مقالة منهجية

التحديد الكمي اكسين الذاتية وسيتوكينين خلال الثقافة Internode من عرق الذهب

DOI:

10.3791/56902

⸱

مارس 15, 2018

 ,  , 
1Graduate School of Life Sciences, Toyo University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن الناجمين عن العارض يطلق النار على شرائح internodal من عرق الذهب بدون علاج فيتوهورموني. تقييم ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، قمنا بقياس اكسين الذاتية وسيتوكينين في قطاعات internodal قبل LC-MS/MS.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكيل إطلاق النار العرضي أسلوب هام للدعوة للمحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع. عما إذا كان يمكن أن يتسبب العارض يطلق النار على تتحدد بالتوازن بين اكسين وسيتوكينين (كورونا) مستويات. يذهب الكثير من الجهد في تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس في كل الأنسجة المستخدمة اكسبلانتس وفي كل نوع من الأنواع النباتية. في عرق الذهب، يمكن فعل بيد من يطلق النار العرضي في قطاعات internodal في المتوسط الثقافة دون علاج فيتوهورموني. وهذا ما يسمح اللدونة الملازمة لعرق الذهب للتمايز الخلية التي يتم تقييمها. للحث على براعم العارض في عرق الذهب، نحن مثقف شرائح internodal في 24 درجة مئوية تحت 15 µmol م2 ق1 من الضوء في حلقة مفرغة الظلام الضوء/10-ح 14-ح على خالية من فيتوهورموني المتوسطة B5 توطد مع الصمغ جيلان 0.2 في المائة لمدة 5 أسابيع. للتحقيق في ديناميات فيتوهورموني خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل، نحن تقاس حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية و CKs في القطاعات السائل اللوني-جنبا إلى جنب الكتلي LC-MS/MS. هذا الأسلوب يسمح تحليل حمض اندول-3-أنهيدريد الذاتية ومستويات CKs بطريقة بسيطة. يمكن تطبيقها للتحقيق في ديناميات اكسين الذاتية وكورونا خلال organogenesis في الأنواع النباتية الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واقترح غوتليب هابيرلاندت (1854-1945) مفهوم "توتيبوتينسي"، بالنبات الذي الخلايا يمكن تقسيم والتفريق وتجديد محطات كاملة حتى بعد تلك التفرقة السابقة إلى أنواع محددة من الخلايا في النباتات الناضجة1. في زراعة الأنسجة، ما إذا كان يمكن فعل تجديد النبات أو لا يتحدد بتركيبة وتركيز phytohormones مناشئ التطبيقية في الأجلين المتوسط والنمو. وجد سكوغ وميلر يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من دشبذ التبغ في الثقافة المتوسطة التي تحتوي على نسبة عالية من CKs إلى auxins، بينما يمكن الناجمين عن جذور العارض في المتوسطة التي تحتوي على نسبة منخفضة من2. منذ ذلك الاستنتاج، زراعة الأنسجة وقد استخدمت على نطاق واسع لنشر المحاصيل الهامة اقتصاديا والتجديد للنباتات المعدلة وراثيا3. يمكن التي يسببها العارض يطلق النار على من الأنسجة عدا أرض قمية تبادل لإطلاق النار، مثل الأوراق والجذور، وإينتيرنوديس. العلاج فيتوهورموني مطلوب لاستحثاث يطلق النار العرضي في معظم الأنواع النباتية. بيد أن التركيزات المثلى وتركيبات تختلف حسب الأنواع وبين الأنسجة المستخدمة ك explants. وهكذا، بذل الكثير من الجهد يذهب إلى تحديد التركيزات المثلى وتركيبات من فيتوهورمونيس للتجارب.

يهيجون كارابيتشيا (الخبز). L. أندرسون (عرق الذهب) هو النباتات طبية التي تحتوي على قلويدات مثل اميتيني وسيفايليني، أساسا في الجذور4. مقتطفات الجذر تستخدم مقشع، قيء، وأموبيسيدي5. على الرغم من عرق الذهب ينمو بشكل طبيعي في الغابات المطيرة الاستوائية من البرازيل، أنها مترددة في وضع البذور في الثقافة، ويقلل من معدل الإنبات أثناء تخزين البذور في اليابان، مع أن المناخ الأكثر برودة6. بدلاً من ذلك، فإنه يتم نشر بزراعة الأنسجة، في تبادل لإطلاق النار العرضي الذي هو تشكيل في إينتيرنوديس7،الأسلوب الأكثر كفاءة8. من المثير للاهتمام، يمكن فعل العارض يطلق النار على في هذه الأنواع دون علاج فيتوهورموني8.

وتتشكل يطلق النار العرضي على البشرة في منطقة قمي شرائح internodal دون كالوسينج، ولكن ليس في المنطقة القاعدية9. هذا الاختلاف يشير إلى قطبية الأنسجة في قطاعات internodal، الذي على الأرجح تحت لائحة فيتوهورمونال. ويسمح نظام الثقافة عرق الذهب فرصة فريدة لتحليل التغيرات في مستويات فيتوهورموني الذاتية خلال تبادل لإطلاق النار العرضي تشكيل. أعرض هنا ونحن لدينا طريقة لتحليل مستويات الذاتية اكسين واحد (حمض اندول-3-أنهيدريد (IAA)) وأربعة CKs (isopentenyl الأدنين (iP)، إيسوبينتينيل الأدنين المواد (حقوق الملكية الفكرية)، ترانس-أنها (tZ)، و عبر-أنها المواد (تزر)) في internodal شرائح من خلال استخدام LC-MS/MS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: استخدمت عرق الذهب (C. يهيجون) في هذه الدراسة نظراً لأنها تسهل تحليل phytohormones الذاتية.

1-النمو الظروف للحث على العارض يطلق النار على من عرق الذهب

  1. تعد خالية من فيتوهورموني المتوسطة B5 تعديلها لدرجة الحموضة 5.710، وإضافة الصمغ جيلان 0.2%. تعقيم بالتعقيم.
  2. صب 25 مل الوسط يعقم في طبق بتري معقم (90 ملم × 20 ملم).
  3. قطع شرائح internodal 8 مم من النبيتات عرق الذهب باستخدام مشرط جراحي مع شفرة رقم 22 على لوح اكريليك عقيمة، ووضع في المتوسط (الشكل 1).
  4. الثقافة في B5 خالية من فيتوهورموني المتوسطة في 24 درجة مئوية تحت 15 µmol م2 ق1 من الضوء في دائرة الضوء/10-ح 14-ح الظلام لمدة 5 أسابيع.
  5. تحديد المناطق وأنا (قمي) إلى الرابع (القاعدية) في كل قطاع (الشكل 1ب). حساب عدد يطلق النار العرضي > 0.3 مم طول في كل منطقة تحت مجهر مرة واحدة في أسبوع.

2-استخراج وتنقية فيتوهورمونيس

  1. وضع حبة زركونيا 5 مم في كل من أربعة أنابيب العينة 2 مل.
  2. مقطعة الشرائح مناطق الأول إلى الرابع (كل 2 مم في الطول) باستخدام مشرط جراحي على لوح اكريليك عقيمة.
  3. جمع القطع ثمانية من كل منطقة في نموذج منفصل أنابيب (10-30 ملغ الوزن الطازج).
  4. وزن، ومن ثم تجميد العينات في نيتروجين سائل.
  5. سحق العينات المجمدة باستخدام الخالطون المستندة إلى حبة.
  6. تعليق العينات التي سحقت في 1 مل الاسيتو الانيتريل تحتوي على 500 بيكوغرام لكل معيار الداخلية من اكسين و CKs (د5-الأكاديمية، د5-tZ، تزر-د5، د6-الملكية الفكرية، د6-حقوق الملكية الفكرية) باستخدام خلاط دوامة.
  7. عقد في 4 درجات مئوية عن ح 1، ثم الطرد المركزي في × 3,500 ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. أغسل بيليه في الاسيتو الانيتريل 80% (v/v) الذي يحتوي على حمض الخليك 1% (v/v). أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 3,500 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. الجمع بين سوبيرناتانتس (من الخطوات 2.7 و 2.8) في أنبوب زجاج القابل للتصرف.
  9. إضافة 600 ميليلتر المياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v) لكل المادة طافية مجتمعة، وتتبخر الاسيتو الانيتريل استخدام مركز فراغ.
  10. حجته ماء-محبتين متوازنة خراطيش العمود (HLB) عن طريق تطبيق 1 مل الاسيتو الانيتريل، والميثانول، والمياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v).
  11. تطبيق الحل عينة واحدة كل متوازن HLB خرطوشة.
  12. أغسل الخراطيش مع 1 مل من الماء الذي يحتوي على حامض الخليك 1% (v/v).
  13. الوت جميع هرمونات مع 2 مل 80% (v/v) الاسيتو الانيتريل المحتوية على حمض الخليك 1% (v/v) في أنبوب زجاج.
  14. تتبخر في الاسيتو الانيتريل في النذرة الحصول على استخراج في المياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v) باستخدام مركز فراغ.
    ملاحظة: لم يجف هذا تماما.
  15. حجته خراطيش العمود وضع مختلط، القوى الموجبة تبادل (MCX) عن طريق تطبيق الاسيتو الانيتريل مل 1، 1 مل الميثانول، مل 0.5 0.1 M HCl، و 1 مل من الماء الذي يحتوي على حامض الخليك 1% (v/v).
  16. تطبيق الحل عينة واحدة كل متوازن MCX خرطوشة.
  17. أغسل الخراطيش مع 1 مل من الماء الذي يحتوي على حامض الخليك 1% (v/v).
  18. الوت الأكاديمية مع 2 مل 30% (v/v) الاسيتو الانيتريل المحتوية على حمض الخليك 1% (v/v) في أنبوب زجاج.
  19. أغسل الخراطيش مع 2 مل 80% (v/v) الاسيتو الانيتريل المحتوية على حمض الخليك 1% (v/v).
  20. أغسل الخراطيش مع 2 مل من الماء والماء 1 مل يحتوي على 5% مائي الأمونيا.
  21. الوت CKs مع 2 مل 60% (v/v) الاسيتو الانيتريل التي تحتوي على 5% مائي الأمونيا في أنبوب زجاج.
  22. يتبخر المذيب لكل جزء الهرمون استخدام مركز فراغ وتخزينها في −30 درجة مئوية حتى التحليل LC-MS/MS.

3-LC-MS/MS تحليل الأكاديمية و CKs

  1. حل كل استخراج هرمون في أنبوب مع 600 ميليلتر من الميثانول ونقل الحل إلى قنينة انتعاش الكلي الرقبة المسمار. تتبخر المذيبات استخدام مركز فراغ.
  2. حل الكسر الأكاديمية في ميليلتر 20 30% (v/v) الاسيتو الانيتريل، والكسور كورونا تشيكية في 20 ميليلتر المياه التي تحتوي على حمض الخليك 1% (v/v) في المسمار الرقبة الانتعاش الكلي القنينات.
  3. تحليل العينات في وضع أيون إيجابية على نظام MS ثلاثي-الرباعي مجهزة بنظام [هبلك].
    ملاحظة: وضعنا الشروط [هبلك] كما هو موضح في الجدول 1.
    1. شطف الأكاديمية، استخدام تدرج ثنائي من 5-50% ب المذيبات ما يزيد على 7 دقائق، ثم زيادة بالمذيبات 98% ب وعقد لمدة 1 دقيقة، وحجته ثم لمدة 2 دقيقة في 5 ٪ مذيب ب عن طريق الحقن عش.
    2. شطف كورونا تشيكية، استخدام تدرج ثنائي 2-40 ٪ المذيبات باكثر من 5 دقائق، المذيبات 40 إلى 70% ب في 7 دقيقة، ثم زيادة بالمذيبات 95% ب وعقد لمدة 1 دقيقة، وحجته ثم لمدة 2 دقيقة في المذيبات 2% ب بعش الحقن.
    3. تعيين التأين اليكتروسبراي (ESI)-معلمات MS لايون المصدر كما هو موضح في الجدول 2.
  4. استخدام ردود فعل متعددة رصد الانتقال (MRM) للتحديد الكمي لكل أكثر المدرجة في الجدول 3.
  5. قياس المستويات الأكاديمية وكورونا تشيكية الذاتية ضد منحنى قياسي للنسبة غير مسمى للمعايير يسمى الديوتريوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وشكلت في الأسبوعش 1، لم يطلق النار العرضي. في الأسبوع 2nd ، ظهرت براعم صغيرة. 3rd والأسابيعال 4، العدد يطلق النار على زيادة معظمها في منطقتي قمي (الأول والثاني) (الشكل 2أ). في الأسبوعال 5، عدد من يطلق النار كان حوالي 7 المنطقة في أنا و 5 في المنطقة الثانية (الشكل 2ب). وفي المقابل، شكلت يطلق النار على عدد قليل فقط في الأقاليم الثالث والرابع.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد توزيع phytohormones المشاركة في أورجانوجينيسيس، من المهم أن استخدام المواد النباتية التي يمكن ملاحظتها organogenesis في المتوسط خالية من فيتوهورموني، لأنه عندما يتم تطبيق phytohormones مناشئ explants لحمل البراعم أو الجذور، وهي تؤثر explant كله، مما يجعل من الصعب تقييم اللدونة الملازمة للنباتات في تمايز الخلايا وأورجانوجينيسيس. يمكن الناجمين عن العارض يطلق النار على وسائط ثقافة خالية من فيتوهورموني في الأنواع النباتية الأخرى مثل قرنفل شائع ل.11، كوريا مارميلوس عاجل (لام)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن ممتنون للسيد أكيرا موراكامي من قسم العلوم التطبيقية وجامعة تويو والسيد كودي تانيجوشى المركز التكنولوجيا الزراعية جونما للمساعدة التقنية. ونحن ممتنون أيضا للبروفيسور شوساكو كاشيوادا والدكتور Uma الج يجلاب، جامعة تويو لاقتراحاتهم. وأيد في مركز أبحاث هذه الدراسة جزئيا للحياة، والعلوم البيئية، جامعة تويو.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
[2H5] indole-3-acetic acidOlchemlm Ltd031 1531المعيار الداخلي ل LC-MS / MS
[2H5] عبر zeatinOlchemlm Ltd030 0301المعيار الداخلي ل LC-MS / MS
[2H5] عبر الزياتين ريبوسيدOlchemlm Ltd030 0311المعيار الداخلي ل LC-MS / MS
[2H6] N6-isopentenyl adenineOlchemlm Ltd030 0161المعيار الداخلي ل LC-MS / MS
[2H6] N6-isopentenyl adenosineOlchemlm Ltd030 0171المعيار الداخلي ل LC-MS / MS
إندول -3-حمض الخليكواكو098 00181معيار ل LC-MS / MS
عبر zeatinSIGMA-ALDRICHZ0876 معيار 5MGل LC-MS / MS
عبر زيتين ريبوسيدواكو262 01081معيار ل LC-MS / MS
N6-isopentenyl معيار الأدينينSIGMA-ALDRICHD7674 1Gل LC-MS / MS
N6-ISOPENTENYL adenosineACROS ORGANICS22648 1000القياسي ل LC-MS / MS
الأسيتونيتريل الهايبرgrade ل LC-MS LiChrosolvMERCK1.00029.1000المذيب ل LC-MS /
MS الماء للكروماتوغرافيا LiChrosolvMERCK1.15333.1000المذيب ل LC-MS / MS
HPLCSHIMADZUProminence
MSSciex3200QTRAP
Oasis HLB 30 مجم / 1 سم مكعبووترWAT094225عمود خرطوشة
Oasis MCX 30 مجم / 1 سم مكعبالمياه186000252خرطوشة عمود
برغي عنق قنينة استرداد كاملةالمياه186002805
أزرق ، غطاء عنق لولبي 12 × 32 مم و PTFE / سيليكون الحاجزالمياه186000274
Acquity UPLC BEH C18 ، 2.1 × 100 ممووتشرز186002350عمود UPLC
Proshell 120 EC-C18 ، 2.1 × 50 ممAgilent699775-902عمود UPLC
مجهر رقميLeicaDHS1000
TissueLyser IIQIAGEN85300
شفرة جراحيةريشةرقم 22
مقبض مشرطريشةرقم 4
Savant SpeedVac / مصيدة بخار مجددةThermo Fisher ScientificSPD111 / RVT4104مكثف
فراغ زجاج قابل للتصرف (13x100 مم)IWAKI9832-1310
طبق بتري معقمINA OPTICAI-90-20

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
  2. Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
  3. Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N. Transgenic plants and crops. Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. , CRC Press. Ch. 4 69-84 (2002).
  4. Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
  5. Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. Atal, C. K., Kapur, B. M. , Jammu-Tawi, India. 295-301 (1982).
  6. Bajaj, Y. P. S. Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 87-103 (1993).
  7. Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
  8. Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
  9. Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
  10. Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
  11. Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
  12. Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
  13. Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
  14. Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
  15. Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
  16. Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
  17. Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

LC MS MS

مقالات ذات صلة