Method Article

كشف حساسة للغاية وكمية من البروتينات وعلى إيسوفورمس بطريقة تركز Isoelectric الشعرية

DOI:

10.3791/56794

⸱

September 19th, 2018

1Uppsala University, Dept. Immunology, Genetics and Pathology, Rudbeck Laboratory, 751 85, Uppsala, Sweden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركز isoelectric الشعرية أسلوب المستندة إلى جسم، أولتراسينسيتيفي، وارتفاع إنتاجية، مما يتيح وصف مفصل للبروتينات وما إيسوفورمس من عينات بيولوجية ضئيلة للغاية. فيما يلي وصف لوضع بروتوكول للكشف والتحديد الكمي لبروتينات محددة وعلى إيسوفورمس بطريقة تلقائية و robotized.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أصبح Immunoblotting تقنية روتينية في العديد من المختبرات لتوصيف البروتين من العينات البيولوجية. ويوفر البروتوكول التالي استراتيجية بديلة، الشعرية isoelectric التركيز (سيف)، مع العديد من المزايا بالمقارنة مع إيمونوبلوتينج التقليدية. هذا هو أسلوب القائم على جسم الآلي والسريع، والكمية التي إجراء blotting غربية كاملة تجري داخل الشعرية سامسونج. هذا الأسلوب لا يتطلب هلام لنقل إلى غشاء، تجريد من البقع، أو الأشعة السينية الأفلام، الذي يشترط عادة ل immunoblotting التقليدية. وهنا يتم فصل البروتينات وفقا للتهمة (isoelectric نقطة؛ pI)، استخدام أقل من ميكروليتير (400 nL) من مجموع البروتين ليستي. بعد التفريد، البروتينات هي معطلة على جدران الشعيرات الدموية بالأشعة فوق البنفسجية العلاج الخفيفة، تليها الابتدائية والثانوية (الفجل البيروكسيديز (HRP) مترافق) حضانة الأجسام المضادة، يتم الكشف عن الذين ملزمة من خلال تعزيز تشيميلومينيسسينسي (الممنوعين)، توليد إشارة خفيفة يمكن التقاطها وتسجيلها بكاميرا جهاز اقتران (CCD). الصور الرقمية يمكن تحليلها وقياسها كمياً (منطقة الذروة) باستخدام البرمجيات. يمكن التعامل مع هذا الإجراء إنتاجية عالية 96 عينة في وقت واحد؛ هي حساسة للغاية، مع الكشف عن البروتين في مجموعة حلول؛ وتنتج النتائج استنساخه بدرجة عالية بسبب التشغيل الآلي للمكاتب. كل هذه الجوانب قيمة للغاية عندما تكون كمية العينات (مثلعينات الأنسجة والخزعات) عاملاً مقيداً. التقنية بالتطبيقات الأوسع نطاقا، بما في ذلك فحص للمخدرات أو الأجسام المضادة، واكتشاف العلامات البيولوجية، وأغراض التشخيص.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تركز isoelectric الشعرية (سيف) هو المناعة التلقائية المستندة إلى الشعرية، الذي يحل البروتينات على أساس هذه التهمة1،2،3. أنها استنساخه للغاية وقادرة على حل البروتينات و isoforms بوستترانسلاتيونالي المعدلة سرعة كما وكيفا. وهو يقدم بديلاً للأساليب التقليدية مثل النشاف الغربية. وفي حين النشاف الغربية جيدة جداً لتأكيد وجود وفرة من البروتينات في عينات متاحة؛ تقلب واستهلاك الوقت وجميع الحاضرين دقيقة كوانتيتيشن تحديات، ولا سيما عند فحص عينات الأنسجة البيولوجية. في الواقع، تقلب مشكلة متأصلة في النشاف الغربية، كما أن هناك العديد من الخطوات المعنية، مثل تحميل وتشغيل من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة المواد الهلامية، ونقل البروتينات إلى غشاء، حضانة مع الكواشف المختلفة (على سبيل المثال. والابتدائي والثانوي الأجسام المضادة، القامة)، والتنمية على الأشعة السينية الفيلم4. في الوقت الحاضر، هو تحسين تقنية blotting الغربية بتنفيذ التسجيل الرقمي للإشارات تشيميلومينيسسينت (الغرب الرقمية). في الآونة الأخيرة، نظام blotting غربية قد وضعت، إلا وهي شعري الغربي، ونظام أكثر خالية اليدين وخالية من جل. فحص كامل آليا بعد تحميل لوحة عينة (عينات مع جميع الكواشف اللازمة) إلى3،نظام4. الصك الذي سيتم تنفيذ كافة الخطوات مثل فصل البروتين، يغسل التثبيت بروتينات على الجدار الشعرية، والأجسام المضادة إينكوبيشنز، بين الخطوات المختلفة، والتنمية، والتقدير الكمي للإشارات تشيميلومينيسسينت. وهكذا، يوفر الإجراء سيف الذي قدم هنا أعلى من القرار وحساسية.

