مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات

John M. Powers; Xiao Lan Chang; Zhen Song; Hiroyuki Nakai

doi:10.3791/56766

مقالة منهجية

مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات

DOI:

10.3791/56766

⸱

يونيو 12, 2018

John M. Powers¹ , Xiao Lan Chang¹ , Zhen Song¹ , Hiroyuki Nakai¹^,²

¹Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, ²Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاصيل هذه المخطوطة مقايسة دوت مباشرة وصمة عار كوانتيتيشن من التتر الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) وتطبيقه على دراسة دور الجمعية-تفعيل البروتينات (آبس)، فئة جديدة من البروتينات الفيروسية غير الهيكلية الموجودة في جميع إف اللقاح، في الترويج لجمعية كابسيدس المستمدة من اللقاح إف المشابهة ومغايرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بينما الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) مقبول على نطاق واسع متجه جذابة للعلاج الجيني، أيضا بمثابة فيروس نموذجي لفهم البيولوجيا الفيروس. وفي الصدد، الاكتشاف الأخير للبروتين إف غير هيكلية، ووصف الجمعية-تفعيل البروتين (AAP)، ضوءا جديداً على العمليات التي ينطوي عليها جمعية البروتينات الفيروسية قفيصه نائب الرئيس إلى قفيصه. على الرغم من أن العديد من إف اللقاح يتطلب الوكالة الأسترالية للجمعية، أننا قد ذكرت مؤخرا أن AAV4، 5، و 11 استثناءات لهذه القاعدة. وعلاوة على ذلك، أثبتنا أن آبس وكابسيدس المجمعة من اللقاح مختلفة المعربة إلى مقصورات سوبسيلولار مختلفة. هذا التباين غير متوقعة في الخصائص البيولوجية والأدوار الوظيفية من آبس بين مختلف إف اللقاح يؤكد أهمية الدراسات في AAPs المستمدة من اللقاح المتنوعة. تفاصيل هذه المخطوطة مقايسة دوت مباشرة وصمة عار كوانتيتيشن إف وتطبيقه على تقييم الوكالة الأسترالية خصوصية الاتكال والنمط المصلي المسيطر في الجمعية قفيصه. وللتدليل على فائدة هذه المقايسة دوت وصمة عار، حددنا لتميز الجمعية قفيصه وتبعية الوكالة الأسترالية "إف ثعبان" وزواحف سابقا أونتشاراكتيريزيد إف، فضلا عن AAV5 و AAV9، التي ثبت سابقا أن تكون مستقلة عن الوكالة الأسترالية، وتعتمد على الوكالة الأسترالية اللقاح، على التوالي. المقايسة كشفت عن أن الجمعية قفيصه "إف ثعبان" يتطلب "الوكالة الأسترالية ثعبان" ولا يمكن تعزيزها آبس من AAV5 و AAV9. كما أظهرت المقايسة، خلافا للعديد من النمط المصلي المسيطر المشتركة آبس التي تعزز الجمعية قفيصه مغايرة بالتكامل عبر، "الوكالة الأسترالية الأفعى" لا تشجع جمعية كابسيدس AAV9. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض أن يؤثر اختيار نوكلاس كثيرا على قراءات للمقايسة وصمة عار دوت، وهكذا، اختيار إنزيم أمثل أمر حاسم لتقييم نجاح التتر إف.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) فيروس الحمض النووي الصغيرة، غير المغلفة، واحد-الذين تقطعت بهم السبل مع جينوم لحوالي 4.7 كيلوبس (kb). جينوم إف يحتوي على إطارات مفتوحة القراءة (Orf) للجينات مندوب و كاب . في عام 2010، اكتشفت أم سونتاج et al. بروتين nonstructural سابقا مجهولة مرمزة بواسطة ORF تحول الإطار + 1 داخل الجينات كاب AAV2 ووجدت أن تلعب دوراً حاسما في جمعية AAV2 قفيصه نائب الرئيس مونومر البروتينات في الفيروسية ¹من قفيصه. قد سمي هذا البروتين رواية الجمعية-تفعيل البروتين (AAP) بعد الدور الذي تؤديه في تعزيز قفيصه الجمعية العامة¹.

وقد ORFs للوكالة الأسترالية بيوينفورماتيكالي التي تم تحديدها في الجينوم من جميع بارفوفيروسيس داخل جنس ديبيندوبارفوفيروس، ولكن ليس ضمن مورثات من فيروسات أجناس مختلفة من الأسرة¹^،البارفو². الدراسات الفنية لهذا البروتين الرواية في البداية ركزت على الوكالة الأسترالية من النموذج AAV2 (AAP2)، التي أنشأت بالدور الأساسي ل AAP2 في استهداف البروتينات نائب الرئيس مفككة إلى نوية لتراكم وتكوين في كامل تجميع كابسيدس¹^،^،من³⁴. وقد عجز كابسيدس AAV2 التجمع في غياب التعبير الوكالة الأسترالية بشكل مستقل أكدت مجموعات متعددة، بما في ذلك بلدنا¹^،²^،^،من³⁴^،⁵. الدراسات اللاحقة على اللقاح إف 1 و 8 و 9 يؤكد على الدور الحاسم آبس في الجمعية قفيصه، كالبروتينات مونومر VP3 من AAV1، 8، و 9 لم يتمكنوا من تشكيل من قفيصه مجمع بشكل كامل في غياب التعبير المشارك من الوكالة الأسترالية².

في الآونة الأخيرة، من خلال النهج التي تشمل استخدام الكمية دوت لطخة فحوصات، نحن التحقيق في قدرة AAV1 على 12 VP3 مونومرات لتجميع إلى كابسيدس في غياب التعبير الوكالة الأسترالية، وقدرة AAP1 إلى 12 النهوض بجمعية مونومرات VP3 من اللقاح مغايرة. وقد كشفت هذه الدراسة أن AAV4، VP3 5، و 11، يمكن تجميع مونومرات دون الوكالة الأسترالية. بالإضافة إلى ذلك، قد تبين أن ثمانية من أصل اللقاح الوكالة الأسترالية اثنا عشر قمنا بفحص (أي، لكن كل AAP4، 5 و 11 و 12) عرض بقدرة واسعة لدعم الجمعية قفيصه من كابسيدس النمط المصلي المسيطر إف مغايرة، بينما AAP4، 5 و 11 و 12 عرض إلى حد كبير قدرة محدودة في هذا الصدد⁶. هذه الأنماط الأربعة فيلوجينيتيكالي بعيدة عن الآخر الوكالة الأسترالية اللقاح²^،³. وعلاوة على ذلك، كشفت الدراسة تغايرية مهمة في تعريب سوبسيلولار مختلفة آبس⁶. وعلاوة على ذلك، وقد اقترحت الدراسة أن الرابطة ضيق من الوكالة الأسترالية مع كابسيدس المجمعة ونويه، السمة المميزة للجمعية قفيصه AAV2، بالضرورة لا يمكن أن تمتد للقاح الأخرى بما في ذلك AAV5، 8، و 9، الذي عرض استبعاد النوية كابسيدس المجمعة⁶. وبالتالي، المعلومات المكتسبة من دراسة أي النمط المصلي المسيطر خاصة الوكالة الأسترالية ليس نطاق واسع ينطبق على جميع الأحياء الوكالة الأسترالية. ويؤكد هذا الطابع المحير البيولوجيا الوكالة الأسترالية الحاجة إلى التحقيق في دور ووظيفة كل الوكالة الأسترالية من اللقاح إف كل المقبول وغير المقبول.

