على نطاق الجينوم الكمي للترجمة في مهدها الخميرة بالتنميط الريبوسوم

ملخص

تنظيم متعدية الجنسيات دوراً هاما في السيطرة على وفرة البروتين. هنا، يمكننا وصف أسلوب الفائق للتحليل الكمي للترجمة في مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae.

الملخص

ترجمة مرناً إلى البروتينات عملية معقدة تنطوي على عدة طبقات من اللائحة. كثيرا ما يفترض أن تعكس التغييرات في النسخ مرناً التغييرات في تخليق البروتين، ولكن الكثير من الاستثناءات قد لوحظت. في الآونة الأخيرة، برزت تقنية تسمى الريبوسوم التنميط (أو Seq ريبو) كطريقة قوية تتيح تحديد الهوية، مع درجة عالية من الدقة، أي مناطق مرناً يتم ترجمتها إلى بروتينات والتحديد الكمي للترجمة على مستوى المنظومة الجينوم. نقدم هنا، بروتوكول معممة على نطاق الجينوم التقدير الكمي للترجمة باستخدام Seq ريبو في مهدها الخميرة. وباﻹضافة إلى ذلك، الجمع بين البيانات ريبو-Seq مع قياسات الوفرة مرناً يسمح لنا بقياس كفاءة الترجمة الآلاف من النصوص مرناً في نفس العينة في وقت واحد، ومقارنة التغيرات في هذه المعلمات في الاستجابة إلى تجريبية التلاعب أو في حالات فسيولوجية مختلفة. يصف لنا بروتوكول مفصل لجيل أقدام الريبوسوم باستخدام نوكلاس الهضم، عزل مجمعات البصمة الريبوسوم سليمة عن طريق تجزئة السكروز التدرج، وإعداد مكتبات الحمض النووي لتسلسل العميقة جنبا إلى جنب مع المناسبة نوعية الضوابط اللازمة لضمان دقة التحليل في فيفو الترجمة.

المقدمة

الترجمة مرناً هو إحدى العمليات الأساسية في الخلية، والتي تلعب دوراً هاما في تنظيم التعبير البروتين. ولذلك، الترجمة مرناً مراقبة شديدة واستجابة لمختلف المحفزات الفسيولوجية الداخلية والخارجية ^1،2. ومع ذلك، تظل آليات التنظيم متعدية المداريين. هنا، نحن تصف البروتوكول للتحديد الكمي للترجمة في مهدها الخميرة على نطاق الجينوم بالتنميط الريبوسوم. والهدف العام لأسلوب التنميط الريبوسوم هو دراسة وتحديد مقدار ترجمة مرناس محددة تحت ظروف مختلفة الخلوية. هذا الأسلوب يستخدم التسلسل الجيل القادم لتحليل كمي شغل الريبوسوم في جميع أنحاء الجينوم ويتيح رصد معدل البروتين التوليف في فيفو كودون واحد القرار ^3<....

البروتوكول

1-استخراج إعداد

1. الانتصارات سلالات الخميرة من الأرصدة المجمدة للمستعمرات واحدة في لوحات YPD (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2% والجلوكوز 2% واجار 2%). احتضان لوحات عند 30 درجة مئوية لمدة يومين.
2. تطعيم الخميرة من لوحة YPD (استخدام مستعمرة واحدة) إلى 15 مل متوسطة YPD (استخراج الخميرة 1%، ببتون 2%، 2% جلوكوز) في أنبوب 50 مل مخروطية أجهزة الطرد مركزي وتنمو بين عشية وضحاها بالهز (200-250 لفة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية.
3. تمييع الثقافة إلى 500 مل متوسطة YPD في ل 2 قارورة معقمة، حيث أن التطوير التنظيمي₆₀₀ < 0.1. تنمو خلايا الخميرة مع تهتز عند 30 درجة مئوية ح 3-5 حتى OD₆₀₀ = 0.5 (سجل منتصف المرحلة).
4. جمع الخلايا بعمل....