هذا الأسلوب الحساسة، كما يمكن إنشاء إشارات وكمية من بيكوغرامات من البروتينات1. حساسية عالية مع إمكانية تكرار نتائج ممتازة يجعل هذه التكنولوجيا مفيدة للغاية لتحليل العينات السريرية. يمكن الكشف عن فضلا عن التمييز بين وظيفة التعديل متعدية الجنسيات (مثلاً، isoforms مختلفة من البروتين فوسفوريلاتيد) من البروتينات. هذه التكنولوجيا قد استخدمت بنجاح لتشريح مختلفة مما يشير إلى مسارات4،5 في الدراسات السريرية التي تهدف إلى تطوير علاجات جديدة في سرطان3، وأنه يتمتع بإمكانات كبيرة لاكتشاف العلامات البيولوجية والمخدرات البروتين .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-الثقافة والتحفيز، وتحلل الخلية

ملاحظة: يمكن استخدام هذا الأسلوب مع العديد من أنواع الخلايا. ويرد لتوضيح الأسلوب، مثال على استخدام الخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس).

  1. والثقافة هوفيكس على المغلفة بالجيلاتين، أطباق بيتري 10 سم في المتوسط غشائي الخلايا القاعدية بمكملات مناسبة (انظر الجدول للمواد)، وأيضا يحتوي على 5 ٪ السفح، عامل نمو البشرة (5 نانوغرام/مل)، عامل نمو غشائي الأوعية الدموية (VEGF: 0.5 نانوغرام/ملليلتر) الأساسية صندوق الأجيال القادمة (10 نانوغرام/مل)، مثل الأنسولين عامل النمو (20 نانوغرام/ملليلتر)، الهيدروكورتيزون (0.2 ميكروغرام/مل)، وحمض الأسكوربيك (1 ميكروغرام/مل).
  2. تجويع الخلايا بين عشية وضحاها مع غشائي الخلايا القاعدية المتوسطة تستكمل مع السفح 1% ولا الملحق عامل النمو.
  3. نضح المتوسطة جميع، وإضافة 2 مل من الخلية البطانية الثقافة المتوسطة دون عوامل النمو (المجاعة المتوسطة) في صحن واحد (التحكم)، ثم إضافة 50 نانوغرام/مل VEGF في 2 مل من المجاعة الثقافة المتوسطة في طبق ثان لمدة 7 دقائق.
  4. نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرات 2 مع درجة حرارة الغرفة 10 مل برنامج تلفزيوني.
  5. التأكد من أن أطباق بيتري على الجليد وإبقائهم هناك من هذه الخطوة فصاعدا.
  6. إضافة 250-400 ميليلتر من الجليد الباردة تحلل المخزن المؤقت (بيسين/الفصول؛ انظر الجدول للمواد) المانع حوزتي مائي تحتوي على مزيج ومزيج المانع [دمس] (مثبطات الفوسفاتيز؛ انظر الجدول للمواد) لكل لوح 10 سم. دوامة اللوحة ضمان التغطية المناسبة والاحتفاظ بها لمدة 10 دقائق على الجليد.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون تركيز النهائي من مبطلات ومزيج المانع [دمس] س 1.
  7. تتخلص الخلايا من الطبق مكشطة الخلية ونقل إلى برود قبل [ميكروفوج] أنابيب. "الماصة؛" أعلى وأسفل 5 مرات الخلايا.
  8. باختصار sonicate الخلايا عند 4 درجة مئوية. تعيين سونيكاتور النحو التالي: عدد الدورات = 5، الطاقة = منخفض، على = 5 sec، قبالة = 30 ق. وترد هذه الخطوة كسر الأحماض النووية، وعدم الخلايا.
    ملاحظة: يجب أن يكون سونيكيشن خفيفة لمنع تمسخ البروتينات.
  9. دوامة الأنبوب 5 s (إلا بشكل مستمر)، 2 s في وقت (3 مرات)، والحفاظ على الجليد.
  10. توضيح ليستي بالطرد المركزي في 14,000 س ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية، ثم نقل المادة طافية على الفور إلى أنبوب نظيفة مبردة مسبقاً [ميكروفوج].
  11. قياس تركيز البروتين باستخدام حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) بروتين الإنزيم طقم4.
  12. جعل 10 ميليلتر مختبرين، الأداة تجميد في الثلج الجاف أو النتروجين السائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.