يمكن تقييم دور الوكالة الأسترالية البيولوجية في قفيصه الجمعية بتحديد التتر الجسيمات الفيروسية إف مغلفة تماما تنتج الكلي الجنينية البشرية (HEK) الخلايا 293، خط الخلية الأكثر استخداماً لإنتاج ناقلات إف، مع أو بدون البروتين الوكالة الأسترالية التعبير. هي الأساليب القياسية كوانتيتيشن إف PCR الكمي (qPCR)-استناداً إلى فحوصات⁷^،⁸ ودوت الكمية على أساس وصمة عار فحوصات⁹. طرق أخرى إف كوانتيتيشن الجسيمات الفيروسية مثل المرتبط بالانزيم المرتبط بالانزيم¹⁰^،¹¹ أو الكثافة الضوئية قياس¹² ليست مثالية للعينات المستمدة من العديد من اللقاح إف مختلفة أو العينات ملوثة بالشوائب (ليساتيس النفط الخام أو ثقافة وسائل الإعلام)، التي غالباً ما تكون العينات المستخدمة للبحوث إف. حاليا، قبكر هو الأكثر استخداماً كوانتيتاتيون إف؛ ومع ذلك، من الضروري أن نعترف بالمحاذير المحتملة من مقايسة المستندة إلى قبكر، كما الفحص يمكن أن تؤدي الأخطاء النظامية وعيار كبير الاختلافات¹³^،¹⁴. فحوصات على أساس PCR تتأثر بعدد من عوامل، مثل وجود دبابيس الشعر الطرفية تساهمي مغلقة في قوالب PCR التي تمنع التضخيم¹³التباس يحتمل أن تكون. حتى فرد ذوي خبرة يمكن أن يعرض إمكانات عوامل التباس في أساس qPCR الاعتداء تدري¹³. وفي المقابل، فحوصات وصمة عار دوت الكمية هي تقنية بيولوجيا الجزيئية كلاسيكية التي لا تنطوي على التضخيم الجينوم ويستخدم مبدأ أبسط بكثير مع الحد أدنى من مخاطر للأخطاء بالمقارنة مع الاختبارات المستندة إلى قبكر. الأسلوب أقل صعوبة من الناحية التقنية؛ ولذلك، نتائج التحليل يتم استنساخه بشكل معقول حتى من قبل الأفراد عديمي الخبرة.

في هذا التقرير، يصف لنا تفاصيل مقايسة وصمة عار دوت كمية نستخدمها بشكل روتيني لناقل إف كوانتيتيشن وتوفير مثال عن كيفية تطبيق التحليل دراسة دور تعزيز الجمعية آبس في عام اللقاح (AAV5 و AAV9)، والمنهجية أونتشاراكتيريزيد AAP سابقا من "ثعبان إف"¹⁴. في الطبيعة، يعبر عن "نائب الرئيس إف" البروتينات والبروتينات الوكالة الأسترالية في رابطة الدول المستقلة من جينة واحدة (أي، الوكالة الأسترالية نائب رئيس رابطة الدول المستقلة-التكامل)، بينما في مقايسة الموصوفة هنا، يتم توفير البروتينات نائب الرئيس والوكالة الأسترالية في ترانس من اثنين والبلازميدات منفصلة (أي، نائب الرئيس--الوكالة الأسترالية ترانس-التكامل). حيث يمكن التعبير عن كل البروتين نائب الرئيس أو الوكالة الأسترالية من اللقاح مختلفة من كل بلازميد مستقلة، يصبح من الممكن لاختبار تركيبات نائب الرئيس-الوكالة الأسترالية مغايرة للجمعية قفيصه (أي، نائب الرئيس--الوكالة الأسترالية عبر-التكامل). بإيجاز، VP3 إف من اللقاح مختلف أعرب عن في الخلايا HEK 293 تعداء بلازميد الحمض النووي حزمة جينوم ناقل إف في وجود أو غياب النمط المصلي المسيطر المشابهة الوكالة الأسترالية، أو حضور النمط المصلي المسيطر مغايرة الوكالة الأسترالية. وبعد الإنتاج، وسائط الثقافة وخلية ليساتيس يتعرضون مقايسة دوت وصمة عار التحديد الكمي للجينوم الفيروسي داخل shell قفيصه. الخطوة الأولى للمقايسة وصمة عار دوت التعامل مع عينات مع نوكلاس لإزالة تلويث بلازميد السلطات الوطنية المعينة وغير معبأة إف الجينوم في العينات. أن الفشل في القيام بذلك زيادة الإشارات الخلفية خاصة عندما يتم جزيئي عينات أونبوريفيد. ويعقب هذا ثم علاج مبطلات لكسر كابسيدس الفيروسية والإفراج عن الجينوم الفيروسي نوكلاس المقاوم في عينة حلول. الجينوم الفيروسية القادم، والتشويه والتحريف ومسح على غشاء وتهجين مع مجس الحمض النووي خاصة جينوم فيروسي كوانتيتيشن. في المقايسة المثال ذكرت هنا، نظهر أن يتطلب VP3 إف ثعبان ثعبان الوكالة الأسترالية للجمعية قفيصه وأن "الوكالة الأسترالية الأفعى" لا يروج لجمعية كابسيدس AAV9 خلافا للعديد من آبس المستمدة من اللقاح تعتمد على الوكالة الأسترالية التي يمكن أيضا أن تعزز الجمعية من كابسيدس النمط المصلي المسيطر مغايرة. أخيرا، نحن تقرير المحاذير هامة إلى قبكر أو فحوصات دوت كوانتيتيشن إف المستندة إلى وصمة عار أن اختيار نوكلاس يؤثر إلى حد كبير على نتائج التحليل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم توفير وصفات للحلول والمخازن المؤقتة اللازمة لهذا البروتوكول في الجدول 1. البروتوكول هو موضح أدناه للمقايسة وصمة عار دوت التكامل عبر نائب الرئيس-الوكالة الأسترالية لدراسة أدوار البروتينات الوكالة الأسترالية في الجمعية قفيصه. طريقة المقايسة دوت الكمية أكثر عمومية على وصمة عار لمعايرة ناقلات إف المنقي مفسرة في مقطع النتائج الممثل .

