة والهرسك. أيد هذا العمل ديبرا الدولية ووزارة الجامعة والبحث الإيطالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دولبيكو s النسر المعدل s متوسط مع 4.5 جم / لتر من الجلوكوز بدون L-GlutamineLonzaBE12-614Fوسط زراعة الخلية.
مصل HyClone Fetal Bovine (الولايات المتحدة) ، يتميزGE Healthcare LifeSciences SH30071.03المصل المستخدم HEK293T زراعة الخلايا لإنتاج الجسيمات الفيروسية.
البنسلين 10.000 UI / مل Streptomycin 10.000 UI / mlكواشف LonzaDE17-602Eلوسط زراعة الخلايا.
كاشف L-Glutamine 200mMLonzaBE17-605Eلوسط زراعة الخلايا.
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) كاشفسيجما-ألدريتشS7653لتحضير HBS 2X.
HEPES Buffer ، مخزون 1M في كاشف LonzaBE17-737Eالعادي لتحضير HBS 2X.
هيدرات فوسفات الهيدروجين ثنائي الصوديوم (Na2HPO4· 2H 2 < / sub >O) ، كاشف 99.5٪Merck106580لإعداد HBS 2X.
حمض الهيدروكلوريك - كاشف ACS 37٪ (HCl)كاشف 320331 سيجما ألدريتشلتحضير HBS 2X.
ماء معقم للحقنكاشف فريسينيوس كابيلإعداد HBS 2X.
0.45 وميكرو ؛ مرشح م PESSWhatman10462100مرشحات تستخدم لإزالة بقايا الخلايا من المواد الطافية الفيروسية.
أنابيب Polyallomer BeckmanBeckman Coulter326823Tubes لتركيز نواقل IDLV عن طريق الطرد المركزي الفائق.
PBS-1X بدون Ca ، MgLonzaBE17-516Fعازلة لغسل الخلايا وإعادة تعليق الجسيمات الفيروسية.
ألبومين مصل الأبقار (BSA)Sigma-AldrichA2153(اختياري) عازلة لإعادة تعليق الجسيمات العدسية.
مجموعة التقاط المناعة لفيروس نقص المناعة البشرية -1 Gag p24NEK50001KT Perkin Elmerلمعايرة جسيمات IDLV.
كاشف 107689 PolybreneSigma-Aldrichلتعزيز كفاءة التحويل.
التربسين (10X) 2.5٪ في HBSS بدون Ca ،GIBCOBE17-160Eلفصل خلايا HeLa (محلول مخزون ، يتم تخفيفه).
ملح ثنائي الصوديوم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA)100938Bكاشف AnalaR BDHلإعداد محلول عمل التربسين.
0.5٪ تريبسين EDTA ، بدون فينول أحمر (10X)كاشف GIBCO15400-054لفصل الخلايا الكيراتينية (محلول مخزون ، يتم تخفيفه).
مصل الأبقار المتبرع ، نيوزيلندا المنشأGIBCO16030-074مصل لزراعة الخلايا الفأر السويسري 3T3-J2 (طبقة مغذية).
لحم الخنزير s F12 mediaGIBCO21765متوسط للخلايا الكيراتينية.
مصل الأبقار الجنينيLonzaDE14-801Fلوسط زراعة خلايا HeLa.
مصل الأبقار الجنينية ، مؤهل ، مصلجيبكو10099-141أسترالي لوسط زراعة الخلايا الكيراتينية الأولية البشرية.
الأنسولين من البنكرياس البقريسيجما ألدريتشI5500الكواشف لنمو الخلايا الكيراتينية.
الأدينينVWR1152-25الكواشف لنمو الخلايا الكيراتينية.
الهيدروكورتيزونVWR3867-1لنمو الخلايا الكيراتينية.
توكسين الكوليرا من ضمة الكوليراسيجما ألدريتشC8052الكواشف لنمو الخلايا الكيراتينية.
كواشف ثلاثي يودوثيرونينسيجما-ألدريتشT5516لنمو الخلايا الكيراتينية.
البشرية EGFالبيولوجية الأستراليةGF-010-9لنمو الخلايا الكيراتينية.
الفأر أحادي النسيلة APC مترافق الأجسام المضادة المضادة للتغذيةMiltenyi Biotech130-096-099لتسمية طبقة التغذية.
طقم تنقية RNeasy Plus Mini KitQiagen74134RNA.