2-نموذج إعداد مزيج (حساب 150 ميليلتر عينة ميكس)

  1. أولاً، إعداد مزيج مادة عينة بإضافة 1 ميليلتر من مزيج المانع [دمس] (الأسهم 50 x) و 2 ميليلتر من مثبطات البروتياز (الأسهم 25 x) إلى 47 ميكروليتر من عينة مخفف (انظر الجدول للمواد)، حيث أن الأخيرة تركيز مثبطات [دمس] ومثبطات البروتياز يصبح 1 x. وبعد ذلك، يضعف ليساتيس البروتين باستخدام مزيج مادة العينة للحصول على التركيزات المطلوبة (راجع الخطوة 2، 3).
  2. إعداد مزيج مثبط البروتياز/أمفوليتي/سلم المانع/[دمس] عن طريق إضافة سلم 3.325 ميليلتر القياسية (انظر الجدول للمواد؛ الأسهم 60 x)، 6 ميليلتر من مثبطات البروتياز (25 س)، 3 ميليلتر من [دمس] (50 س) المانع لمواده أمفوليتي ميليلتر 137.675 (انظر الجدول من المواد). دوامة s الأنبوبة على الأقل 15 مجموع 5 s في وقت واحد (3-4 مرات)، والحفاظ على الجليد.
  3. مزيج الحلول من الخطوات 2.1 و 2.2 بنسبة 1:3، حيث أن التركيزات النهائية [دمس]، ومثبطات البروتياز، وسلم القياسية pI أصبح 1 X، والبروتينات في شعري الوصول إلى النهائي التركيزات المطلوبة (مثلاً، 50 ميكروغرام/مل واستخدمت ل الشكل 2).
    ملاحظة: تركيز البروتين في الشعرية وكذلك هي نفسها.
  4. تحميل 10 ميليلتر من مزيج عينة في البئر المناسبة، وفقا لتخطيط قالب المقايسة لوحة 384-جيدا (راجع الخطوة 3 و الشكل 1) والحفاظ على لوحة على الجليد.
  5. تمييع الأولية (pERK1/2، 01:50؛ ERK1/2، 1: 100؛ HSP 70، 1: 500) والأجسام المضادة الثانوية (رافعة) مع جسم مخفف (انظر الجدول للمواد) و "الماصة؛" 10 ميليلتر من الابتدائي و 15 ميليلتر من الأجسام المضادة الثانوية في كل بئر.
    ملاحظة: بشكل عام، تركيز أعلى من الأجسام المضادة المطلوبة لفحوصات سيف بالمقارنة مع البقع الغربية التقليدية.
  6. مزيج لومينول وأكسيد الشديد (نسبة 1:1؛ انظر الجدول للمواد) معا "الماصة؛" 15 ميليلتر في كل بئر.
    ملاحظة: تخلط هذه الحلول جديدة كل مرة قبل الاستخدام، والحفاظ على الجليد.
  7. مرة واحدة هي بيبيتيد العينات وجميع المواد الكاشفة في اللوحة، الطرد المركزي اللوحة في 2,500 س ز لمدة 10 دقيقة عند 4 درجة مئوية إزالة الفقاعات وتدور أسفل السائل. إذا كانت لا تزال توجد فقاعات، إزالتها يدوياً باستخدام تلميح ماصة رقيقة.
    ملاحظة: لا تقم بتحميل أكثر من 20 ميكروليتر من عينة أو الكواشف الواحدة جيدا؛ خلاف ذلك، لا يمكن أن تغسل ماصة الصك بشكل صحيح. تأكد من اتباع دليل التعليمات من الشركة المصنعة لإعداد جميع المواد الكاشفة.

3-تصميم قالب مقايسة جديدة مع برامج النظام (الشكل 1)

  1. فتح برامج النظام وانقر فوق "جديد" من القائمة ملف.
  2. انتقل إلى جزء تخطيط وتعيين مواقع الكواشف وعينات في صفيحة جيدا 384. استخدام ما يصل إلى حد أقصى آبار 96 كل لوح 384-جيدا.
  3. جعل مهمة كاشف بواسطة النقر فوق بئر في أي مكان في الكتلة. حدد كتلة 12 بئرا في كل صف. الآبار، مثلاً، من 1-12 أو 13-24، يتم تعيينها ككتلة بشكل افتراضي.
  4. انتقل إلى جزء من تخطيط شريط الأدوات وإدراج كتلة صف فارغ أو عينة، والابتدائية، والثانوية، أو كتلة الصف لومينول. يتم تعيين كل كتلة بلون مختلف، حيث تكون سهلة للتمييز.
    ملاحظة: عند النقر فوق بئر، يمكن رؤية حد أسود حول الكتلة حيث سيتم إدراج كتلة جديدة في الجزء. يمكن أيضا حذف كتلة صف.
  5. انتقل إلى جزء البروتوكول وحدد موقع كاشف في اللوحة. ثم، انقر فوق خلية في العمود نموذج وحدد الكاشف من القائمة المنسدلة.
  6. في هذا الشكل نفسه، حدد مواقع كاشف للابتدائي والثانوي، ولومينول لكل دورة.
  7. انقر فوق الخلايا، واحد في كل مرة، في العمود جسم أولية أو ثانوية، وتغيير أوقات الاحتضان، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: تلاحظ دخول لكل دورة يمكن أيضا أن تضاف.
  8. إضافة دورات عن طريق النقر فوق الزر 'إضافة' في قسم البروتوكول. 1 دورة أو دورات 4 دورات كل (يمكن إضافتها كحد أقصى 8 دورات في البروتوكول).
    ملاحظة: من الممكن لنسخ ولصق المعلومات بدوره في هذه الخطوة: حدد دورة، انتقل إلى تحرير، ونسخ ولصق.
  9. قم بإدخال المعلومات المتعلقة بالعينة، مثل هوية الأجسام المضادة الأولية والثانوية، وإعداد كتالوج وتخفيف،، إلخفي جزء القالب. هذا هو خطوة اختيارية مفيد أثناء تحليل ما بعد التشغيل.
  10. حفظ ملف الفحص الجديد. قبل النقر فوق الزر 'ابدأ'، بسرعة التحقق من التخطيط للتأكد من أن كل شيء الصحيح.