1-تشييد VP3، الوكالة الأسترالية، ومندوب AAV2 الإعراب عن البلازميدات

بناء VP3-بكمف-آب (x = اللقاح)
1. [بكر] تضخيم ORF VP3 كامل (1.6 كيلو بايت) باستخدام بوليميراز الدنا عالية الدقة وزوج التمهيدي التالية: VP3 إلى الأمام، كتا-RE1-كاكك-N₂₅ (النيوكليوتيدات 25 أولاً من VP3 ORF)؛ VP3 العكسية، تكت-RE2-N₂₅ (النيوكليوتيدات آخر 25 من VP3 ORF).
  ملاحظة: RE1 و RE2 مواقع لإنزيمات التقييد (REs) للاستنساخ. كتا وتكت هي المحطة 5 'و 3' تيترانوكليوتيديس إضافة إلى تسهيل الهضم إنزيم التقييد بالقرب من نهاية الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل. كاكك تسلسل توافق كوزاك.
2. استنساخ منتجات PCR ريديجيستيد بين المقابلة إعادة المواقع ناقل التعبير الثدييات التي يستخدمها الفيروس المضخم للخلايا البشرية على الفور المبكر (CMV-IE) محسن-المروج للتعبير رفيعة المستوى.
  ملاحظة: للاستنساخ الجزيئي، هضم 5 ميكروغرام من الحمض النووي بلازميد العمود الفقري مع restriction enzyme(s) بتركيز 4 U/ميكروغرام الحمض الخلوي الصبغي ح 1 في درجة حرارة مثلى. لشظايا PCR، وزيادة وحدات الإنزيمات المستخدمة (مثلاً، 10 ش/ميكروغرام المنتج VP3 ORF PCR 1.6 كيلو بايت) وفترة حضانة أطول (مثلاً، ح 4) نظراً لزيادة عدد المواقع الاعتراف إنزيم التقييد كل وحدة طول. معلومات مفيدة في الإنزيمات البيولوجيا الجزيئية وإجراءات الاستنساخ بما في ذلك التحول البكتيري ويمكن الاطلاع على أماكن أخرى¹⁵^،^،من¹⁶¹⁷.
بناء آبكس-بكمف-علامة (x = اللقاح)
1. بكر-تضخيم ORF الوكالة الأسترالية كامل (0.6 كيلو بايت) باستثناء الأحماض الأمينية الأولى استخدام بوليميراز الدنا عالية الدقة وزوج التمهيدي التالية: الوكالة الأسترالية إلى الأمام، كتا-RE1-كاككاتجاكتاكاجاكجاكجاتجاكاا-N₂₅ (النيوكليوتيدات 25 من النوكليوتيدات الرابعة في الوكالة الأسترالية ORF)؛ الوكالة الأسترالية عكس، تكت-RE2-N₂₅ (النيوكليوتيدات 25 آخر من الوكالة الأسترالية ORF).
  ملاحظة: رموز جاكتاكاجاكجاكجاتجاكاا علامة علم، التي ثبت أن لها أي آثار ضارة⁴^،⁵ ولكن يمكن حذفها إذا كانت غير ضرورية.
2. استنساخ منتجات PCR ريديجيستيد بين المواقع المقابلة لناقل التعبير الثدييات مع CMV--أي محسن-المروج¹⁵^،^،من¹⁶¹⁷.
بناء مندوب فلب
1. ملخص 5 ميكروغرام من بلازميد باف RC2 (7.3 كيلو بايت) مع 20 وحدة من زهو و Xcm الأول، وتنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات تنقية الحمض النووي تجاري أو عن طريق استخراج الفينول كلوروفورم.
  ملاحظة: إزالة 1.8 kb إكسهو أنا--Xcm أنا جزء من النتائج بلازميد RC2 باف 7.3 كيلو بايت في خسارة قفيصه التعبير البروتين نائب الرئيس مع الحفاظ على التعبير البروتين Rep.
2. كليلة الحمض النووي ينتهي ب 6 وحدات من T4 دنا بوليميريز، [اغروس] هلام تطهير الجزء الحمض النووي 5.5 كيلو بايت، وذاتية سد جزء المنقي على استخدام 50 إلى 100 نانوغرام من الحمض النووي و 400 وحدة من ليجاسى T4 الحمض النووي وفقا للشركة المصنعة التوصية¹⁵.
3. اتبع الإجراء التحول الجرثومي القياسية المشار إليها في الخطوة 1.1.2 علما.
تحقق من بنيات بلازميد الهضم إنزيم التقييد وتسلسل¹⁵^،¹⁸.
أداء بلازميد مينيبريبس أو ماكسيبريبس باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً للحصول على كمية كافية من بلازميد الحمض النووي لتجارب إنتاج إف المتلقين للمعلومات.

2-إنتاج إف في HEK 293 الخلايا التي بلازميد الدنا تعداء (التكامل عبر الفحص)