SuperScript III Reverse TranscriptaseLife Technologies18080051مجموعة النسخ العكسي.
مزيج ديوكسي نوكليوتيد ، 10 ملي مولار (dNTP)سيجما-ألدريتشD7295لتفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي.
الماء المقطر الخالي من DNase / RNase(أي)فائق النقاء لتفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي وqRT-PCR.
جوتك جي 2 هوت ستارت بوليميرازبروميجاM740Bتاك بوليميراز.
Agarose ، للبيولوجيا الجزيئيةكاشف Sigma-AldrichA9539للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
UltraPure TBE Buffer ، كاشف15581028Invitrogenللرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز ، ليكون مخففا (1X) في ddH2O.
بروميد الإيثيديومسيجما ألدريتشE1510للرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
دوكسيسيكلينسيجما-ألدريتشD-9891دواء للحث على التعبير عن الترانسبوزاز في خلايا هيلا وفي الخلايا الكيراتينية
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystem4304437TaqMan Universal PCR Master Mix بما في ذلك الاشعال والمسبار.
طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين عالي الوضوح سعة 15 مل ، قاع مخروطي الشكل ، مع غطاء برغي ختم القبة ،352096فالكونلجمع الخلايا وإعداد تخفيف النواقل.
طبق ثقافة الخلايا المعالج TC مقاس 150 مم مع شبكة 20 مم ،353025صقرمعقم لإنتاج الفيروسات.
6 لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار ذات القاع المسطح الشفاف جيدا ، مع غطاء ، ملفوف بشكل فردي ،353046الصقرل HeLa ونقل الخلايا الكيراتينية الأولية البشرية.
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن ، الحجم 1.5 ملEppendorf0030 120.086أنابيب لإعداد التخفيف.
أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن ، الحجم 2 ملEppendorf0030 120.094أنابيب لإعداد التخفيف.
PCR سعة 0.2 مل مع أغطية مسطحة ، RNase ، DNase ، DNA و PCR المثبطات الخالية(أي)منالأنابيب لتفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي.
لوحة تفاعل بصرية سريعة من MicroAmp بسعة 96 برا مع رمز شريطي ، نظام حيوي مطبق 0.1 مل434690696 بئر ل qRT-PCR.
أنبوب بوليسترين دائري القاع سعة 5 مل ، بدون أنابيب352052BD Falconللحصول على قياس التدفق الخلوي.
ماصات مصلية يمكن التخلص منها ، بوليسترين ، ملفوفة بشكل فردي ، معقمة (أحجام مختلفة)(أي)-ماصات لتطبيقات زراعة الأنسجة المعقمة.
نصائح التصفية ، المعقمة ، و RNase ، DNase ، DNA و Pyrogen الخالية (أحجام مختلفة)(أي)-نصائح التصفية لمجموعة الأنسجة المعقمة وتطبيقات البيولوجيا الجزيئية.
مقياس الأس الهيدروجيني(أي)-معدات لقياس HBS 2X درجة الحموضة.
PCR Thermalcycler (any)-معدات لتفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي.
معدات الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز(أي)-معدات الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز من تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2BD-FlowCytometer.
7900HT نظام PCR سريع في الوقت الحقيقيتطبيق Biosystem7900HTلجهاز qRT-PCR.
أجهزة الطرد المركزي على الطاولة لمعالجة العينات بكفاءة في تطبيقات زراعة الخلايا ، المبردة ، مع دلاء صفيحة دقيقة.(أي)-أجهزة الطرد المركزي لمعالجة زراعة الخلايا وتلقيحها.
جهاز طرد مركزي فائق Optima L-90K مجهز بدوار SW32TIBeckman Coulter-UltraCentrifuge لإنتاج الجسيمات الفيروسية.
معدات لزراعة الخلايا ومختبر البيولوجيا الجزيئية (على سبيل المثال ، غطاء التدفق الصفحي من الفئة الثانية المصمم للعمل الذي يتضمن مواد BSL2 وحاضنة زراعة الخلايا والثلاجات والمجمدات (+4 درجة ؛ ج ، -20 درجة ؛ ج ، -80 درجة ؛ ج) ، الماصات الدقيقة ومساعدات الماصات).
