والمبيض المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية المتخصصة التنمية. ولو تم نشر أساليب لتشريح المبايض اليرقات والكبار، تتطلب تشريح المبيض الخوادر التقنيات المختلفة التي لم تنشر بالتفصيل. هنا أننا مخطط بروتوكول لتشريح وتلطيخ، وتصاعد المبايض الخوادر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
على عكس الكبار المورفولوجية المبايض، المبايض الخوادر صعبة نسبيا الوصول ودراسة سبب هذه الصغيرة الحجم، وترانسلوسينسي، وغلفت ضمن حالة الخوادر. ويكمن التحدي لتشريح المبايض الخوادر أيضا في موقعها الفعلي داخل الخادرة: المبيض محاطة بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ويجب إزالة هذه الخلايا الدهنية للسماح لتلطيخ جسم سليم. للتغلب على هذه التحديات، يستخدم هذا البروتوكول بيبيتس باستور مخصصة لاستخراج خلايا الجسم الدهون من البطن الخوادر. وعلاوة على ذلك، يستخدم كوفيرجلاس غرف بدلاً من أنبوب ميكروسينتريفوجي أثناء عملية المصبوغة لتحسين الرؤية الخوادر. ومع ذلك، على الرغم من هذه المزايا الأخرى للأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول، والتنفيذ الناجح لهذه التقنيات قد تنطوي على لا تزال عدة أيام من الممارسة نظراً لصغر حجم المبايض الخوادر. يمكن تطبيق التقنيات المبينة في هذا البروتوكول على تجارب دورة الوقت الذي يتم تحليل المبايض في مراحل مختلفة من التنمية الخوادر.
المقدمة
بحوث الخلايا الجذعية باستخدام المبايض المورفولوجية وسعت على نطاق واسع منذ أول الوثائق المتعلقة بالخلايا الجذعية المتخصصة1،2،،من34. بعد وضع النسب تتبع الأدوات الوراثية، المبيض المورفولوجية تشريح استخدمت عادة لدراسة الأنساب الخلايا الجذعية، ويشير إلى الممرات التي تنظم صيانة الخلايا الجذعية، والانتشار، ومصير الخلايا الجذعية المتخصصة. قد تسفر عن المعرفة من هذه المسارات إشارات ثاقبة الأسباب المحتملة للسرطانات التي تنشأ من الخلايا الجذعية الشاذة النشاط5،،من67. لقد ثبت مؤخرا أن الخلايا الجذعية الجسدية في المبيض المورفولوجية ، المعروفة باسم الخلايا الجذعية جريب (التابعة)، بقوة تشبه الخلايا الجذعية المعوية الثدييات في جوانب كثيرة من تلك المنظمة8. لهذا السبب، المبايض المورفولوجية نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة سلوك الخلايا الجذعية.
بينما المبايض اليرقات والكبار تقديم أدلة للإسراع بتطوير الخلايا الجذعية والمنظمة نهائياً من الخلايا الجذعية في المكانة، على التوالي، المبيض الخوادر هو هيكل وسيطة التي germline وخلايا جسدية إعادة تنظيم وتحديد هوياتهم 9 , 10-على الرغم من أن العديد من الدراسات قد درست جوانب التنمية أنسجة المبيض الخوادر10،11،،من1213، تبقى الأسئلة المتعلقة بالتمايز ومنظمة المكانية أنواع خلية المبيض أثناء تطوير الخوادر. على وجه الخصوص، مواصفات التابعة يحدث خلال هذه الفترة. هذا البروتوكول يحدد طريقة لتشريح وتلطيخ المبايض الخوادر في النقاط الزمنية المطلوبة – تقنية التي يمكن استخدامها في تجارب دورة الوقت أن تحليل التنمية المبيض الخوادر بالتفصيل من اليرقات إلى مرحلة الكبار.
يستخدم هذا البروتوكول لحساب حجم صغير وترانسلوسينسي، وصعوبة الوصول إلى المبيض الخوادر داخل البطن الخوادر، أدوات مثل مصنوعة خصيصا بيبيت باستور رقيقة-يميل إلى إزالة أنسجة الجسم الدهون البطن التي تعرقل وصول الأجسام المضادة المبيض. كوفيرجلاس واضحة، وغرف المستخدمة خلال جسم تلطيخ رؤية عروض أكبر في الخوادر ومنصة الطف لهزاز المبايض في "نوتاتور". بناء على بروتوكول لتشريح المبيض اليرقات ميمون وجلبوا14، استخدمت في الخطوات الأولى للإجراء المصبوغة إلى أقصى حد ممكن الوصول غشاء الخلية بيرميبيليزيشن والأجسام المضادة لتركيزات عالية نسبيا من X-100 تريتون خلايا المبيض.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-اجلايينج
- تجمع حوالي عشرة الذكور والإناث خمسة عشر الكبار من الذباب المورفولوجية للنمط الوراثي المطلوب في قنينة الطعام يطير الغنية العادي وتستكمل مع الخميرة. لتجنب الازدحام القنينة، السماح بتفعيل الإناث وضع البيض لمدة لا تزيد على 2 – 4 ح14.
- نقل الكبار من القنينة في قنينة جديدة بالتنصت على القنينة فتح ضد قنينة مختلفة مع الغذاء يطير. السماح للبيض أن تتطور إلى اليرقات في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أيام.
2-اختيار الإناث اليرقات
- باستخدام فرشاة رطبة غرامة مع شعيرات ناعمة، جعل حركة متجددة مع الفرشاة على طول الجدار القنينة لنقل تجول اليرقات الطور الثالث من القنينة إلى زجاج مليئة بأسنانها جيدا 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS). أغسل بقايا الطعام قبالة اليرقات بتحويلها إلى آخر كذلك مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x.
- فصل يرقات الذكور والإناث باستخدام الملقط. تحديد يرقات الذكور بزوج من الخصيتين كبيرة، جولة، وشفافة، جزءا لا يتجزأ من الجسم الدهون الجانب الأفقي للجسم ما يقرب من الثلثين إلى أسفل من النهاية الأمامية في15. الإناث اليرقات في المتوسط أكبر وشفافة أقل من الذكور، وتكون أصغر بكثير من الغدد التناسلية التي أكثر صعوبة للكشف عن.
- حدد ضد يرقات الذكور لجمع الإناث اليرقات. جمع الإناث على الأقل عشرة من البئر. وضع اليرقات الإناث في منفصلة أيضا مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x.
- استخدام الملقط لنقل اليرقات الإناث برفق في قنينة جديدة من المواد الغذائية الطازجة يطير تستكمل مع الخميرة.
- مكان القنينة مع الإناث اليرقات في مكان مظلم لتسهيل بوبارييشن16. وطوال اليوم، رصد اليرقات بوبارييشن. كما يشل كل يرقة ويتطور إلى بريبوبا، دائرة بريبوبا ضد القنينة وسجل الوقت التقريبي عندما تشكل أولاً في بريبوبا. تحديد بريبوباي بنتوء سبيراكليس الأمامي وتوقيت تشكيل بوباريوم17. السماح بريبوباي لوضع نقطة الوقت المطلوب (مقاسة بالساعات بعد تشكيل بوباريوم، الإدارة العامة الاتحادية).
ملاحظة: يمكن اعتبار أي الحيوان الذي يخضع تشكيل بوباريوم ضمن فاصل زمني حوالي 10 ح بريبوبا. تبدأ مرحلة الخوادر حوالي 12 ح بعد تشكيل بوباريوم بعد تساقط داخلية قد حدث.
3-إعداد الخوادر لتلطيخ جسم
-
وتشكل بيبيت زجاج رقيقة لاستخدامها في خطوات لاحقة للتخلص من الدهون في الجسم الخوادر.
- تذوب تلميح الزجاج بيبيت باستور على موقد بنسن. كما يذوب الزجاج، استخدام الملقط لسحب تلميح أفقياً بعيداً عن بقية بيبيت لتشكيل تلميح أرق.
- وبعد التبريد، قطع جزء صغير من تلميح بيبيت لتشكيل افتتاح دائري أنيق. إرفاق لمبة للنهاية الأخرى بيبيت.
- تحميل بيبيت مع برنامج تلفزيوني 1 x.
- لحصاد الخوادر، التي يتم لصقها بالجدار القنينة، تطبيق قطره صغيرة من الماء على طول منطقة الاتصال بين عذراء والقنينة. انتظر 1 – 2 دقيقة للسماح للبروتين تذوب الغراء قبل رفع خادرة قبالة الحائط بفرشاة رطبة غرامة بلطف. نقل عذراء لزجاج جيدا مليئة 1 x PBS. أهدى بئر واحدة كل عذراء لتجنب الاكتظاظ شكل جيد.
- الخلفي نهاية الخادرة مع زوج واحد من الملقط، بينما تتشبث بعناية الدموع الجزء الأمامي من القضية الخوادر مع زوج آخر حتى رئيس الخادرة مرئياً.
- قبضة الحافة الأمامية معظم الرأس الخوادر مع الملقط واجذب عذراء من مرافعته الخوادر.
ملاحظة: قد تسرب جزء من الجسم الدهون بها أثناء هذه العملية. - منفصلة وتجاهل النصف الأمامي من عذراء من النصف الخلفي حتى يبقى كيس البطن فقط.
-
استخراج خلايا الجسم الدهون من كيس البطن.
- فهم كيس البطن ضد أسفل البئر مع الملقط في يد واحدة بينما يمسك بيبيت الزجاج رقيقة مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x في جهة أخرى.
- وتهدف نصيحة بيبيت رقيقة نحو فتح الكيس وبطء بيبيت 1 x برنامج تلفزيوني في البطن ليغسل الجسم الدهون الخلايا المحيطة المبايض الخوادر.
ملاحظة: المبايض هي زوج من هياكل صغيرة وشفافة، striated ومستطيل التي ينبغي أن تبقى داخل كيس البطن. - يغسل الجسم الدهون الخلايا حتى على الأقل ثلثي الجسم الدهون ذهب أو حتى المبيضين مرئية قرب افتتاح كيس البطن. من المهم جداً تنفيذ هذه الخطوة ببطء حتى لا تتعرض ليغسل المبيض من البطن عن طريق الصدفة.
- تفحص البئر للتحقق إذا كانت المبايض قد تسرب خلال يغسل خلايا الجسم الدهون. إذا كانت المبايض غير مرئية داخل البئر، قد ظلت في البطن. إذا كان يخرج المبيض، ضع عذراء جديدة في البئر وكرر هذه الخطوة.
- نقل البطن إلى غرفة كوفيرجلاس واضحة مليئة بتثبيت المخزن المؤقت (PBS x 1، 4% بارافورمالدهيد) ووضع الغطاء في الأعلى. لضمان وجود عدد كاف من المبايض تحمل تلطيخ وعملية التركيب، تشريح المبايض أكثر من اللازم.
تنبيه: يحتوي المخزن المؤقت التثبيت بارافورمالدهيد سمية. يرجى ارتداء وسائل الحماية المناسبة مثل القفازات، ونظارات السلامة، إلخ.
4-إيمونوهيستوتشيميستري
- طوال عملية المصبوغة، استخدام الملقط لدفع بلطف أسفل أي المبايض عائمة إلى أسفل البئر الزجاج غطاء التأكد من أن المبايض مغمورة تماما في حل جسم.
- مكان يجرد من وجهي الشريط على سطح مسطح من نوتاتور ومن ثم ضع كوفيرجلاس غرف على سطح لاصق.
- احتضان المبايض في المخزن المؤقت للتثبيت من الخطوة 3، 7 لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- شطف المبايض ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1 x % 1 X-100 تريتون ل 5 و 10 و 45 دقيقة (ح 1 في المجموع)، على التوالي، للسماح بيرميبيليزيشن شامل.
- كتلة المبيض في مصل الماعز العادي 10% في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون لمدة 30 دقيقة.
- احتضان المبايض بين عشية وضحاها في 600 ميليلتر جسم الابتدائية المفضل المخفف بتركيز مناسب في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون في 4 درجات مئوية.
- شطف المبايض ثلاث مرات لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون.
- احتضان المبايض عن ح 2 في 600 ميليلتر من جسم الثانوي الاختيار المخفف بتركيز مناسب في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون في درجة حرارة الغرفة.
- شطف المبايض مرتين لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x مع 0.5% X-100 تريتون ومرة لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1 x.
5-تشريح وتركيب المبايض الخوادر
- ضع قطره صغيرة من برنامج تلفزيوني 1 x إلى شريحة مجهر. استخدام الملقط لنقل كيس البطن من كوفيرجلاس غرف لزجاج مليئة ببرنامج تلفزيوني 1 x. أهدى بئر واحدة كل عذراء لتجنب الاكتظاظ شكل جيد.
- تمزق كيس البطن وأي هيئة الدهون المتبقية مع الملقط.
ملاحظة: يجب أن تكون المبايض، وزوج من هياكل صغيرة وشفافة، striated ومستطيل، مرئية داخل البئر. المبايض هي غالباً محكم محاط بالجسم الدهون، ولذلك فمن المهم للتأكد من دقة تمزق جميع الدهون في الجسم عن بعضها البعض. - نقل المبيض من البئر إلى قطره من 1 x برنامج تلفزيوني في المجهر الشريحة باستيعاب وسط المبايض بين النصائح من الملقط. من المهم جداً استخدام من أحكام قبضتهم دون الضغط على المبايض حتى لا لتفقد أو تدميرها أثناء النقل. إضافة بضع قطرات من برنامج تلفزيوني 1 x إلى الشريحة عندما يجف الحل مع مرور الوقت.
- مرة واحدة تم تشريح ونقلها إلى الشريحة المجهر، ميليلتر بيبيت 40 متوسطة المتصاعدة على ساترة 22 مم × 22 مم، ومكان ساترة بلطف فوق المبايض المبايض جميع. واسمحوا الشرائح الجافة بين عشية وضحاها قبل التصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ينبغي أن يؤدي تنفيذ هذا الإجراء بنجاح في تلطيخ جسم واضح أن يكشف عن هيكل وتنظيم الخلوية من المبيض الخوادر المورفولوجية . يمكن استخدام إيمونوهيستوتشيميستري المبينة في هذا البروتوكول تحديد أنواع الخلايا الملون عادة في المبايض اليرقات والكبار. خلايا ساق الخوادر المستمدة من سرب الخلايا18 (حددها الثالث فاسسيكلين باللون الأبيض) وترد في الشكل 3. بالإضافة إلى تسليط الضوء على تنظيم المبايض الخوادر الخلوية، يمكن استخدام جسم تلوين المحددة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أن الخطوة الأكثر صعبة وحرجة من هذا البروتوكول ينطوي على إعداد الخوادر المبايض قبل التثبيت. للتأكد من أن المبايض، صغيرة ودفن بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ملطخة بما فيه الكفاية مع الأجسام المضادة، من المهم أن الدموع ليس فقط فتحه كبيرة في كيس البطن بالملقط، ولكن أيضا استخراج خلايا الجسم الدهون التي تعرقل المبايض من الأجسام المضادة. ويتطلب التنفيذ الناجح لهذه الخطوة تطبيقاً لضغوط خفية على لمبة بيبيت باستور بينما غسل خلايا الجسم الدهون من البطن كيس (خلايا الجسم الدهونمثل 1-2 وينبغي ترك البطن في الثانية أثن...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب قد لا يوجد تضارب في إعلان.
شكر وتقدير
كان يؤيد هذا البحث "المعاهد الوطنية للصحة" (RO1 GM079351 إلى D.K.). ونشكر دوروثيا Godt على نصيحتها مفيدة في تشريح المبيض الخوادر استناداً إلى بلدها الأصلي للبروتوكول. ونشكر أيضا ريلين إيمي لها المساعدة والتعليقات على المخطوطة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Dumont # 5 ملقط ، علم الأحياء | الأدوات العلمية الدقيقة | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| تشريح المجهر | نيكون | SMZ-10A | |
| مجهر متحد البؤر | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| التحليل | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 ألواح بقعة زجاجية للاكتئاب | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| لمبة ماصة باستور | بائعين مختلفين بائعين | ||
| موقد بنسن | بائعين مختلفون | ||
| شرائح مجهر بلوري فاخرة | ثيرمو فيشر Scientific | 12-544-2 | |
| 22 × 22 مم أغطية زجاجية رقم 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| شريط على الوجهين | سكوتش | ||
| نوتاتور | كلاي آدامز | ||
| فرشاة فاين # 0 ، # 3- # 5 | بائعون مختلفون مجموعة | ||
| جيلسون بيتمان كاتب | توماس F167300 العلمية | يحتوي على p20 ، p200 ، p1000 الماصات | |
| 16٪ بارافورمالديهايد | علوم المجهر الإلكتروني | 15710 | تمييع إلى 4٪ بارافورمالدهيد في 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | تمييع إلى 1x PBS |
| مصل الماعز العادي | Jackson | ImmunoResearch 5000121 | تمييع إلى 10٪ مصل ماعز طبيعي في PBST بتركيز |
| تريتون 0.5٪الأجسام المضادة الأولية (في البروتوكول: 7G10 المضاد للفاشيكلين III المخفف 1: 250 ، الأرانب المضاد للفوسفوهيستون H3 المخفف 1: 1000) بائعون | مختلفون (في البروتوكول: دراسات تنموية بنك الورم الهجين ، ميليبور) | مخفف في PBST بتركيز تريتون 0.5٪ | |
| الأجسام المضادة الثانوية (في البروتوكول: Alexa-546 ، مصل مضاد للأرانب مترافق FITC) بائعون | مختلفون (في البروتوكول: المجسات الجزيئية ، مختبرات جاكسون للأبحاث المناعية ، Inc.) | تمييع في PBST بتركيز تريتون 0.5٪ | |
| قوارير ذبابة كرات | قطنية دينفيل Scientific | V9406 | |
| ، للقوارير العريضة | جينيسي Scientific | 51-102W | |
| الخميرة ، الخبازين المجففة النشطة | MP Biomedicals | 101400 | |
| طباب الطعام | المنتج في المختبر | خليط من الماء ، خميرة البيرة ، دقيق الذرة ، دبس السكر ، أجار ، EtOH ، البنسلين ، ميثيل 4-هيدروبنزوات ، وحمض البروبيونيك | |
| ذباب ذكره وإناث ذبابة الفاكهة< / em> الذباب (النمط الجيني المستخدم في البروتوكول: yw; P [Fz3-RFP ، ث +] / TM2) مركز | مخزون بلومنجتون ذبابة الفاكهة |
المراجع
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45(2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537(2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52(2006).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