الثقافة HEK 293 الخلايا في النسر المتوسط تعديل (دميم في دولبيكو)-ارتفاع الجلوكوز (4.5 غرام/لتر) وتستكمل مع 10% الجنيني البقري المصل (FBS)، 1% البنسلين & ميكس ستربتوميسين، و 1 مم حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% ثاني أكسيد الكربون (CO₂) ل الجلوتامين،.
ملاحظة: التتر إف تختلف إلى حد كبير اعتماداً على مصدر الخلايا HEK 293.
تنبيه: على الرغم من أن إف يمكن التعامل معها في السلامة الأحيائية من المستوى 1 (BSL1) الاحتواء، ويوصي بالاحتواء BSL2 HEK 293 خلية عمل.
في يوم-1 (ح 24 قبل تعداء)، لوحة 6 – 7 × 10⁵HEK 293 الخلايا/بئر في 2 مل من المتوسط كاملة هو موضح في الخطوة 2، 1 في plate(s) 6-جيدا. وهذا يحقق عموما كونفلوينسي ~ 90% في اليوم التالي.
اليوم 0: تعداء
1. إعداد للحمض النووي تعداء
  1. تأكد من أن الخلايا قد وصلت إلى كونفلوينسي ~ 90%.
  2. الاحماء دميم تكملة مع 1% البنسلين & "ميكس ستربتوميسين" و 1 مم L-الجلوتامين ولكن دون 10% FBS (أيخالية من المصل المتوسط) في حمام مائي 37 درجة مئوية.
  3. تسمح حل بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
2. إعداد خليط الحمض النووي بلازميد
  1. مزيج من البلازميدات في ميليلتر 96 من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) دون كاكل₂ أو مجكل₂ في أنابيب ميكروسينتريفوجي معقم 1.5 مل كما هو مبين في الجدول 2. المبلغ الإجمالي للحمض النووي 2 ميكروغرام/جيدا.
    ملاحظة: يمكن تجاهل وحدات التخزين للحل بلازميد الحمض النووي إذا كانت القيمة الاسمية. ويوصي بضبط مستوى الصوت إذا كان الحجم الإجمالي للحلول الحمض النووي بلازميد ميليلتر إيه وان زيرو.
3. تعداء بي
  1. إضافة 4 ميليلتر من حل بي (1 ملغ/مل) لهذا المزيج PBS-بلازميد الحمض النووي (أعدت كما هو مذكور أعلاه). وحدة التخزين النهائي هو حوالي 100 ميليلتر (حجم 5% من متوسط الثقافة). دوامة الأنابيب بإيجاز واحتضان خليط الحمض النووي: بي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. أثناء انتظار الاحتضان 15 دقيقة لإكمال، يستعاض المتوسطة الثقافة المتوسطة بريوارميد خالية من المصل هو موضح في الخطوة 2.3.1.2...
  3. 15-دقيقة مرة واحدة في الحضانة من الحمض النووي: خليط بي كاملة، بإيجاز تدور هذه الأنابيب مع ميكروسينتريفوجي لجمع السائل إلى الجزء السفلي من الأنابيب، وإضافة خليط الحمض النووي: بي dropwise إلى المتوسطة الثقافة في كل من لوحة الثقافة HEK 293 جيدا. بلطف تحرض اللوحات وإعادتها إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع شركة 5%₂.
  4. الحفاظ على الخلايا في هذه الوسيلة تعداء حتى موسم الحصاد في يوم 5 (أي تغيير المتوسطة مطلوب).
وفي يوم 1 و 2 يوم، مراقبة الخلايا transfected مع بلازميد بكمف-التجارة والنقل تحت مجهر مقلوب الأسفار تقييم الكفاءة تعداء.
ملاحظة: للأسفار مجهرية، هنا 10 X/استخدمت 0.25 الهدف الفتحة العددية في تركيبة مع العدسة 10 ×، ويعملن 450-490 نانومتر الإثارة ممر الموجه مرشح و 515 – 565 نانومتر ممر الموجه مرشح الانبعاثات. الشرط أعلاه عادة ينتج أكثر من الكفاءة تعداء 70%. الخلايا فقد يحمل بعض التغييرات السمات (مثل خلايا أصبحت ضئيلة) بسبب حالة خالية من المصل.
3 – 5 أيام، لا تزال الثقافة transfected الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5% CO₂.
في يوم 5، جمع الخلايا والمتوسطة التي تحتوي على الفيروسات إلى أنابيب مخروطية البوليبروبيلين 15 مل بيبيتينج صعودا وهبوطاً أو بإلغاء مع مكشطة خلية.
تخزين العينات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