4-البروتوكول المتعلق بسيف "إعداد الصك"

  1. تعيين التفريد التركيز isoelectric الشعرية شروط الانفصال. ينبغي أن تكون هذه µW 000 15 و 40 دقيقة، وينبغي أن يكون وقت التثبيت الأشعة فوق البنفسجية 80 s. بيد أن الوقت التثبيت الأشعة فوق البنفسجية يمكن تعيين ضمن نطاق s 80-140 وقد تحتاج إلى الأمثل لبروتين الفائدة.
    ملاحظة: يمكن تعيين نقطة وقت للأشعة فوق البنفسجية التثبيت لكل دورة، ولكن ليس لكل شعري.
  2. مجموعة يغسل يغسل 1 إلى 2، 150 ق كل الغسيل (افتراضي)، وحضانة جسم الابتدائي لمدة 120 دقيقة.
  3. مجموعة يغسل يغسل 2 إلى 2، 150 ق كل الغسيل (افتراضي)، وحضانة جسم الثانوية لمدة 60 دقيقة.
  4. تعيين الغسيل 3، الذي ينبغي أن يغسل 2، 150 ق كل يغسل (افتراضي).
  5. تعيين أوقات التعرض متى سيتم الكشف عن تشيميلومينيسسينسي؛ وينبغي أن تكون هذه 30، 60، 120 و 240، 490، و 960 ق. ستنفذ في شعري واحد جميع الخطوات (1-8).

5-تشغيل الملف الإنزيم

  1. مرة واحدة كل شيء جاهزاً، انقر فوق ابدأ لبدء التشغيل. سيطالبك البرنامج بإزالة النفايات، لإعادة ملء الماء ومربع الشعرية، لإضافة الأنوليت والكاتوليت إلى علبة المورد، لإضافة المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، وأخيراً لتحميل اللوحة إلى علبة تبريد العينة.
    ملاحظة: إزالة الغطاء من مربع الشعرية، ولكن لا تقم بإزالة الغطاء من لوحة المقايسة. يمكن إزالة الغطاء من اللوحة تلقائياً بالصك عند الضرورة. وهذا يساعد على منع تبخر كاشف.
  2. تم بدء تشغيل بضع دقائق بعد التشغيل، سيتم عرض شريط المعلومات صك على شاشة الكمبيوتر. مركز الرسائل وأشرطة التقدم يمكن رؤية المقابلة للصك المرحلة الراهنة.
    ملاحظة: في البداية، هذا الصك سوف تحقق إذا كان كل شيء صحيحاً قبل الشروع في "الماصة؛" الأنوليت والكاتوليت في علبة الورق العازل وانتقاء أول كتلة من الشعيرات الدموية 12 وإزالة غطاء اللوحة ووضع العينات المأخوذة من العينة اللوحة إلى الشعيرات الدموية، ومن ثم أخيرا إلى غرفة الفصل الكهربي.
  3. انقر فوق تشغيل الشاشة ملخص لمشاهدة الجزئين: حالة والانفصال. يمكن للمستخدمين عرض التقدم التشغيل، ويمكن تخزين أفلام الفصل (12 الشعيرات الدموية لكل دورة) عند اكتمال الخطوة التفريد لكل دورة. لمراقبة فصل التفريد في مسرحية شعرية، فصل الفيلم لأن شعري بواسطة النقر فوق دورة المطلوب، ومن ثم على زر التشغيل في لوحة التحكم.
  4. ويمكن تخزين ملف التشغيل تلقائياً عند انتهاء التشغيل.

6-تحليل البيانات (S1 الشكل)

  1. فتح ملف التشغيل وقم بتحديد علامة التبويب شاشة التحليل. في S1A الشكل، من البيانات المعروضة (قمم) في نموذج الرسم البياني الشعرية المحددة (أي، الشعريةال 4 من دورة 1).
  2. انقر فوق تحرير، ومن ثم تحليل (S1B الشكل). في هذه المرحلة، المستخدمين يمكن تغيير نطاق بي تطبيق معيار بي مناسبة لتجربة معينة، إضافة إلى ذروة ملائمة وإضافة اسم ذروة.
    ملاحظة: عند استخدام أمفوليتي درجة حموضة 5-8 بريمكس (كما الحال هنا)، سلم القياسية الموصى بها لاستخدام واحد مع الببتيدات المسمى فلوريسسينتلي مع pIs من 4.9 و 6.0، 6.4، 7.0 و 7.3، وعند استخدام الرقم الهيدروجيني مواده 3-10، سلم الموصى به واحد مع pIs 4.0 ، 4.9، 6.0، 6-4، و 7.3. 2
  3. يتم عرض النتائج في علامة التبويب قمم؛ القيم المعروضة للعينات هي موقف pI، ذروة الارتفاع والمنطقة، % المنطقة، ذروة العرض وإشارة إلى الضوضاء (S/N) (رقم S1C). اختر البيانات المراد استخدامها، وتصدير البيانات لمزيد من التحليل.
    ملاحظة: يمكن فقط تصدير البيانات بعد وضع العلامات في الذروة (الشكل S1C).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصميم مقايسة جديدة: ويبين الشكل 1Aبتخطيط لوحة فحص. أقصى حد ممكن، يمكن استخدام الآبار 96 من لوحة 384-جيدا في كتل من 12 بئرا لكل شرط (الأجسام المضادة). يمكن أن تبدأ كل كتلة من 12 بئرا من A1-A12 أو A13-A24. الصفوف تم تلوينها تسمح بالتمييز بين العينات أو المواد الكاشفة عن بعضها البعض. في قالب المقايسة (الشكل 1B)، المعلومات ذات الصلة التي يمكن تخزينها مقايسة خاصة، التي يمكن استخدامها في مراحل لاحقة لتحليل النتيجة. و...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حساسية والقرار من البروتينات ذات أهمية حاسمة لبحوث البروتين في عينات بيولوجية. هناك قيمة كبيرة في كونه قادراً على الكشف عن البروتينات التي موجودة بكميات دقيقة في الخلايا. يمكن أن نقدم سيف تحسين حساسية والقرار للكشف عن البروتينات وعلى إيسوفورمس4.

هذه التكنولوجيا قد استخدمت بنجاح في العديد من البروتين بحوث تقارير5،،من67. ومع ذلك، العديد من القيود المرتبطة به، مثل حقيقة أن ليس كل ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد صاحب البلاغ لا الكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

صاحب البلاغ وذلك بفضل الأستاذ لينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا، السويد عن تأييدها لتطوير هذا المشروع. بالإضافة إلى ذلك، فضل صاحب البلاغ روس سميث ولينا كلايسون-الويلزية، جامعة أوبسالا لقراءة نقدية واقتراحات لتحسين هذه المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
NanoPro 1000ProteinSimple
Premix G2 ، درجة الحموضة 5 & ndash ؛ 8 (متداخلة) تدرج الفصل ، الرقم الهيدروجيني 2 & ndash ؛ 4 قابسبروتين بسيط040-972أمفوليت بريمكس
DMSO مثبطات مزيجبروتين بسيط040-510مثبطات الفوسفاتيز ؛ لتخفيف cIEF 1: 50 يستخدم
المثبطات المائية مزيجالبروتين بسيط040-482مثبط البروتياز ؛ ل cIEF 1:25 التخفيف المستخدم
السلم القياسي pI 3ProteinSimple040-646لتخفيف cIEF 1:60 تستخدم
مخففالبروتين بسيط040-649
مخفف الأجسام المضادة بروتين بسيط040-309
بروتين غسول مركزبسيط041-108
بروتينعبوة أنوليت040-337
عبوةالكاثوليت بسيط040-338
بروتين بيروكسيد XDRبسيط041-084
لومينولبروتين بسيط040-652
Bicine / CHAPS LysisBuffer Protein Simple040-764
فصل الشعيرات الدموية (1 عبوة) ل   ؛بروتينSimpleCBS700
لوحة فحص / غطاء مجموعةبروتينبسيط040-663
بيروكسيداز-أفينيبيور حمار مضاد للأرانب IgG (H + L)   ؛Jackson ImmunoResearch 711-035-152ل cIEF المستخدمة (1: 300)
بيروكسيداز-أفينيبيور الحمار المضاد للفأر IgG (H + L)  Jackson ImmunoResearch 715-035-150ل cIEF المستخدمة (1: 300)
Phospho-Erk 1/2 إشارات خلية الأجسام المضادة الأولية9101ل cIEF المستخدمة (1: 50)
خليةالأجسام المضادة الأولية Pan Erk9102ل cIEF المستخدمة (1: 100)
برنامج البوصلةProteinSimple
HUVECATCCPCS-100-010
MV2 (EBM-2)PromoCell& نب سب. C-22221خلية البطانة القاعدية المتوسطة
نمو الخلايا البطانية المتوسطة MV2 SupplementPackPromoCellC-39221مكملات MV2 أعلاه
VEGFAPeproTech100-20
Long R3 IGFSigma-Aldrich85580C / I1146عامل النمو الشبيه بالأنسولين
Bioruptor (Sonicator)DiagenodeB01020001
BCA Protein مجموعة الفحص Thermo Fischer Scientific23225
NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Protein GelsThermo Fischer ScientificNP0322BOX
NuPAG MOPS SDS Running Buffer (20X)Thermo Fischer ScientificNP0001
NuPAGE Transfer Buffer (20X)Thermo Fischer ScientificNP0006
Immobilon PVDF غشاءMilliporeIPVH00010
الطرد
Microfuge
محول لوحة Microtiter للماصات
المركزي   ؛
نصائح
الجليد
عينة بسيط بروتين إشارات أنبوب الكهربائي الدوامة بالطرد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. O'Neill, R. A., et al. Isoelectric focusing technology quantifies protein signaling in 25 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (44), 16153-16158 (2006).
  2. Aspinall-O'Dea, M., et al. Antibody-based detection of protein phosphorylation status to track the efficacy of novel therapies using nanogram protein quantities from stem cells and cell lines. Nat Protoc. 10 (1), 149-168 (2015).
  3. Fan, A. C., et al. Nanofluidic proteomic assay for serial analysis of oncoprotein activation in clinical specimens. Nat Med. 15 (5), 566-571 (2009).
  4. Padhan, N., et al. High sensitivity isoelectric focusing to establish a signaling biomarker for the diagnosis of human colorectal cancer. BMC Cancer. 16 (1), 683(2016).
  5. Sun, Z., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. J Exp Med. 209 (7), 1363-1377 (2012).
  6. Iacovides, D. C., et al. Identification and quantification of AKT isoforms and phosphoforms in breast cancer using a novel nanofluidic immunoassay. Mol Cell Proteomics. 12 (11), 3210-3220 (2013).
  7. Price, F. D., et al. Inhibition of JAK-STAT signaling stimulates adult satellite cell function. Nat Med. 20 (10), 1174-1181 (2014).
  8. Unger, F. T., et al. Nanoproteomic analysis of ischemia-dependent changes in signaling protein phosphorylation in colorectal normal and cancer tissue. J Transl Med. 14, 6(2016).
  9. Urasaki, Y., Pizzorno, G., Le, T. T. Chronic uridine administration induces fatty liver and pre-diabetic conditions in mice. PLoS One. 11 (1), e0146994(2016).
  10. Schmidt, L., et al. Case-specific potentiation of glioblastoma drugs by pterostilbene. Oncotarget. 7 (45), 73200-73215 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Capillary Isoelectric FocusingProtein Isoform DetectionAutomated Western BlottingEnhanced Chemiluminescence DetectionCharge Coupled Device CameraProtein Lysate AnalysisAntibody Based QuantificationHigh Throughput ScreeningBiomarker Discovery ApplicationsIsoelectric Point Separation

Related Articles