معاطف المختبر الواقية والقفازات وحماية الوجه وفقا لقواعد المعهد وأنظمته، ولا سيما لإنتاج الجسيمات الفيروسية ونقلها.
الملحي ثنائي مجموعة كاشف Mg من أصل كواشف الكواشف كاشف كاشف 10X كاشف أنبوب أنابيب معقمة طبق ثقافة خلية صقر لوحة ثقافة الخلايا المعقمة أنابيب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mates, L., et al. Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates. Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).
  2. Maiti, S. N., et al. Sleeping beauty system to redirect T-cell specificity for human applications. J Immunother. 36 (2), 112-123 (2013).
  3. Johnen, S., et al. Sleeping Beauty transposon-mediated transfection of retinal and iris pigment epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (8), 4787-4796 (2012).
  4. Koso, H., et al. Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).
  5. Belay, E., et al. Novel hyperactive transposons for genetic modification of induced pluripotent and adult stem cells: a nonviral paradigm for coaxed differentiation. Stem Cells. 28 (10), 1760-1771 (2010).
  6. Grabundzija, I., et al. Sleeping Beauty transposon-based system for cellular reprogramming and targeted gene insertion in induced pluripotent stem cells. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1829-1847 (2013).
  7. Kues, W. A., et al. Derivation and characterization of sleeping beauty transposon-mediated porcine induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 124-135 (2013).
  8. Turchiano, G., et al. Genomic analysis of Sleeping Beauty transposon integration in human somatic cells. PLoS One. 9 (11), e112712(2014).
  9. Jin, Z., et al. The hyperactive Sleeping Beauty transposase SB100X improves the genetic modification of T cells to express a chimeric antigen receptor. Gene Ther. 18 (9), 849-856 (2011).
  10. Latella, M. C., et al. Correction of Recessive Dystrophic Epidermolysis Bullosa by Transposon-Mediated Integration of COL7A1 in Transplantable Patient-Derived Primary Keratinocytes. J Invest Dermatol. 137 (4), 836-844 (2017).
  11. Zhang, W., et al. Integration profile and safety of an adenovirus hybrid-vector utilizing hyperactive sleeping beauty transposase for somatic integration. PLoS One. 8 (10), e75344(2013).
  12. Zhang, W., et al. Hybrid adeno-associated viral vectors utilizing transposase-mediated somatic integration for stable transgene expression in human cells. PLoS One. 8 (10), e76771(2013).
  13. Turunen, T. A., Laakkonen, J. P., Alasaarela, L., Airenne, K. J., Yla-Herttuala, S. Sleeping Beauty-baculovirus hybrid vectors for long-term gene expression in the eye. J Gene Med. 16 (1-2), 40-53 (2014).
  14. Galla, M., et al. Avoiding cytotoxicity of transposases by dose-controlled mRNA delivery. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7147-7160 (2011).
  15. Moldt, B., et al. Comparative genomic integration profiling of Sleeping Beauty transposons mobilized with high efficacy from integrase-defective lentiviral vectors in primary human cells. Mol Ther. 19 (8), 1499-1510 (2011).
  16. Recchia, A., Perani, L., Sartori, D., Olgiati, C., Mavilio, F. Site-specific integration of functional transgenes into the human genome by adeno/AAV hybrid vectors. Mol. Ther. 10, 660-670 (2004).
  17. Urlinger, S., et al. Exploring the sequence space for tetracycline-dependent transcriptional activators: novel mutations yield expanded range and sensitivity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (14), 7963-7968 (2000).
  18. Cocchiarella, F., et al. Transcriptionally regulated and nontoxic delivery of the hyperactive Sleeping Beauty Transposase. Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16038(2016).
  19. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nat Med. 12 (3), 348-353 (2006).
  20. Dull, T., et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  21. Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. Mobilization of DNA transposable elements from lentiviral vectors. Mob Genet Elements. 1 (2), 139-144 (2011).
  22. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A laboratory Manual. , 4th edition, (2012).
  23. Dellambra, E., et al. Corrective transduction of human epidermal stem cells in laminin-5-dependent junctional epidermolysis bullosa. Hum Gene Ther. 9, 1359-1370 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Sleeping Beauty SystemTranscriptional RegulationIntegration Defective Lentiviral VectorGene Of InterestHyperactive TransposaseTet ON SystemPrimary KeratinocytesFlow CytometryReal Time PCRDoxycycline Induction

مقالات ذات صلة