3-دوت المقايسة وصمة عار كوانتيتاتيون إف

استرداد جسيمات الفيروسية
1. سرعة ذوبان الجليد أنابيب المجمدة في حمام مائي 37 درجة مئوية. دوامة الأنابيب بقوة عن 1 دقيقة إلى أقصى حد ممكن استعادة إف من الخلايا.
2. بيليه الحطام خلية من سينتريفوجينج في 3,700 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تأخذ 200 ميليلتر من المادة طافية من كل أنبوبة وتحويلها إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مسمى بسداده ملولبة للمقايسة وصمة عار دوت.
  ملاحظة: قاسمة المادة طافية المتبقية في ميكروسينتريفوجي أنابيب وتخزينها في المجمدة في-80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. هنا، يعلق أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي مع الأغطية اللولبية واستخدمت الدائري. مطلوب الختم مشددة لمنع تسرب إف والفينول كلوروفورم.
المعاملة مع endonuclease marcescens السراتية
1. إعداد الكواشف مزيج أ وب مزيج (الجدول 3). إضافة 10 ميليلتر من مزيج أ و 10 ميليلتر من "المزيج ب" في كل أنبوب. دوامة الأنابيب ل 5 ق، تدور بإيجاز هذه الأنابيب لجمع السائل إلى الجزء السفلي من الأنابيب واحتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية على الأقل ح 1.
  ملاحظة: مزيج A يحتوي على هيدروكسيد الصوديوم ويحسن درجة الحموضة للمعاملة مع اندونوكليسي S. marcescens . ب مزيج مكملات المغنيسيوم. قد تختلف تركيز endonuclease S. marcescens في مخزونات إنزيم المتاحة تجارياً. حجم endonuclease S. marcescens يحتاج إلى تعديل تبعاً لذلك جعل 200 يو/مليلتر بعد إضافة مزيج أ وب مزيج في أنابيب في خطوة 3.2.1.
  ملاحظة: فترة حضانة أطول، يصل إلى ح 4، يمكنك تقليل الإشارات الخلفية.
2. في نهاية الحضانة، بإيجاز تدور الأنابيب مع benchtop أجهزة الطرد مركزي لجمع التكثيف والحل من الأعلى والجانبين من الأنابيب.
  ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين العينات المجمدة في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية.
العلاج بروتيناز ك
1. تحضير الكاشف "ج ميكس" (الجدول 3). إضافة ميليلتر 180 ج المزيج في كل أنبوب. دوامة الأنابيب ل 5 ق، تدور هذه الأنابيب بإيجاز واحتضان هذه الأنابيب في 55 درجة مئوية ح 1.
  ملاحظة: يدتا في الكاشف "ج ميكس" يخلب أيونات المغنيسيوم مجاناً ويحللها endonuclease S. marcescens .
2. في نهاية الحضانة، تسمح العينات تصل إلى درجة حرارة الغرفة، وتدور بإيجاز الأنابيب مع benchtop أجهزة الطرد مركزي لجمع التكثيف والحل من الأعلى والجانبين من الأنابيب.
  ملاحظة: يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا. ويمكن تخزين العينات المجمدة في-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية. أن تستأنف في البروتوكول، احتضان هذه الأنابيب في 55 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق لإذابة بلورات مخزونات النشر الاستراتيجي الوارد في المخزن المؤقت تماما.
هطول الأمطار، واستخراج الإيثانول الفينول كلوروفورم
1. إضافة 200 ميليلتر من الفينول كلوروفورم للعينات ودوامه تدور لهم للحد الأدنى 1 العينات في ميكروسينتريفوجي في إيه وان سيكس، 100 غ س لإيه فايف دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  تنبيه: ينبغي التعامل مع الفينول كلوروفورم في غطاء الأبخرة كيميائية مع معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية؛ أيالنتريل القفازات، ونظارات أو درع الوجه ومعطف المعمل بأكمام طويلة).
2. نقل 320 ميليلتر من الطبقة المائية (160 ميليلتر مرتين مع ماصة P200) إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي قياسية جديدة (80% حجم السوائل المائية).
  ملاحظة: من الأهمية بمكان أن تتخذ نفس الحجم من محلول مائي بين العينات، وخلاف ذلك يفقد الإنزيم دقة كمية.
3. تحضير الكاشف "د مزيج" (الجدول 3). إضافة ميليلتر 833 د مزيج في كل أنبوب. دوامة الأنابيب ل 5 ق، واحتضان هذه الأنابيب في-80 درجة مئوية لمدة دقيقة إيه تو زيرو.
  ملاحظة: مزيج د خليط من الإيثانول، خلات الصوديوم، والجليكوجين لهطول الأمطار الإيثانول مريحة للحمض النووي. ويمكن تخزين العينات في-80 درجة مئوية في هذه الخطوة والبروتوكول يمكن أن تستأنف في وقت لاحق.
4. عينات للطرد المركزي مع ميكروسينتريفوجي في إيه وان سيكس، 100 غرام x عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى إيه وان فايف من أجل إيقاف المادة طافية ولطخة مرة على منشفة ورقية نظيفة. وضع حوالي 500 ميليلتر من الإيثانول 70% في كل أنبوب، دوامة أنابيب 5 s، وأجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب مع ميكروسينتريفوجي benchtop في إيه وان سيكس، 100 غرام x عند 4 درجة مئوية لمدة دقيقة إيه فايف.
5. من أجل إيقاف المادة طافية ولطخة مرة على منشفة ورقية نظيفة. الكريات الجافة عند 65 درجة مئوية؛ يمكن أن تجفف الكريات تماما.
  ملاحظة: لا تستخدم ماصة لإزالة الإيثانول الزائدة التي تبقى بعد النشاف الأنابيب. ويمكن أيضا المجففة الكريات في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. يمكن أن يكون مؤقتاً البروتوكول هنا والمجففة الحمض النووي الكريات يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام مع غطاء أنبوب مغلق.
استثارة للحمض النووي الفيروسي في المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات
1. حل الكريات الحمض النووي في ميليلتر 120 كل من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات التي تهز كل أنبوبة مدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
اسطوانة دوت
1. إعداد معايير الحمض النووي بلازميد
  1. تمييع إف ناقلات الجينوم بلازميد الحمض النووي إلى 10 نانوغرام/ميليلتر في الماء أو في المخزن المؤقت تريس-HCl (10 ملم، ودرجة الحموضة 8.0). يستغرق 25 ميليلتر من هذا التخفيف وهضم مع إنزيم التقييد ملائمة ح 1 لينيريزي بلازميد الحمض النووي، وفي حجم رد فعل من 50 ميليلتر.
    ملاحظة: نقدم مجموعة مكررة من الهضم (راجع الخطوة 3.6.4.1). إنزيم المناسبة ينبغي أن تكون تخفيضات بلازميد الحمض النووي خارج المنطقة ملزمة التحقيق دوت وصمة عار. للراحة، يمكن أن تكون الكوتيد (25 ميليلتر/أنبوب) الحمض النووي بلازميد المخفف وتخزينها مجمدة في-20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. هضم بلازميد الحمض النووي بينما تهز الأنابيب في خطوة 3.5.1. لا هضم الإفراط بلازميد الحمض النووي القياسية.
  2. إضافة 450 ميليلتر من الماء أو الشركة المصرية للاتصالات إلى أنبوب يحتوي على بلازميد هضم الحمض النووي القياسية ومزيج دقيق. نقل 70 ميليلتر من هذا الخليط إلى أنبوب 1.5 مل ميكروسينتريفوجي جديدة مع 1,330 ميليلتر من الماء أو الشركة المصرية للاتصالات لجعل معيار بلازميد مخفف (25 جزء من الغرام/ميليلتر).
  3. اتبع الجدول 4 إنشاء مجموعة من شقين هما تخفيف المسلسل (600 ميليلتر في الأنبوب). مزيج تخفيف جيدا قبل فورتيكسينج ل 5 ق.
2. يشوه المعايير وعينات الحمض النووي الفيروسي