النتائج

كانت خطوط الأنابيب مفصلة لتحليل بيوينفورماتيك من الريبوسوم التنميط البيانات المذكورة سابقا ^8،9. وباﻹضافة إلى ذلك، وضعت عدة مجموعات بحثية أدوات المعلوماتية الحيوية لتحليل التعبير الجيني التفاضلي وتجهيز البيانات التسلسل، التي محددة الريبوسوم التنميط الأسلوب ^{10،11،12 ،13،،}من

المناقشة

النهج Seq ريبو الذي برز كتقنية قوية لتحليل مرناً الترجمة في فيفو على نطاق الجينوم المستوى ³. الدراسات باستخدام هذا النهج، الذي يسمح برصد الترجمة مع القرار كودون واحد، قد ساهم في فهمنا للتنظيم متعدية الجنسيات. وعلى الرغم من مزاياه، Seq ريبو نقائص عديدة. شظايا الريباسي الحمض النووي الريبي (الرنا الريباسي) دائماً شارك المنقي أثناء عزلة أقدام محمية الريبوسوم تناقص محصول ما يلي تسلسل المفيدة التي يمكن الحصول عليها في ريبو-Seq تجارب ^9،25

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.45 مو ؛ مرشحات غشاء M	Millipore	HVLP04700
0.5 M EDTA	Invitrogen	AM9261
0.5 مل مرشحات الطرد المركزي (100 كيلو دالتون MWCO)	Millipore	UFC510024
1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.0	Invitrogen	AM9850G
1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 (درجة الحموضة 8.0 عند 4 درجة ؛ ج)	Invitrogen	15567-027
10X TBE buffer	Invitrogen	AM9863
10٪ TBE-urea gel	Invitrogen	EC6875BOX
15٪ TBE-urea gel	Invitrogen	EC6885BOX
2 M MgCl2< / sub>	RPI	M24500-10.0
2X TBE-urea عينة عازلة	Invitrogen	LC6876
3M NaOAc ، درجة الحموضة 5.5	Invitrogen	AM9740
5 'Deadenylase (10 U/μ L)	مركز	DA11101K
5X عازلة تحميل عينة الحمض	Bio-Rad	161-0767
8٪ هلام TBE	Invitrogen	EC6215BOX
حمض الفينول: الكلوروفورم ، درجة الحموضة 4.5 (مع IAA ، 125: 24: 1)	Invitrogen	AM9722
الضوء الأزرق عازل	كلير للأبحاث الكيميائية	DR-46B
حبات الكروم الصلب ، منتجات BioSpec مقاس 3.2 مم		11079132c
Cryogrinder	Biospec المنتج	3110BX
Cycloheximide	RPI	C81040-5.0
نظام الحصول على البيانات	DATAQ Instruments	DI-245
محلول Deoxynucleotide (dNTP) (10 ملم)	NEB	N0447L
Glycogen	Invitrogen	AM9510
نظام تجزئة التدرج	براندل	BR-184X
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (2,000 وحدة / مل)	NEB	M0530S	مزود ب 5X Phusion HF Buffer
مجموعة القياس الكمي لمكتبة تسلسل الجيل التالي	Kapa Biosystems	KK4824
صبغة هلام الحمض	Invitrogen	S11494
Optima XE-90 أجهزة الطرد المركزي الفائقة	Beckman Coulter	A94471
Poly (A) mRNA	Invitrogen	61011
Rec J exonuclease (10 U/μ L)	مركز	RJ411250
النسخ العكسي (200 وحدة | ل)	18080093 Invitrogen		مزود بمخزن مؤقت أول حبلا 5X ومخزن مؤقت تجزئة 0.1 متر DTT
RNA	NEB	E6186A
RNase I (100 U/μ L)	Invitrogen	AM2295
RNase (20 U/μ L)	Invitrogen	AM2696
أغطية مطاط السيليكون	BioSpec	2008
ssDNA ligase (100 U/μ L)	CL9021K	مركز الزلزال	مزود بمخزن مؤقت 10X CircLigase II و 50 ملي مولار MnCl2< / sub>
قوارير صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، 1.8 مل	BioSpec Products	2007
السكروز	RPI	S24060-5000.0
SW-41 Ti الدوار	Beckman Coulter	331362
مضخة حقنة	أنظمة مضخات العصر الجديد	NE-300
T4 بولي نوكليوتيدات كيناز (10,000 وحدة / مل)	NEB	M0201S	مزود بمخزن مؤقت بولي نوكليوتيدات 10X T4
T4 RNA ligase 2 KQ مقطوع (200,000 وحدة / مل) NEB		M0373S	مزود بمخزن مؤقت 10X T4 RNA ligase و 50٪ PEG8000
Thermal cycler	Bio-Rad	1851148
أنابيب بولي ألومر Thinwall ، 13.2 مل	Beckman Coulter	331372
Triton X-100	سيجما ألدريتش	X100-100ML
شاشة الأشعة فوق البنفسجية	Bio-Rad	7318160
سلالة الخميرة الخميرة BY4741	Open Biosystems	YSC1048

النووي مصباح مزيج النووي طقم عزل مثبط منتجات