  1. إضافة 600 ميليلتر من 2 × حل القلوية إلى تمييع كل معيار. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج عن 5 إلى 10 س. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  2. إضافة ميليلتر 120 2 × حل القلوية لكل عينة الحمض النووي الفيروسي. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج عن 5 إلى 10 س. إينكوباتي في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
3. إعداد جهاز وصمة عار دوت
  1. باستخدام مقص، قص غشاء النشاف (مثلاً، زيتا-التحقيق) إلى حجم مناسب لعدد العينات والمعايير. نقع الغشاء بالماء لمدة 10 دقائق قبل وضعه على جهاز وصمة عار دوت. تغطية الآبار غير المستخدمة على جهاز الغشاء.
    ملاحظة: التعامل مع الغشاء بملاقط نظيفة. لتغطية الآبار فارغة، يمكن استخدام الضوء الأزرق حماية الورقة التي تأتي مع الغشاء. لا تسمح للغشاء لتجف قبل عينات والمعايير الملزمة. لمزيد من التفاصيل عن الجمعية واستخدام الجهاز، الرجاء الرجوع إلى دليل المستخدم¹⁹.
  2. إضافة المياه إلى الآبار التي سيتم تحميل عينات. تطبيق فراغ وسحب المياه عن طريق الآبار التحقق من وجود أخطاء وتجربتها عندما ثابتة. إعادة تشديد الخناق أثناء تطبيق فراغ لضمان ختم ضيق.
    ملاحظة: قد يسبب الختم ناقصة التسرب عينة بين الآبار.
  3. متى يتم سحب المياه تماما من خلال، الإفراج عن الفراغ تماما (أيالمتشعبة فراغ ينبغي أن يكون مفتوحاً لضغط الهواء).
4. تحميل المعايير وعينات إلى جهاز وصمة عار دوت
  1. تطبيق 400 ميليلتر من كل المخفف بلازميد الحمض النووي القياسية لكل بئر، وتشغيل أربع حارات لتخفيف القياسية. استخدام مختبرين منفصلة اثنين من الخلاصة القياسية وتحميل كل تكرار. تطبيق من كل عينة الحمض النووي الفيروسي 200 ميليلتر/جيدا.
    ملاحظة: باستخدام ميليلتر ~ 40 المتبقية من عينات التشويه والتحريف، يمكن إعداد (مثلاً، إذ عينات المخفف باستخدام 20 ميكروليتر من عينة بالإضافة إلى ميليلتر 180 1 × حل القلوية) عينات المخفف ومسح إذا لزم الأمر.
  2. تطبيق لطيف فراغ لسحب الحلول الحمض النووي عن طريق البئر.
    ملاحظة: لطخة فراغ الضغط يحتاج إلى تعديل عن طريق فتح صمام ثلاثي جزئيا حتى يتم تطبيق الضغط فراغ للنقطة الجهاز فضلا عن الغلاف الجوي (أي، مع محبس الحنفية الأسلحة المتمركزة في زاوية 45 درجة تقريبا حيث أنها يجعل من ضوضاء شفط أعلى صوتا).
  3. بمجرد أن تفرغ جميع الآبار، الإفراج عن الفراغ بضبط صمام ثلاثي. إضافة 400 ميليلتر من 1 × حل القلوية لكل بئر التي تتضمن معايير والعينات. انتظر لمدة 5 دقائق قبل إعادة تطبيق فراغ لإفراغ الآبار.
  4. إعادة تطبيق الفراغ بنفس الطريقة (راجع الخطوة 3.6.4.2).
  5. تفكيك جهاز وصمة عار دوت تحت الفراغ وإزالة الغشاء وشطفه مع 2 x SSC. مكان الغشاء على منشفة ورقية نظيفة مع الجانب ربط الحمض النووي مواجهة لإزالة الزائدة 2 x SSC.
  6. الأشعة فوق البنفسجية-التشعب الحمض النووي بلوتيد للغشاء مع كروسلينكير الأشعة فوق البنفسجية ملائمة؛ الغشاء جاهز الآن التهجين.
    ملاحظة: يمكن استخدام الأغشية الرطبة للأشعة فوق البنفسجية كروسلينكينج. المجففة، يمكن تخزين الأغشية كروسلينكيد الأشعة فوق البنفسجية في درجة حرارة الغرفة. يمكن الاطلاع على المزيد من المعلومات في الجدول للمواد.
التهجين والغسيل
1. الاحماء "المخزن المؤقت التهجين" في حمام مائي 65 درجة مئوية.
2. انزيماتيكالي تسمية مجس الحمض النووي مع³²ف دكتب المشعة α-وتنقية باستخدام مجموعات المتاحة تجارياً وفقا لتوصية الشركة المصنعة.
  ملاحظة: نحن نستخدم تحقيق من 0.5-2.0 كيلو بايت في طول من منطقة مروج محسن أو تسلسل البروتين الترميز في الجينوم الفيروسي. على الرغم من أن هذا البروتوكول يستخدم ³²ف المسمى المجسات المشعة للكشف عن إشارة، يمكن أيضا استخدام المسابير تشيميلومينيسسينت أو الفلورية غير مشعة (الرجاء الرجوع إلى قسم النقاش ).
3. وضع الغشاء في زجاجة تهجين مع الجانب الحمض النووي زمنياً يصل، وشطف الغشاء مع 5 مل بريوارميد المخزن المؤقت التهجين، وتجاهل المخزن المؤقت. ثم أضف 10 مل من بريوارميد "التهجين المخزن المؤقت" ووضع الزجاجة في فرن تهجين الدورية المحددة عند 65 درجة مئوية. تدوير لدقيقة إيه فايف.
4. الحرارة تؤذي 20 ميليلتر الرنجة 10 ملغ/مل المنفصمة أو الحيوانات المنوية السلمون الحمض النووي الحل و ³²المسمى ف التحقيق (إيه وان زيرو⁷ cpm) لمدة 5 دقائق قبل وضع الأنابيب في مجموعة كتلة حرارة عند 100 درجة مئوية. ثم البرد المفاجئة لهم على الجليد إيه تو دقيقة، تدور بإيجاز، والحفاظ على الجليد حتى الاستخدام.
  تنبيه: لتحقيقات الحمض النووي المشعة، يجب استخدام أنابيب 1.5 مل مع سداده ملولبة والدائري.
5. بسرعة إضافة الحمض النووي في الحيوانات المنوية التشويه والتحريف ومسبار المشعة إلى "المخزن المؤقت التهجين" في التهجين زجاجة ويهز الزجاجة 10 s المزيج. العودة الزجاجة للفرن 65 درجة مئوية واحتضان الزجاجة بالتناوب في 65 درجة مئوية ح إيه فور.
6. بمجرد اكتمال التهجين، وقف التناوب وإزالة زجاجة التهجين، وثم صب الحل مسبار المشعة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل مع غطاء ختم توصيل مانعة للتسرب. تخزين المسبار في حاوية مناسب وضعها في ثلاجة مخصصة للمواد المشعة.
  ملاحظة: يستخدم "المخزن المؤقت التهجين" مع تحقيق الذي يتم تخزينه على 4 درجة مئوية يمكن إعادة استخدام 5 مرات على الأقل بوضع أنبوب 50 مل مخروطية الشكل مع غطاء ختم توصيل مانعة للتسرب الذي يحتوي على "المخزن المؤقت التهجين" في حمام مائي 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
7. يغسل الغشاء مع "المخزن المؤقت ليغسل" تسخينها إلى 65 درجة مئوية. إضافة 20 إلى 30 مل من "المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي" إلى الزجاجة التهجين وتدوير لأدنى 5 تكرار هذا يغسل 2 مرات أكثر.
  ملاحظة: قياس النشاط الإشعاعي لحلول المياه والصرف الصحي، وأنه سجل إذا لزم الأمر بالمعهد المحلي.
8. بينما غسل الغشاء، مكان فوسفور تصوير الشاشة على صورة ممحاة لمدة 5 دقائق.
9. بعد يغسل الثالثة، إزالة الغشاء من زجاجة التهجين وإزالة المخزن المؤقت الزائدة على الغشاء مع مناشف ورقية ومكان الغشاء في حامل ورق بلاستيك الشفاف. فحص الإشارات الإشعاعية على الغشاء باستخدام عداد غايغر. تعرض الشاشة الفوسفور تمحى التصوير للغشاء لمدة 10 دقيقة بين عشية وضحاها اعتماداً على كثافة إشارة.
10. مسح الشاشة باستخدام صورة فوسفور فحص النظام والحصول على البيانات المتعلقة بكثافة إشارة لكل نقطة.
تحليل البيانات
1. رسم منحنى قياسي باستخدام برمجيات تحليل البيانات وجداول البيانات (مثلExcel).
  ملاحظة: استخدم الانحدار الخطي سجل في سجل لرسم منحنى قياسي.
2. تحديد نانوجرام المكافئ (نانوغرام مكافئ) لكل من عينات الحمض النووي الفيروسي بالاستيفاء. أن نانوغرام مكافئ هو مقدار بلازميد الحمض النووي يستخدم لرسم منحنى قياسي الذي يعادل عدد جزيئات الحامض النووي الفيروسي. عندما يكون طول بلازميد الحمض النووي 8,000 bp، 1 نانوغرام مكافئ واحد-الذين تقطعت بهم السبل إف الحمض النووي الفيروسي يناظر 2.275 × 10⁸ الجسيمات.
  ملاحظة: يمكن تحويل نانوغرام مكافئ لعدد الجسيمات الفيروسية بالمعادلات التالية:
  
  عدد الجسيمات إف هي تقليديا معبراً عنها "جيد جداً" (ناقل الجينوم) أو "DRP" (الدناز أنا مقاومة الجزيئات).
3. حساب تركيزات المواد انطلاق إف. لأن الحمض النووي الفيروسي بلوتيد تمثل 66.7 في المائة من الحمض النووي الفيروسي في مواد البدء، يناظر 1 نانوغرام مكافئ 1.7 × 10⁹ جزيئات/مل .
  ملاحظة: هذا التصحيح غير مطلوب إذا كان يتم مسح جميع الحمض النووي الفيروسي الواردة في المواد انطلاق في غشاء دون فقدان (انظر الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد ممثل نتيجة البقع دوت الكمي كوانتيتيشن المنقي الأرصدة ناقل إف إنتاجها على نطاق واسع في الشكل 1. مع هذه المقايسة دوت وصمة عار، تم تحديد عيار مخزون ناقلات مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل AAV2G9-CMV-التجارة والنقل. وكان تنقية الموجه بجولتين من كلوريد السيزيوم (CsCl) تنبيذ فائق الكثافة--التدرج متبوعاً بغسيل الكلي كما هو موضح سابقا²⁰. بشكل عام، لتنقية مخزونات ناقل إف، ثلاثة أحجام مختلفة لكل سهم متجه إف (مثلاً، ميليلتر 0.3، ميليلتر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في هذا التقرير، الأداة المساعدة لفحوصات وصمة عار دوت الكمية لدراسة "آبس إف" ودورهم في الجمعية قفيصه. يمكن أن توفر المعارف المكتسبة من هذه الدراسات التفصيلية ثاقبة الاختلافات الفطرية عملية الجمعية قفيصه إف ودور AAPs الوظيفية بين الأنماط المختلفة. وفي هذا الصدد، لطخة دوت عبر التكامل إف VP3-الوكالة الأسترالية المقايسة وكشفت عن أن الأفعى إف VP3 عرض تبعية صارمة على التعبير المشترك عن الوكالة الأسترالية المشابهة للجمعية قفيصه وأن "الوكالة الأسترالية الأفعى" لا تشجع الجمعية قفيصه للقاح مغايرة . هذه الملاحظة مثير للاهتمام ل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر شياو شياو في جامعة كارولينا الشمالية في تشابل هيل لتزويدنا بلازميد بيمبل-CMV-التجارة والنقل. ونشكر كريستوفر تشنغ وصمويل هوانغ جيه لقراءة نقدية من المخطوطة. أيد هذا العمل منح "دائرة الصحة العامة" (المعاهد الوطنية للصحة R01 NS088399 و T32 EY232113).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Benzonase	MilliporeSigma	1016970001	يشار إليه باسم Serratia marcescen endonuclease< / em> في النص الرئيسي.
يشار إلى DNase I	Roche	4716728001	باسم DNase I إنزيم A في النص الرئيسي.
يشار إلى DNase I	invitrogen	18047019	باسم DNase I Enzyme B في النص الرئيسي.
DNase I	New England Biolabs	M0303L	يشار إليها باسم DNase I Enzyme C في النص الرئيسي.
1.5 مل مرفق O-Ring برغي كاب أنابيب الطرد المركزي	الدقيقة Corning	430909
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي	الدقيقة Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين	Corning	352097
3 M أسيتات الصوديوم	Teknova	S0298
50 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين	Corning	430291
AAV-293 Cells	Agilent	240073	HEK-293 خط خلايا محسن لتغليف فيريونات AAV.
AccuGENE 0.5 M EDTA Solution	Lonza	51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0	Lonza	51238
AccuGENE 10٪ SDS	Lonza	51213
AccuGENE 1X TE Buffer	Lonza	51235
Bio-Dot Device	Bio-Rad	1706545
ألبومين مصل الأبقار	MilliporeSigma	A3294
رافع الخلية	Corning	3008
Chloroform	MilliporeSigma	372978
مستخرج الحمض النووي	Wako Pure Chemical Industries	295-50201	يستخدم هذا للبقع النقطية الكمية على الفيروس المنقى. نستخدم نصف حجم جميع الكواشف فقط في كل خطوة موصى بها لمخطط البروتوكول 2 في الدليل المقدم من الشركة المصنعة.
دولبيكو s النسر المعدل المتوسط (DMEM) - نسبة عالية من الجلوكوز (4.5 جم / لتر)	Lonza	12-614F
ElectroMAX DH10B خلايا	Thermo Fisher Scientific	18290015
الإيثانول 200 Proof	Decon Labs	2716
مصل الأبقار الجنيني	VWR	1500-500
Ficoll 400	Alfa Aesar	B22095	يشار إليه باسم Polysucrose 400.
مجهر مضان	Zeiss	Axiovert 40 CFL
Glycogen	Roche	10901393001
الرنجة المنوية DNA	Invitrogen	15634-017
أنابيب التهجين	Thermo Fisher Scientific	13-247-150
ImageQuant TL	GE Healthcare Life Sciences	ImageQuant TL
L-glutamine 200 mM	Lonza	17-605E
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات	MilliporeSigma	M0250
MicroPulser Electroporator	Bio-Rad	1652100
أعمدة الحمض النووي السريعة البسيطة	MilliporeSigma	11814419001
pAAV-RC2 Vector	Cell Biolabs Inc	VPK-422
Penicillin / Streptomycin 10K / 10K	Lonza	17-602E
فوسفات مخزن محلول ملحي	لونزا	17-516F
كاسيت التعرض للتصوير الفوسفوري	GE علوم الحياة للرعاية	المختلفة
شاشة التصوير الفوسفوري	GE Healthcare Life Sciences	مجموعة البلازميد ماكسي
	كيت QIAGEN	12162
البلاتين Pfx DNA Polymerase	Invitrogen	11708013
Polyethylenimine	Polysciences Inc	23966-2
Polyvinylpyrrolidone	MilliporeSigma	P5288
Prime-It II مجموعة وضع العلامات التمهيدي العشوائي	Agilent Technologies	300385
التمهيدي AAP Forward (N_{25< / sub> النيوكليوتيدات من النيوكليوتيدات الرابعة في AAP ORF ، RE1 هو موقع إنزيم تقييد للاستنساخ): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGA CGACGATGACAA-N₂₅}	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer AAP Reverse (N_{25< / sub> هو آخر 25 نيوكليوتيد من AAP ORF ، RE2 هو موقع إنزيم تقييد للاستنساخ): TCTT-RE2-N_{25< / sub>}}	MilliporeSigma	التمهيدي
المخصصالتمهيدي VP3 إلى الأمام (N_{25< / sub> أول 25 نيوكليوتيد من VP3 ORF ، RE1 هو موقع إنزيم تقييد للاستنساخ): CTAA-RE1-CACC-N_{25< / sub>}}	MilliporeSigma	Custom Primer
Primer VP3 Reverse (N_{25< / sub> هو آخر 25 نيوكليوتيد من AAP ORF ، RE2 هو موقع إنزيم تقييد للاستنساخ): TCTT-RE2-N_{25< / sub>}}	MilliporeSigma	مخصص التمهيدي
بروتيناز K Solution	Invitrogen	25530-049
إنزيمات التقييد نيو	إنجلاند بيولابرز	مختلف
السلمون المنوية الحمض	النووي Invitrogen	15632011
الماصات المصلية	Thermo Fisher Scientific	13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
كلوريد الصوديوم	ثيرمو فيشر Scientific	S271-10
سترات الصوديوم ثلاثية القاعدة ثنائي الهيدرات	MilliporeSigma	C8532
T4 DNA Polymerase	New England Biolabs	M0203L
Thermal Cycler	Eppendorf	6321000515
الأنسجة المعالجة 6-well لوحة	Corning	353046
تريس بيس	ثيرمو فيشر Scientific	BP152-5
تايفون FLA 7000	GE Healthcare Life Sciences	28955809
UltraPure Waste-Saturated Phenol	Invitrogen	15513-047
	المتقاطع الأمثل للأشعة فوق البنفسجية	XLE-1000	، مما يوفر جرعة طاقة للأشعة فوق البنفسجية تبلغ 120 مللي جول / سم < سوب > 2 < / sup>.
غشاء زيتا بروب	بيو	راد 162-0165

مجموعة الصحية زراعة يتم استخدام وضع الربط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonntag, F., Schmidt, K., Kleinschmidt, J. A. A viral assembly factor promotes AAV2 capsid formation in the nucleolus. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (22), 10220-10225 (2010).
Sonntag, F., et al. The assembly-activating protein promotes capsid assembly of different adeno-associated virus serotypes. J Virol. 85 (23), 12686-12697 (2011).
Naumer, M., et al. Properties of the adeno-associated virus assembly-activating protein. J Virol. 86 (23), 13038-13048 (2012).
Earley, L. F., et al. Identification and characterization of nuclear and nucleolar localization signals in the adeno-associated virus serotype 2 assembly-activating protein. J Virol. 89 (6), 3038-3048 (2015).
Kawano, Y., Neeley, S., Adachi, K., Nakai, H. An experimental and computational evolution-based method to study a mode of co-evolution of overlapping open reading frames in the AAV2 viral genome. PLoS One. 8 (6), e66211(2013).
Earley, L. F., et al. Adeno-associated Virus (AAV) Assembly-Activating Protein Is Not an Essential Requirement for Capsid Assembly of AAV Serotypes 4, 5, and 11. J Virol. 91 (3), (2017).
Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
Clark, K. R., Liu, X., McGrath, J. P., Johnson, P. R. Highly purified recombinant adeno-associated virus vectors are biologically active and free of detectable helper and wild-type viruses. Hum Gene Ther. 10 (6), 1031-1039 (1999).
Samulski, R. J., Chang, L. S., Shenk, T. Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses: normal integration does not require viral gene expression. J Virol. 63 (9), 3822-3828 (1989).
Wobus, C. E., et al. Monoclonal antibodies against the adeno-associated virus type 2 (AAV-2) capsid: epitope mapping and identification of capsid domains involved in AAV-2-cell interaction and neutralization of AAV-2 infection. J Virol. 74 (19), 9281-9293 (2000).
Grimm, D., et al. Titration of AAV-2 particles via a novel capsid ELISA: packaging of genomes can limit production of recombinant AAV-2. Gene Ther. 6 (7), 1322-1330 (1999).
Sommer, J. M., et al. Quantification of adeno-associated virus particles and empty capsids by optical density measurement. Mol Ther. 7 (1), 122-128 (2003).
Fagone, P., et al. Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved alternative methods. Hum Gene Ther Methods. 23 (1), 1-7 (2012).
Farkas, S. L., et al. A parvovirus isolated from royal python (Python regius) is a member of the genus Dependovirus. J Gen Virol. 85 (Pt 3), 555-561 (2004).
NEB, 2017-2018 Catalog & Technical Reference. , New England Biolabs. 302-368 (2017).
Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
Addgene. Bacterial Transformation. , Available from: https://www.addgene.org/protocols/bacterial-transformation/ (2017).
Addgene. Sequence Analysis of your Addgene Plasmid. , Available from: https://www.addgene.org/recipient-instructions/sequence-analysis/ (2017).
Bio-Rad. Bio-Dot® microfiltration apparatus instruction manual. , Available from: http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1706545.pdf (2017).
Burton, M., et al. Coexpression of factor VIII heavy and light chain adeno-associated viral vectors produces biologically active protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (22), 12725-12730 (1999).
Grimm, D., Pandey, K., Kay, M. A. Adeno-associated virus vectors for short hairpin RNA expression. Methods Enzymol. 392, 381-405 (2005).
Leonard, J. N., Ferstl, P., Delgado, A., Schaffer, D. V. Enhanced preparation of adeno-associated viral vectors by using high hydrostatic pressure to selectively inactivate helper adenovirus. Biotechnol Bioeng. 97 (5), 1170-1179 (2007).
Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Ther Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
Werling, N. J., Satkunanathan, S., Thorpe, R., Zhao, Y. Systematic Comparison and Validation of Quantitative Real-Time PCR Methods for the Quantitation of Adeno-Associated Viral Products. Hum Gene Ther Methods. 26 (3), 82-92 (2015).
Kafatos, F. C., Jones, C. W., Efstratiadis, A. Determination of nucleic acid sequence homologies and relative concentrations by a dot hybridization procedure. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1541-1552 (1979).
Reue, K. mRNA quantitation techniques: considerations for experimental design and application. J Nutr. 128 (11), 2038-2044 (1998).
Clementi, M., et al. Quantitative PCR and RT-PCR in virology. PCR Methods Appl. 2 (3), 191-196 (1993).
Mezzina, M., Merten, O. W. Adeno-associated viruses. Methods Mol Biol. 737, 211-234 (2011).
Chen, W. J., Liao, T. H. Structure and function of bovine pancreatic deoxyribonuclease I. Protein Pept Lett. 13 (5), 447-453 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AAV

مقايسة دوت كمية وصمة عار لمعايرة إف واستخدامها لتقييم وظيفي للفيروسات المرتبطة بالغدة الجمعية-تفعيل البروتينات

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة