استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

Henrick Horita; Andy Law; Kim Middleton

doi:10.3791/56912

مقالة منهجية

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

DOI:

10.3791/56912

⸱

يناير 8, 2018

Henrick Horita¹ , Andy Law¹ , Kim Middleton¹

¹R&D Department, Cytoskeleton Inc.

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحقيق المتعددة، التعديلات بوستترانسلاشونال الذاتية لبروتين هدف يمكن أن تكون صعبة للغاية. الأساليب الموصوفة هنا الاستفادة من نظام المخزن المؤقت وتصفية تحلل أمثل وضعها مع محددة تستهدف PTM، تقارب مصفوفات للكشف عن أسيتيليشن، أوبيكويتينيشن، سومويليشن 2/3، والتيروزين الفسفرة التعديلات لهدف البروتين باستخدام نظام وحيد ومبسطة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الآن يحظى بتقدير جيد أن التعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) يلعب دوراً أساسيا في تنظيم هيكل ووظيفة، والتي قد تكون ضرورية لدور بروتين معين لكل من الناحية الفسيولوجية ومرضية للبروتين. وكثيراً ما ضروري إثراء بتمس عند التحقيق في حالة PTM البروتين المستهدف، لأن بتمس غالباً ما تكون عابرة ومنخفضة نسبيا في وفرة. هي واجه عثرات كثيرة عند إثراء ل PTM البروتين المستهدفة، مثل عدم التوافق في المخزن المؤقت، أضداد البروتين المستهدف غير المتوافقة مع الملكية الفكرية، وفقدان إشارة PTM وغيرها. درجة الصعوبة تتعاظم عند التحقيق بتمس متعددة مثل أسيتيليشن، أوبيكويتينيشن، سومويليشن 2/3، والتيروزين الفسفرة لبروتين هدف معين. دراسة تركيبة من هذه بتمس قد يكون ضروريا، كما الحديث المتبادل بين بتمس انتشارا وحاسمة بالنسبة للائحة البروتين. وغالباً ما يتم دراسة هذه بتمس في تحلل مختلف المخازن المؤقتة ومع تركيبة فريدة من نوعها المانع. لتبسيط هذه العملية، فريدة من نوعها يشوه تحلل وضع نظام أن فعالية يعزل ويحفظ هذه بتمس الأربعة؛ وبالتالي، تمكين التحقيق من الحديث المتبادل المحتملة في نظام تحلل واحدة. تم تصميم نظام تصفية فريدة من نوعها لإزالة تلويث الحمض النووي من، وهو منتج ثانوي إشكالية من يشوه المخازن المؤقتة. مصفوفات تقارب قوية تستهدف كل من بتمس أربعة وضعت بالتنسيق مع نظام المخزن المؤقت لتخصيب اليورانيوم والكشف عن الدول الذاتية في هذه بتمس الأربع إلى أقصى حد. أدوات الكشف عن PTM شاملة هذا يبسط عملية الحصول على معلومات هامة حول ما إذا كان تم تعديل بروتين بواحد أو أكثر من هذه بتمس.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعديلات بوستترانسلاشونال (بتمس) هي تعديلات عالية التنظيم لبروتين، خلالها التعديل إضافة أو إزالتها بطريقة محددة. وغالباً ما بتمس التغييرات الديناميكية، عابرة أن يغير كثيرا من هيكل البروتين، والتفاعلات مع الشريك والبروتينات، والتعريب المكانية، وتمكن في نهاية المطاف البروتين لأداء مهام متميزة¹^،² ^, ³ ^, ⁴-بتمس وفيرة حتى أنهم زيادة عدد أشكال البروتين فريدة من نوعها (أو بروتيوفورمس) من حوالي 30,000 الجينات المنتجات إلى ما يزيد على 1 مليون بروتيوفورمس⁵^،⁶. تحديد بتمس وأثرها على بروتين المستهدف حاسم نحو فهم البروتين الوظائف الفسيولوجية والمرضية⁷^،^،من⁸⁹^،¹⁰^، ¹¹^،¹²^،^،من¹³¹⁴. العمل على تحديد البروتينات مثل tubulin، p53، ومستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) توضيح أدوار تنظيمية بتمس¹⁵^،^،من¹⁶¹⁷. وكشفت هذه الدراسات أن تنظيم هذه البروتينات يحدث قبل بتمس متعددة، وفي كثير من الحالات هذه التعديلات العمل يدا واحدة لتعزيز وظيفة محددة. وقد أظهرت الدراسات الجديدة أن الحديث المتبادل PTM التعاونية وسلبية على السواء يمكن أن تحدث في عدة البروتينات المختلفة¹⁸^،^،من¹⁹²⁰^،^،من²¹²²^، ²³²⁴^،^،²⁵. ومع ذلك، ملامح PTM الأغلبية من البروتينات مبنية من العديد من الدراسات التي استخدمت نماذج مختلفة وظروف فريدة من نوعها. وجود نظام محسن للتحقيق بتمس متعددة في نظام واحد سيكون مفيداً للغاية للحصول على نظرة ثاقبة الحديث المتبادل PTM المحتملة لبروتين هدف.

واحد التحديات مع التحقيق بتمس في نظام واحد هو أن بتمس محددة يتم التحقيق في استخدام المخازن المؤقتة لتحلل متميزة. على سبيل المثال، قد يكون استخدام المخازن المؤقتة مثل المعهد الملكي أو NP-40 التي تستخدم عادة للتحقيقات الفسفرة أو أوبيكويتينيشن غير كافية لدراسة PTM مجا مثل يليشن الصغيرة مثل ubiquitin المعدل (سومو)²⁶. بالإضافة إلى ذلك، غير يشوه المخازن المؤقتة غير كافية للنأي بتفاعلات البروتين، ويمكن أن يؤدي إلى تحديد هوية PTM إيجابية زائفة²⁷. التحقيق بتمس في المخزن مؤقت الذي يشوه تحلل قد يكون من المفضل، كما هو أفضل بكثير في عزل البروتينات من جميع مقصورات الهاتف الخلوي²⁸، سوف ننأى بمعظم تفاعلات البروتين، وسوف تحول دون البروتياز أن تغير الدول PTM، مثل ديسومويلاسيس ²⁶؛ ومع ذلك، يشوه المخازن المؤقتة قد خرق سلامة الكواشف تقارب محددة مثل ubiquitin ملزمة الأدوات المستندة إلى المجال²⁷. تطوير نظام يشوه الشبيهة بتحلل الدراسة بتمس متعددة من البروتين في نظام متوافق مع كاشف تقارب سيكون مفيداً للغاية للتحقيقات PTM الحديث المتبادل.

على الرغم من أن يشوه المخازن المؤقتة المزايا الرئيسية أكثر من المخازن المؤقتة غير يشوه للتحقيق بتمس، أنها تستخدم أقل شيوعاً بسبب سلبياتها كبيرة، مثل عدم التوافق مع فحوصات البروتين التقليدية، كبير الجينوم تلوث الحمض الخلوي الصبغي (DNA)، وتعطل الكواشف إيمونوبريسيبيتيشن (IP)²⁹. يمكن أن يؤدي هذه العيوب في وقت إعداد الموسع والأضرار المحتملة للبروتينات المستهدفة عند قص الحمض النووي. وتشمل اثنين من الأساليب المستخدمة عادة لقص الحمض النووي حقنه تحلل و sonication²⁹. كلا الأسلوبين تتطلب التحسين واسعة النطاق، وكثيراً ما تفتقر إلى إمكانية تكرار نتائج دقيقة. وتشمل أساليب بديلة لإزالة الحمض النووي إضافة دناسيس؛ ومع ذلك، قد يتطلب هذا التحسين الإضافية والتغييرات في تكوين المخزن المؤقت. وفي نهاية المطاف، طريقة بسيطة واستنساخه لإزالة التلوث الدنا الجينومي سيكون مفيداً عند العمل مع يشوه تحلل المخازن المؤقتة للتحقيقات PTM.

والهدف من هذا الأسلوب وضع نظام لعزل والتحقيق أوبيكويتينيشن (Ub)، التيروزين الفسفرة (pY)، سومويليشن 2/3 (سومو 2/3)، وبتمس acetylation (Ac) في نظام واحد للتحقيق أفضل PTM الحديث المتبادل لبروتين هدف. واستخدم هذا النظام كشف PTM لسرعة التحقيق الشخصية PTM الذاتية للعديد من البروتينات المستهدفة في نظام واحد. وكان ثاقبة جديدة الحديث المتبادل المحتملة المحددة³⁰^،³¹. وعموما، يحسن الأسلوب الموصوفة هنا في الأساليب الحالية للتحقيق في بتمس و PTM الحديث المتبادل بثلاث طرق مختلفة: 1) وضعت حاجزاً يشوه فريدة من نوعها بعزل البروتينات من جميع مقصورات الهاتف الخلوي، في حين لا يزال يجري متوافقة مع PTM تقارب الكواشف، 2) وضع نظام تصفية فريدة من نوعها بسرعة إزالة المجينية الحمض النووي التلوث من التشويه والتحريف ليساتيس مع إمكانية تكرار نتائج عالية ويتطلب أي معدات متخصصة، و 3) الخرز تقارب قوية، وتفسخ النظام، والمثبطة الكواشف متوافقة؛ وبالتالي، تبسيط عزلة هذه بتمس الأربعة لبروتين مستهدفة لزيادة إثراء PTM، ودراسة كفاءة الحديث المتبادل المحتملة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-نموذج إعداد: خلية ثقافة

تنمو أربع لوحات 150 مم من الخلايا A431 في المتوسطة "تعديل النسر" دولبيكو (دميم) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين.
1. تنمو الخلايا A431 إلى كونفلوينسي 50%.
2. مصل تقييد أربعة ألواح من الخلايا A431 مع دميم خالية من المصل ح 24.
3. التعامل مع لوحات اثنين من الخلايا A431 مع 33.3 ملغ/مل عامل نمو البشرة لترك حاء 1 لوحات اثنين آخرين دون علاج.
  ملاحظة: شروط النمو وعلاج الخلية المعروضة هنا توفر مثالاً على ذلك؛ بيد أن هذه المنهجية ينطبق على العديد من أنواع الخلايا المختلفة وشروط المعاملة.
إعداد بلاستر مخازن تحلل وتمييع مع مثبطات (الجدول 1). الجمع بين مل 2.895 بلاستر تحلل المخزن المؤقت مع 15 ميليلتر من تيروزين الفوسفاتيز المانع، 30 ميليلتر من ديوبيكويتيناسي ومثبطات ديسومويلاسي و 30 ميليلتر من هيستون deacetylase (هداك) المانع 30 ميليلتر من مثبطات البروتياز كوكتيل.
1. الجمع بين 9.65 مل من المخزن المؤقت لتمييع بلاستر مع 50 ميليلتر من تيروزين الفوسفاتيز المانع، 100 ميليلتر من ديوبيكويتيناسي ومثبطات ديسومويلاسي و 100 ميليلتر من هيستون deacetylase (هداك) المانع 100 ميليلتر من مثبطات البروتياز كوكتيل.
  ملاحظة: انظر الجدول للمواد للحصول على معلومات التكوين ومثبط للمخزن المؤقت.
من أجل إيقاف وسائل الإعلام الثقافة ووضع الخلايا على الجليد. ثم، تغسل الخلايا مرتين مع 10 مل 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
1. قم بإزالة برنامج تلفزيوني قدر ممكن قبل إضافة المخزن المؤقت لتحلل بلاستر إلى أقصى حد ممكن تحلل الخلية.
  ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت.
إضافة 600 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل بلاستر لكل لوحة 150 مم. يستند مقدار المخزن المؤقت الغلة المتوقعة من البروتين (الجدول 2).
1. الخلايا باستخدام مكشطة خلية. ليساتي ستصبح اللزوجة بسبب تحلل النووية.
استخدام تلميح ماصة مقصوص 1 مل لنقل النفط الخام ليستي إلى عامل تصفية بلاستر التي وضعت في أنبوب جمع 15 مل (الشكل 1). وهنا، يستخدم أنبوب صقر 15 مل.
استخدام المكبس عامل تصفية التي تم توفيرها لضغط عامل التصفية بلاستر تماما وجمع ليستي التدفق من خلال، بما في ذلك أي فقاعات، في أنبوب 15 مل (الشكل 1).
اختياري: نقل توضيح إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي الأنبوبة والطرد المركزي في 10,000 تقريبا x ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
1. نقل المادة طافية إلى أنبوب صقر 15 مل جديدة.
تمييع توضيح مع المخزن المؤقت لتمييع بلاستر إلى وحدة تخزين نهائي 3 مل لكل لوحة 150 مم. وحدة التخزين النهائي يستند على العائد المتوقع من البروتين (الجدول 2).
ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتكوين المخزن المؤقت النهائي سوف تؤثر على صرامة رد فعل الملكية الفكرية.
كوانتيتاتي تركيز البروتين (القسم 2).

2-بروتين الإنزيم كوانتيتيشن

ملاحظة: تستخدم مقايسة كوانتيتيشن بروتين قياس ألوان قياسية لتحديد كوانتيتيشن البروتين. هنا، تحدد كوانتيتيشن البروتين باستخدام مقايسة البروتين المتقدمة الأحمر الدقة.

أضف 1 مل كاشف مقايسة البروتين المتقدمة الأحمر الدقة إلى كل من اثنين 1 مل الترعة.
ميكس 10 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل بلاستر وميليلتر 40 من المخزن المؤقت لتمييع بلاستر في أنبوب نظيف 1.5 مل ميكروسينتريفوجي على الجليد.
ملاحظة: هذا سيتم استخدام لقراءة العينة البروتين فارغة.
إضافة 20 ميليلتر من مزيج تحلل/إضعاف المخزن المؤقت (من الخطوة 2، 2) ومبومو والمزيج الأول بعكس مرتين إلى ثلاث مرات.
إضافة 20 ميليلتر من الخلية المخففة ليستي (من تجربة) إلى ومبومو الثانية، خلط كما هو مذكور أعلاه.
احتضان عينات لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
جهاز المطياف الضوئي فارغة مع المخزن المؤقت لتحلل/تمييع ميكس العينة (من الخطوة 2، 3).
قياس امتصاص العينة ليساتي (من الخطوة 2، 4) 600 نانومتر.
تحديد تركيز البروتين ليستي على النحو التالي؛
عينة من قراءة OD₆₀₀ x 5 = تركيز البروتين في مغ/مل
ملاحظة: قراءات OD أدناه 0.05 أو أعلاه 0.5 بالقرب من قدرة مجموعة الخطي مقايسة البروتين. لقراءات > 0.5، يمكن أن تضعف العينات. لقراءات < 0.05، أكثر يمكن أن تضاف إلى الكاشف مقايسة البروتين المتقدمة الأحمر الدقة (تصل إلى 50 ميليلتر). انظر الجدول 3 لمضاعفات لتحويل قراءات جهاز المطياف الضوئي لتركيز البروتين ليستي ملغ/مل. إذا كان هناك عدم كفاية البروتين في لوحة واحدة، فإنه من المستحسن استخدام لوحات 2 أو أكثر في مجال الملكية الفكرية. وفي هذه الحالة، سوف تحصد لوحات في السلسلة، ونقل ميليلتر 300 الأصلي لتحلل العازلة بين الألواح.
استناداً إلى تركيز البروتين، تمييع عينة مع مزيج المخزن مؤقت (تحلل بلاستر الجزء 1: 4 أجزاء بلاستر تمييع) إلى تركيز نهائي المطلوب (عادة 1 ملغ/مل).
الأداة الإضافية تجميد مختبرين للعينات التي لن يتم استخدامها فورا.
1. تخزين العينات في-70 درجة مئوية.
2. انتقل إلى القسم 3.

3-إيمونوبريسيبيتيشن (IP) الإنزيم

ملاحظة: تقارب تركيزات حبة وتركيزات ليستي، وأوقات الاحتضان هي أوصت المبادئ التوجيهية، وقد تكون فريدة من نوعها لكل البروتين المستهدف و PTM محددة يجري التحقيق فيها.

عكس الأسهم كاشف الأنابيب المحتوية على الخرز التقارب Ub والخرز تقارب السنة التحضيرية سومو تقارب 2/3 حبات الخرز تقارب Ac عدة مرات التأكد من أن يتم تماما حراكه الخرز في الأنبوب.
لكل فحص الملكية الفكرية، تعليق حبة الكوة في أنابيب ميكروسينتريفوجي منفصلة 1.5 مل على الجليد (أنبوب الملكية الفكرية). هنا، إضافة 20 ميليلتر من حبات تقارب ubiquitin 30 ميليلتر من فوسفوتيروسيني تقارب الخرز، 40 ميليلتر من سومويليشن تقارب 2/3 حبات أو 50 ميليلتر من حبات تقارب acetylation لأنابيب ميكروسينتريفوجي الفردية 1.5 مل على الجليد.
ملاحظة: انظر الجدول 4 للحجم الموصى به من تعليق حبة لاستخدام لكل حبة تقارب.
عكس الأسهم كاشف الأنابيب المحتوية على أوبيكويتينيشن الملكية الفكرية مراقبة الخرز والخرز مراقبة مفتش عدة مرات التأكد من أن يتم تماما حراكه الخرز في الأنبوب.
التحكم اليكووت الخرز كل التحكم كرد فعل لتحديد ربط غير محددة (أنبوب مراقبة الملكية الفكرية). هنا، إضافة 20 ميليلتر من حبات التحكم Ub 30 ميليلتر من حبات التحكم بأي، 40 ميليلتر من السومو التحكم 2/3 حبات أو 50 ميليلتر من التيار المتردد التحكم الخرز لأنابيب ميكروسينتريفوجي الفردية 1.5 مل على الجليد.
ملاحظة: انظر الجدول 4 للحجم الموصى به من تعليق حبة لاستخدام لكل نوع من تقارب حبة.
حفظ كمية صغيرة من ليستي (20 ميليلتر) لتشغيل وصمة عار غربية إدخال التحكم ليستي. إضافة 5 ميليلتر من المخزن المؤقت للعينة x 5 ويغلي عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت.
إضافة إلى كل أنبوب الملكية الفكرية والملكية الفكرية مراقبة أنبوب. هنا، تم استخدام 1 مغ من ليستي كل رد فعل الملكية الفكرية ومراقبة، أسفر عن ما مجموعة 8 ردود فعل الملكية الفكرية.
ملاحظة: من المستحسن 1.0 ملغ من كل مقايسة كنقطة انطلاق. مقدار الإرادة المطلوبة ليستي تختلف تبعاً لوفرة البروتين المعدل المستهدف.
احتضان هذه الأنابيب على منصة الدورية نهاية أكثر في 4 درجات مئوية عن ح 2. هنا، كان يستخدم المدورة أنبوب ATR سرعة 22.
جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 5,000 س ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
نضح قبالة المادة طافية قدر ممكن دون الإخلال بالخرز.
أغسل حبات في 1 مل بلاستر يغسل المخزن المؤقت (مثبطات غير ضرورية في هذه المرحلة) لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية بالتناوب منصة.
جمع الخرز بالطرد المركزي في 3,000 5,000 س ز لمدة 1 دقيقة في 4 درجات مئوية.
نضح قبالة المادة طافية قدر ممكن دون الإخلال بالخرز.
كرر الخطوة يغسل (الخطوات 3، 3، 10-12) مرتين أخريين.
بعد الغسيل النهائي، تماما إزالة المادة العازلة طافية. أقل قدر من الاضطراب بيليه حبة مقبول (ما يصل إلى خسارة 5%). إزالة المتبقية باستخدام غرامة المادة طافية تتحمل البروتين تحميل تلميح.
إضافة 30 ميليلتر من حبة شطف المخزن المؤقت، وريسوسبيند الخرز بالتنصت بلطف/التحريك على الجانب من الأنبوب. لا تستخدم ماصة في هذه المرحلة.
ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت.
احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
بلطف بنقل كل تعليق حبة إلى 1.5 مل ميكروسينتريفوجي عمود دوران التي وضعت في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
ملاحظة: من المستحسن لقص نهاية الخروج من طرف ماصة نقل لنقل الطف.
الطرد المركزي في 9,000-10,000 س ز لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لجمع العينة الملكية الفكرية.
إضافة 2 ميليلتر من 2-mercaptoethanol لكل عينة ومزيج جيد.
ملاحظة: أنها مريحة المفاجئة الغطاء قبالة عمود الدوران واستخدام هذا إلى كاب أنبوب جمع لمزيد من المعالجة.
وضع العينات في حمام مائي 95 درجة مئوية للحد الأدنى 5 جمع العينة باستخدام الطرد المركزي في 10,000 غ س ل 1 دقيقة في الرايت
إذا لزم الأمر، تخزين العينات في-70 درجة مئوية ويتوقف هنا، أو الشروع في تشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ونقل، وتحليل لطخة غربية (القسم 4).

4-الغربية وصمة عار التحليل: تحديد البروتين للفائدة

عينات منفصلة بالصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) ونقل إلى غشاء فلوريد (PVDF) الفينيليدن، وفقا للبروتوكولات القياسية مختبر³².
استخدام جسم الأولية للكشف عن الإصدارات المعدلة بوستترانسلاتيونالي من بروتين الفائدة. هنا، استخدمت جسم PD-L1 للكشف عن بوستترانسلاتيونالي معدلة PD-L1.
استخدام تشيميلومينيسسينسي أولتراسينسيتيفي الكشف عن الكاشف للكشف.
ملاحظة: يجب استخدام الكاشف تشيميلومينيسسينت بالاقتران مع جسم ثانوي المسمى HRP قادرة على اكتشاف الأجسام المضادة الأولية.
استخدام وحدة تخزين 2 مل من كاشف تشيميلومينيسسينت في غشاء نقل مصغرة الحجم جيل (8 × 7 سم تقريبا).
1. بعد الحضانة مع الجسم المضاد الثانوي المناسب (60 دقيقة في الرايت مستحسن)، غسل وصمة عار 6 × 10 دقيقة في 30 مل من المحلول الملحي تريس مخزنة مع توين-20 (تبسة).
  ملاحظة: انظر الجدول للمواد لتكوين المخزن المؤقت.
2. فورا قبل الاستخدام، مزيج 1 مل كاشف تشيميلومينيسسينت أ مع 1 مل كاشف تشيميلومينيسسينت ب (كافية لغشاء واحد 8 × 7 سم).
3. إضافة كاشف تشيميلومينيسسينت للغشاء واحتضان مع هزاز لطيف في RT 1-5 دقيقة قبل تصور إشارة البروتين باستخدام فيلم الأشعة السينية أو التصوير الكاميرا بجهاز اقتران (CCD).
  ملاحظة: قد تكون أقصر حضانة في الكاشف تشيميلومينيسسينت اللازمة لوفرة عالية البروتينات.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

قدرة هذه الأدوات على التحقيق PTM الحديث المتبادل عن طريق الكشف عن فعالية هذه بتمس 4 تعتمد جزئيا على نظام المخزن المؤقت تحلل فريدة من نوعها. يعزل بلاستر المخزن المؤقت يشوه فعالية البروتينات من جميع مقصورات الهاتف الخلوي وبالمثل للمخازن المؤقتة يشوه الأخرى، مما يضمن ملف تعريف بروتين كامل (الشكل 2A). بالإضافة إلى ذلك، فإنه يحافظ على إشارات PTM مجا عالية مثل السومو 2/3، الذي يتناقص سريعاً في المخازن المؤقتة غير يشوه مثل الإنزيم راديويمونوبريسيبيتيشن (RIPA) (الشكل 2). الأهم من ذلك، عندما تضعف على نحو مناسب، فإنه لا يؤثر في سلامة الكواشف تقارب مثل مخازن يشوه أخرى (مثلاً، لايملي المخزن المؤقت).

عقبة هامة عند العمل مع المخازن المؤقتة يشوه هو القدرة على إزالة فعالية المجينية الحمض النووي التلوث. المنهجية التقليدية لتقليل اللزوجة القص الحمض النووي باستخدام إبرة محقن أو سونيكاتينج العينة. الشكل 3 ألف تبين المجينية الحمض النووي التلوث في الخلية A431 ليستي بعد العلاج بتصفية بلاستر، إبرة المحقن أو sonication. وهناك الإزالة الكاملة تقريبا للحمض النووي باستخدام عامل التصفية بلاستر، الذي ليس هو الحال استخدام إبرة الحقن التقليدية أو sonication. المجينية الحمض النووي التلوث يؤثر إلى حد كبير الهجرة البروتين من خلال هلام اكريلاميد مخزونات النشر الاستراتيجي؛ ومع ذلك، يزيل العلاج مع عامل التصفية بلاستر الحمض النووي، أسفر عن هجرة البروتين السليم (الشكل 3B). غيرت الهجرة الناجمة عن الجينوم الحمض النووي التلوث يمكن أن تؤثر تأثيراً كبيرا على تفسير للبقع الغربية؛ على سبيل المثال، نمط EGFR بقع ينظر في فلتر ليستي قد غير دقيق تفسر على أنها تعبير زيادة بالنسبة للعينة التي تمت تصفيتها (الشكل 3).

باستخدام هذا PTM تخصيب اليورانيوم والكشف عن النظام الأمثل، واحد سرعة تحديد إذا بروتين هدف هو تعديل بواسطة واحدة أو أكثر بتمس. التحقيق في ملف التعريف PTM PD-L1 أجرى مؤخرا باستخدام هذا الأسلوب، وأظهرت النتائج أن PD-L1 أوبيكويتيناتيد، أسيتيلاتيد، وتيروزين فوسفوريلاتيد ردا على مماثلة (الشكل 4). الأهم من ذلك، ذكرت هذه البيانات الذاتية PTM PD-L1 التغييرات، التي تمثل نسبة ضئيلة من مجموع المشتريات-L1 المحددة.

figure-results-1
رقم 1: تصفية الحمض النووي من خلية ليستي مع تصفية بلاستر. تصفية "الصورة بلاستر" (A) . (ب) يتم تحميل ليستي في عامل التصفية الذي تم وضعه في أنبوب جمع 15 مل. (ج) يتم وضع المكبس في المحاقن وليستي يتم تمريرها من خلال المرشح بضغط. (د) جمع، بما في ذلك أي فقاعات عن طريق ضغط كاملة. (ه) تم تصفيته ليستي.

figure-results-2
رقم 2: مقارنة بلاستر تحلل العازلة للمخازن المؤقتة لتحلل البديلة. الشكل 2 (أ) مقتبس من هرتا et al. 2017. بيوسسي . Rep. ³¹ (أ) تم تفكيك خلايا A431 مع بلاستر، المعهد الملكي، مبر، وتحلل الملكية الفكرية، يشوه (الحزب الديمقراطي الصربي 1%)، ومخازن تحلل لايملي. وقد ليساتيس يشوه كل الحمض النووي إزالتها باستخدام عامل تصفية بلاستر. وتحددت عزل البروتينات من غشاء هيولى، الميتوكوندريا، وعلامات النووية استخدام الأجسام المضادة ضد البروتينات علامة كل منها حجرة. (ب) تم تفكيك خلايا A431 مع بلاستر وريبا 1% الحزب الديمقراطي الصربي يشوه المخزن المؤقت. وكانت ليساتيس إيمونوبريسيبيتاتيد مع سومو 2/3 أو مراقبة مفتش تقارب الخرز. كانت مفصولة بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة عينات وتحليلها من قبل لطخة غربية استخدام جسم 2/3-الفجل البيروكسيديز (HRP) سومو. اسطوانات يقوم الممثل من N≥3 تظهر التجارب المستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-3
الشكل 3: بلاستر تحلل عوامل التصفية فعالة في إزالة الدنا الجينومي. (أ) تم تفكيك خلايا A431 مع عازلة تحلل يشوه. تم إزالة الحمض النووي أو المنفصمة مع عامل تصفية بلاستر أو إبرة المحقن أو سونيكيشن لمدة 5 أو 10 أو 20 أو 30 ثانية. وقد تم تحليل % 2 اثيديوم بروميد, [اغروس] هلام التفريد. (ب) تفكيك من الخلايا A431 مع المخزن مؤقت يشوه أما فلتر أو تصفية مع عامل التصفية بلاستر. وتم فصل مع الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عينات وتصور استخدام أخذ وصمة عار. (ج) كانت تفصل عينات مكررة من ب صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ونقل إلى PVDF، وفحص البروتين EGFR استخدام جسم EGFR. تظهر البقع الممثل من التجارب المستقلة إيه ثري ن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

figure-results-4
الشكل 4: الكشف عن التعديلات بوستترانسلاشونال لو فعل لشعبة المشتريات-L1- الشكل مقتبس من هوريتا et al. 2017. نيوبلسا³⁰(A). كانت أما أونستيمولاتيد (UT) مقيدة بمصل الخلايا A431 أو حفزت مع لو لمدة ساعة واحدة قبل تحلل مع المخزن المؤقت لتحلل بلاستر. الاتحاد العالمي للعمل وقد تم تحليل مستويات PD-L1 (الممرات 1 و 2). واستخدمت الخرز ملزمة أوبيكويتين (UBA01) للملكية الفكرية أوبيكويتيناتيد البروتينات (الممرات 3 و 4). واستخدمت الخرز ملزمة فوسفوتيروسيني (APY03) للبروتينات تيروزين فوسفوريلاتيد الملكية الفكرية (الممرات 5, 6). واستخدمت سومو الملزمة 2/3 حبات (ASM24) للبروتينات IP سومويلاتيد 2/3 (الممرات 7، 8). أسيتيل يسين ملزمة الخرز (AAC01) استخدمت للملكية الفكرية أسيتيلاتيد البروتينات (الممرات 9 و 10). مفتش ملزمة تحكم الخرز واستخدمت للملكية الفكرية غير محددة ملزمة البروتينات (الممرات 11,12). كانت مفصولة بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة عينات وتحليلها من قبل لطخة غربية استخدام جسم PD-L1. ويرد ممثل وصمة عار من التجارب المستقلة إيه ثري ن. واستخدمت النجمة البيضاء لتسليط الضوء على pY PD-L1 ونطاقات البروتين التيار المتردد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

العمليات الحسابية للمخزن المؤقت لتحلل بلاستر
	مل 1.0	مل 2.0	مل 5.0	مل 10.0
المخزن المؤقت لتحلل بلاستر	ميليلتر 965	ميليلتر عام 1930	مل 4.825	مل 9.650
تيروزين الفوسفاتيز المانع	5 ميليلتر	10 ميليلتر	25 ميليلتر	50 ميليلتر
المانع دي-أوبيكويتيناسي/دي-سومويلاسي	10 ميليلتر	20 ميليلتر	50 ميليلتر	100 ميليلتر
المانع هداك	10 ميليلتر	20 ميليلتر	50 ميليلتر	100 ميليلتر
مثبط البروتياز كوكتيل	10 ميليلتر	20 ميليلتر	50 ميليلتر	100 ميليلتر
العمليات الحسابية للمخزن المؤقت لتمييع بلاستر
	مل 4.0	مل 8.0	مل 20.0	مل 40.0
المخزن المؤقت لتحلل بلاستر	مل 3.86	مل 7.72	مل 19.3	38.6 مل
تيروزين الفوسفاتيز المانع	20 ميليلتر	40 ميكروليتر	100 ميليلتر	200 ميليلتر
المانع دي-أوبيكويتيناسي/دي-سومويلاسي	40 ميكروليتر	ميليلتر 80	200 ميليلتر	400 ميليلتر
المانع هداك	40 ميكروليتر	ميليلتر 80	200 ميليلتر	400 ميليلتر
مثبط البروتياز كوكتيل	40 ميكروليتر	ميليلتر 80	200 ميليلتر	400 ميليلتر

الجدول 1: تحلل وتمييع المخزن المؤقت إعداد المخطط- مخطط توفير تركيزات مثبطات لإضافة لتحلل وتمييع المخزن مؤقت حجم معين عند إعداد المخازن لتحلل الخلية.

لوحة من البروتين	حجم "المخزن المؤقت لتحلل بلاستر" الموصى بها	وأوصى حجم "المخزن المؤقت لتمييع بلاستر"
< 1 ملغ	الجمع بين البروتين من لوحات متعددة	جعل وحدة التخزين النهائي 1.5 مل
1-2 مغ	300 ميليلتر	جعل وحدة التخزين النهائي 1.5 مل
2-4 ملغ	600 ميليلتر	لجعل المجلد 3 مل النهائي
4-6 ملغ	ميليلتر 900	جعل وحدة التخزين النهائي 4.5 مل

الجدول 2: بلاستر تحلل/إضعاف المخزن المؤقت المخطط- تقديم المخطط أوصى تحلل وتمييع حجم المخزن المؤقت عند الحصول على ليستي.

حجم الخلية ليستي إضافة إلى 1 مل كاشف "مقايسة البروتين الأحمر الدقة" (ميليلتر)	المضاعف لاستخدامها مع نموذج القراءة OD₆₀₀
10	10
20	5
30	3.3
40	2.5
50	2

الجدول 3: مضاعفات لتحويل قراءات جهاز المطياف الضوئي بملغ/مل ليستي. مخطط توفير أرقام التحويل إلى مساعدي مع حساب تركيز البروتين.

تقارب الخرز	حجم حبة الملاط/IP (mL)
أوبيكويتيناتيون	20
فوسفوتيروسيني	30
سومويليشن 2/3	40
أسيتيليشن	50
مراقبة الخرز	حجم حبة الملاط/IP (mL)
أوبيكويتينيشن تحكم الخرز	20
فوسفوتيرسويني تحكم الخرز	30
سومويليشن الخرز التحكم 2/3	40
أسيتيليشن تحكم الخرز	50

الجدول 4: وأوصى حجم المخطط الخرز/الملكية الفكرية- تقديم المخطط أوصى كميات من الخرز تقارب استخدام لكل رد فعل الملكية الفكرية.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن تنفيذ النهج الأولية المستخدمة لتحديد إذا كان بروتين هدف هو تعديل بواسطة PTM باستخدام الأجسام المضادة المحددة البروتين المستهدف للملكية الفكرية، تليها لطخة غربية مع جسم PTM (مثلاً.، يسين أسيتيل المضادة)، أو باستخدام جسم PTM للملكية الفكرية، تليها لطخة غربية مع الهدف البروتين جسم معين³⁰^،^،من³¹³³. بينما يعمل كلا النهجين نظرياً، استخدام جسم محددة الهدف البروتين قد أكثر المزالق المحتملة، مثل الأجسام المضادة قد لا تكون الملكية الفكرية متوافقة، أو قد كتلة كبيرة PTM التعديلات على الموقع التعرف على جسم البروتين المستهدف³⁴ ^،³⁵. وميزة الخرز تقارب PTM أن المجالات جسم أو ملزمة تعترف على وجه التحديد PTM الاهتمام؛ وهكذا، ينبغي أن لا تغير التعديلات للبروتين الهدف الاعتراف بالخرز تقارب. على سبيل مثال، قد حددت Ub PD-L1 مع الأسلوب الموصوفة هنا، ولوحظ كلا الذاتية مونو-وبولي-يو بي (الشكل 4). منشور صدر مؤخرا بيم وآخرون. تستخدم في المختبر Ub تقنيات التحقيق Ub PD-L1، وكانت النتيجة مشابهة جداً للنتائج هو موضح في الشكل 4³⁶. من المثير للاهتمام، أدوا أيضا الملكية الفكرية مع جسم PD-L1 لإثراء PD-L1 من الخلية، حيث كان أوفيريكسبريسيد Ub وأضيفت ملغ-132 لتعزيز الإشارات. نمط Ub لم تكن قوية ومتميزة للغاية من نمط Ub في المختبر . لم يتم إجراء التحقيق من Ub PD-L1 الذاتية في نماذج الثقافة الخلية في ليم وآخرون. التقرير لتوضيح الفرق بين البيانات خلية الثقافة و في المختبر .

التحقيق في ما إذا كان بروتين معدلة بواسطة PTM يمكن أن يكون تحديا، نظراً لوفرة منخفضة وطبيعة عابرة³⁷^،³⁸، وغالباً ما يتطلب الإثراء من خلال الملكية الفكرية. الملكية الفكرية بتمس فعالة يتطلب الاستغلال الأمثل للعديد من الخطوات الرئيسية والكواشف، مثل المخازن المؤقتة لتحلل وتقارب الكواشف. عند التحقيق بتمس متعددة من البروتين المستهدف، يزيد من التحسين المطلوب عرضه. استخدام نظام تحلل بلاستر يعد خطوة حاسمة في هذا البروتوكول، كما أنها تحتفظ بقدرة الملكية الفكرية قوية، مع تمكين الكشف PTM pY وسومو 2/3، يو بي، و "التيار المتردد بتمس" في نظام واحد. يحسن هذا الأسلوب بالوقت والموارد اللازمة لتحديد إذا كان بروتين مستهدفة محددة يتم تعديلها بواسطة هذه بتمس أربعة، ويحتمل أن يقدم صورة أفضل عن PTM الحديث المتبادل بالنسبة لمقارنة النتائج PTM إجراء باستخدام العديد من أنظمة تحلل. وأجرى التحقيق في التوافق نظام تحلل بلاستر مع بتمس البديلة، مثل جليكوسيلاتيون،؛ ومع ذلك، لا قد درست مستفيض لجميع أنواع بتمس.

غزير الحمض النووي يمكن أن تتداخل مع البروتين القياسات باستخدام أما اللونية أو أساليب نانودروب، تؤثر هجرة البروتينات في هلام اكريلاميد الحزب الديمقراطي الصربي، ومنع التفاعل مصفوفة البروتين وتقارب خلال فحوصات الملكية الفكرية. ويستخدم الأسلوب الموصوفة هنا عامل تصفية متخصصة لفعالية إزالة التلوث الجينوم بالحمض النووي، الذي يعد خطوة حاسمة أخرى من هذا البروتوكول. لتسليط الضوء على هذه النقطة، أجريت اختبارات اللزوجة قبل وبعد العلاج تصفية بلاستر، وأظهرت النتائج انخفاضا من لزوجة عالية اللزوجة من المياه (البيانات لا تظهر). وأيد هذا التغير في اللزوجة النتائج في الشكل 3، تظهر كلها تقريبا الحمض النووي قد أزيلت. الأهم من ذلك، لا يتم المنفصمة الحمض النووي مع هذا الأسلوب، كما سوف يتم القبض على أي الحمض النووي المنفصمة لا بواسطة عامل تصفية (البيانات لا تظهر). هذه الأداة متفوقة على الأساليب التقليدية، مثل سونيكيشن أو حقنه-الحمض النووي القص، لأنه يتطلب أي معدات متخصصة، واستنساخه بدرجة عالية، ويزيل الحمض النووي بدلاً من قص عليه. وعلاوة على ذلك، فإنه سوف لا تتحلل البروتين في، الذي يمكن أن يحدث باستخدام الأساليب التقليدية في²⁹. استخدام عامل التصفية يأخذ 5-30 ثانية كل عينة مقارنة بالأساليب البديلة حيث قد يستغرق عدة دقائق (أيحقنه القص) توزيع فعال للحمض النووي ويمكن أن يؤدي عدم تجانس عينة الملوثات الحمض النووي لا تزال في. تم إجراء تحليل مستفيض لتصفية بلاستر ليساتي ما قبل وما بعد، ولا يوجد فرق ملحوظ في التشكيل الجانبي للبروتين لوحظ بأخذ، محددة الهدف الغربي، أو مجموع ومحددة الهدف PTM التحليلات؛ وهكذا، تكامل الشخصية البروتين قد لا تأثرت بتصفية الحمض النووي. وفي نهاية المطاف، هذا النظام عامل تصفية مفيد لأي غربي أو تطبيق الملكية الفكرية فيها الحمض النووي الحالي وقد تؤثر على تفسير لتحليل البروتين.

من المهم أن نلاحظ أن هناك إمكانية للكشف عن سلبية زائفة استخدام هذا الأسلوب، الذي قد يعود في جزء منه إلى تقارب حبة التشبع أو تدخل الموقع ملزمة، أو إخفاء PTM. على سبيل المثال، قد يتم تعديل بروتين هدف معين بالتيار المتردد عند مستويات منخفضة جداً؛ وهكذا، قد عزلت بعموم-أسيتيل يسين تقارب الخرز التي قد تم مشبعة بالبروتينات المستهدفة تعديل التيار المتردد أكثر وفرة لا. تنفذ الدراسات الجارية لتقييم حدود الكشف والكواشف النسب المستخدمة في هذا البروتوكول، ولكن منشور صدر مؤخرا يشير إلى حد كشف قوية جداً. وأظهرت البيانات أن هذه التقنية يمكن أن تحدد عدد قليل من الجزيئات البروتينية الهدف أسيتيلاتيد 17 كل خلية³¹. لا يزال، ظروف محددة مثل الخلية اكتب خصوصية، بتمس عابر في الاستجابة للمحفزات محددة، أو إخفاء بتمس بسبب التفاعل البروتين قد تؤدي جميع النتائج السلبية الكاذبة. هذه هي المزالق المحتملة لهذه التقنية، فضلا عن معظم PTM IP أساليب. وهكذا، من المستحسن لتأكيد النتائج باستخدام نهج متعددة.

أظهرت التعديلات مثل glycosylation والفسفره للتنافس على الأحماض الأمينية مماثلة³⁹^،⁴⁰وبتمس الأخرى مثل أوبيكويتينيشن والفسفره قد ثبت أن العمل بالتتابع لتنظيم نسبة البروتين وظيفة¹⁷^،⁴¹. وأبرز العمل مؤخرا على البروتين لاثيل تاو أهمية PTM الحديث المتبادل، حيث فرط تاو-الفسفرة و "سومويلاتيون تاو" تعزيز بعضها البعض⁴². وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه المجموعة أن منع "سومويليشن تاو" بولي-يو بي واللاحقة Tau التدهور، مما قد يؤدي إلى التراكم. هذا مجرد واحدة من العديد من الأمثلة على الحديث المتبادل PTM التنظيمية، وفائدة هذا الأسلوب سيساعد على إلقاء الضوء على أهمية بتمس وعلى الحديث المتبادل في تنظيم البروتينات الأساسية في الصحة والمرض.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سمو والجامعة العربية موظفا من "سيتوسكيليتون وشركة ك. م." مؤسس شركة سيتوسكيليتون

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر سيتوسكيليتون وشركة أبحاث العلماء والدكتور ريان هوفر واشلي ديفيس لاستعراض دقيق والتحرير، ومناقشات مثمرة حول المخطوطة. بالإضافة إلى ذلك، نشكر الدكتور روبرت هوم لمساهمته خلال إنتاج المخطوطة الفيديو. هذا العمل كانت مدعومة بتمويل من شركة سيتوسكيليتون

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
<قوي > تحلل الخلية / إزالة الحمض النووي الجيني وتحليله < / قوي >
1x محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) وصفة	العازلة		المشتركة: كلوريد الصوديوم ، KCl ، Na _{2< / sub>HPO_{4< / sub> ، KH_{2< / sub>PO_{4< / sub>}}}}
BlastR lysis	buffer Cytoskeleton Inc.	BLST01	خليط خاص من المنظفات والأملاح والمواد المضافة العازلة الأخرى
المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي الإشعاعي (RIPA)	الوصفة العازلة الشائعة		: Tris-HCl ، NaCl ، SDS ، Deoxycholate الصوديوم ،
كاشف استخراج بروتين الثدييات Igepal (mPER) Thermofisher		78503	خليط خاص من المنظفات والأملاح والمواد المضافة العازلة الأخرى
الترسيب المناعي (IP) ثقب التحلل		87787	خليط خاص من المنظفات والأملاح والمواد المضافة العازلة الأخرى
1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) المخزن المؤقت المشترك لتغيير	العازلة		المشتركة: PBS ، SDS ، EDTA ، EGTA
Laemmli	العازلة		الوصفة: Tris-HCl ، SDS ، الجلسرين ، البروموفينول الأزرق
BlastR المخزن المؤقت	للتخفيف Cytoskeleton Inc.	BDB01	خليط خاص من المنظفات والأملاح والمواد المضافة العازلة الأخرى
Protease Inhibitor Cocktail	Cytoskeleton Inc.	PIC02
N-إيثيل ماليميد (NEM) & أمبير N ، N ، N & prime ؛ N & Prime ؛ -Tetrakis (2-pyridylmethyl) ethylenediamine (TPEN)	Cytoskeleton Inc.	NEM09BB
Trichostatin A (TSA) & شركة الهيكل الخلوي للنيكوتيناميد		TSA01
أورثوفانادات الصوديوم المنشط (Na_{3< / sub>VO_{4) < / sub>}}	Cytoskeleton Inc.	PYI01
	Costar	3008
BlastR Filter	Cytokeeleton Inc.	BLR02
BD إبرة حقنة الأنسولين	BD	08290-3284-11
سونيكاتور (برانسون سونيفير)	برانسون	سونيفير 450
بريسيشن ريد ريشيف البروتين	المتقدم الهيكل الخلوي Inc.	ADV02
1 مل كوفيت	فيشر	14955127
مقياس الطيف الضوئي (Genesys20)	Thermofisher	4001	يمكن استخدام الطيف الضوئي الآخر لقياس تركيز البروتين
Agarose	Fisher	BP1356-500
1kb سلم الحمض النووي منقوص الأكسجين (DNA)	NEB	N3232L
صندوق هلام الحمض النووي	الحراري	7312 B1A
Tris / Borate / EDTA (TBE) عازلة		مشتركة	وصفة: Tris-HCl ، حمض البوريك ، EDTA
قوي >PTM الترسيب المناعي < / قوي >
حبات فوسفوتيروزين	الهيكل الخلوي Inc.	APY03-الخرز
Ubiquitination الخرز	الهيكل الخلوي Inc.	UBA01 الخرز
SUMOylation 2/3 الخرز	الهيكل الخلوي Inc.	ASM24-الخرز
Acetylation الخرز	الهيكل الخلوي Inc.	AAC04-الخرز
الخرز التحكم في الفوسفوتيروزين	الهيكل الخلوي Inc.	حبات CIG01 حبات
التحكم في الانتشار الهيكل	الخلوي ، Inc.	CUB02-الخرزات
SUMOylation 2/3 حبات التحكم	الهيكل الخلوي Inc.	CIG01-الخرز
التحكم في Acetylation الخرز	الهيكل الخلوي Inc.	CIG02-الخرز
BlastR غسل المخزن المؤقت	للهيكل الخلوي Inc.	BWB02	خليط خاص من المنظفات والأملاح والمواد المضافة العازلة الأخرى
عازلة شطف الخرز	Cytoskeleton Inc.	BEB01	مزيج خاص من المنظفات والأملاح والمواد المضافة العازلة الأخرى
الطرد المركزي	الدقيقة Eppendorf	5417	يمكن استخدام أجهزة الطرد المركزي الدقيقة الأخرى.
أنبوب دوار	ATR	RKVSD	يمكن استخدام دوارات الأنبوب الأخرى نهاية النهاية ؛
نصائح تحميل البروتين	VWR	37001-150
أعمدة الدوران	الهيكل الخلوي Inc.	SPN22
95 درجة ؛ C	المعياري	BSH1002
SDS-PAGE / Transfer / التحليل الغربي < / strong>
5x عينة عازلة	وصفة العازلة		الشائعة: بروموفينول الأزرق ، ديثيوثريتول (DTT) ، الجلسرين ، SDS ، Tris-HCl
novex wedge جيدا 4-20٪ Tris-gly المواد الهلامية	Invitrogen	XP04200BOX	تعتبر الآبار الوتيدنجية الكبيرة ممتازة لتحميل كميات كبيرة
1x تشغيل المخزن المؤقت	العازلة		المشتركة: Tris-HCl ، Glycine ، SDS
seeblue سلم البروتين	Technologies	LC5625
خلية الرحلان الكهربائي	Invitrogen	Xcell surelock خلية الرحلان	الكهربائي الأخرى يمكن استخدامها ، ومع ذلك فهي متوافقة مع المواد الهلامية Novex wedgewell ؛
مزود الطاقة	Biorad	PowerPac HC	يمكن استخدام مصادر الطاقة الأخرى
1x وصفة العازلة			العازلة: Tris-HCl ، الجلايسين ، خلية نقل الميثانول
	Biorad	خلية نقل اللطخة	الأخرى يمكن استخدامها ؛
تزدهر أغشية Immobilon- P (PVDF)	ميليبور	IPVH 304F0
الحليب الخالي من الدسم		813503015095
محلول ملحي مخزن في تريس مع المراهقين (TBST) وصفة	العازلة		الشائعة: Tris-HCl ، NaCl ، Tween 20
كاشف الكشف عن الهيكل	الخلوي Inc.	CLRA / CLRB
<قوي >نمو الخلايا وعلاجها < / قوي>
وسط النسر المعدل من Dulbecco ؛	ATCC	30-2002
مصل الأبقار الجنيني	ATLAS	F-0500-A
عامل نمو البشرة	الهيكل الخلوي Inc.	CN02-A
لوحات زراعة الخلايا 150 مم	كورنينج	430599

طبيعة الوصفة المشتركة كاشطات الخلايا < أجهزة كتلة حرارية وصفة Life المشتركة للنقل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drazic, A., Myklebust, L. M., Ree, R., Arnesen, T. The world of protein acetylation. Biochim Biophys Acta. 1864 (10), 1372-1401 (2016).
Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Res. 26 (4), 399-422 (2016).
Eifler, K., Vertegaal, A. C. SUMOylation-Mediated Regulation of Cell Cycle Progression and Cancer. Trends Biochem Sci. 40 (12), 779-793 (2015).
Hunter, T. The genesis of tyrosine phosphorylation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (5), 1-15 (2014).
International Human Genome Sequencing Consortium. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature. 431 (7011), 931-945 (2004).
Jensen, O. N. Modification-specific proteomics: characterization of post-translational modifications by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 8 (1), 33-41 (2004).
Pellegrino, S., Altmeyer, M. Interplay between Ubiquitin, SUMO, and Poly(ADP-Ribose) in the Cellular Response to Genotoxic Stress. Front Genet. 7 (63), 1-8 (2016).
Liddy, K. A., White, M. Y., Cordwell, S. J. Functional decorations: post-translational modifications and heart disease delineated by targeted proteomics. Genome Med. 5 (2), 20(2013).
Margolin, D. H., Kousi, M., Chan, Y. M., Lim, E. T., Schmahmann, J. D., Hadjivassiliou, M., Hall, J. E., Adam, I., Dwyer, A., Plummer, L., et al. Ataxia, dementia, and hypogonadotropism caused by disordered ubiquitination. N Engl J Med. 368 (21), 1992-2003 (2013).
Droescher, M., Chaugule, V. K., Pichler, A. SUMO rules: regulatory concepts and their implication in neurologic functions. Neuromolecular Med. 15 (4), 639-660 (2013).
Anbalagan, M., Huderson, B., Murphy, L., Rowan, B. G. Post-translational modifications of nuclear receptors and human disease. Nucl Recept Signal. 10 (e001), 1-13 (2012).
Kim, M. Y., Bae, J. S., Kim, T. H., Park, J. M., Ahn, Y. H. Role of transcription factor modifications in the pathogenesis of insulin resistance. Exp Diabetes Res. 2012 (716425), 1-16 (2012).
West, A. C., Johnstone, R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment. J Clin Invest. 124 (1), 30-39 (2014).
Kim, H. J., Bae, S. C. Histone deacetylase inhibitors: molecular mechanisms of action and clinical trials as anti-cancer drugs. Am J Transl Res. 3 (2), 166-179 (2011).
Gu, B., Zhu, W. G. Surf the post-translational modification network of p53 regulation. Int J Biol Sci. 8 (5), 672-684 (2012).
Janke, C. The tubulin code: molecular components, readout mechanisms, and functions. J Cell Biol. 206 (4), 461-472 (2014).
Nguyen, L. K., Kolch, W., Kholodenko, B. N. When ubiquitination meets phosphorylation: a systems biology perspective of EGFR/MAPK signalling. Cell Commun Signal. 11 (52), 1-15 (2013).
Hunter, T. The age of crosstalk: phosphorylation, ubiquitination, and beyond. Mol Cell. 28 (5), 730-738 (2007).
Butler, P. L., Staruschenko, A., Snyder, P. M. Acetylation stimulates the epithelial sodium channel by reducing its ubiquitination and degradation. J Biol Chem. 290 (20), 12497-12503 (2015).
Wang, Y., Wang, Y., Zhang, H., Gao, Y., Huang, C., Zhou, A., Zhou, Y., Li, Y. Sequential posttranslational modifications regulate PKC degradation. Mol Biol Cell. 27 (2), 410-420 (2016).
Guo, Z., Kanjanapangka, J., Liu, N., Liu, S., Liu, C., Wu, Z., Wang, Y., Loh, T., Kowolik, C., Jamsen, J., et al. Sequential posttranslational modifications program FEN1 degradation during cell-cycle progression. Mol Cell. 47 (3), 444-456 (2012).
Cui, W., Sun, M., Zhang, S., Shen, X., Galeva, N., Williams, T. D., Staudinger, J. L. A SUMO-acetyl switch in PXR biology. Biochim Biophys Acta. 1859 (9), 1170-1182 (2016).
Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
Siuti, N., Kelleher, N. L. Decoding protein modifications using top-down mass spectrometry. Nat Methods. 4 (10), 817-821 (2007).
Mischerikow, N., Heck, A. J. Targeted large-scale analysis of protein acetylation. Proteomics. 11 (4), 571-589 (2011).
Barysch, S. V., Dittner, C., Flotho, A., Becker, J., Melchior, F. Identification and analysis of endogenous SUMO1 and SUMO2/3 targets in mammalian cells and tissues using monoclonal antibodies. Nat Protoc. 9 (4), 896-909 (2014).
Emmerich, C. H., Cohen, P. Optimising methods for the preservation, capture and identification of ubiquitin chains and ubiquitylated proteins by immunoblotting. Biochem Biophys Res Commun. 466 (1), 1-14 (2015).
Peach, M., Marsh, N., Miskiewicz, E. I., MacPhee, D. J. Solubilization of proteins: the importance of lysis buffer choice. Methods Mol Biol. 1312, 49-60 (2015).
Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods Enzymol. 463, 285-303 (2009).
Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. Identifying Regulatory Posttranslational Modifications of PD-L1: A Focus on Monoubiquitinaton. Neoplasia. 19 (4), 346-353 (2017).
Horita, H., Law, A., Hong, S., Middleton, K. A simple toolset to identify endogenous post-translational modifications for a target protein: a snapshot of the EGFR signaling pathway. Biosci Rep. 37 (4), 1-14 (2017).
Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
Li, C. L., Sathyamurthy, A., Oldenborg, A., Tank, D., Ramanan, N. SRF phosphorylation by glycogen synthase kinase-3 promotes axon growth in hippocampal neurons. J Neurosci. 34 (11), 4027-4042 (2014).
Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
Fuchs, S. M., Krajewski, K., Baker, R. W., Miller, V. L., Strahl, B. D. Influence of combinatorial histone modifications on antibody and effector protein recognition. Curr Biol. 21 (1), 53-58 (2011).
Lim, S. O., Li, C. W., Xia, W., Cha, J. H., Chan, L. C., Wu, Y., Chang, S. S., Lin, W. C., Hsu, J. M., Hsu, Y. H., et al. Deubiquitination and Stabilization of PD-L1 by CSN5. Cancer Cell. 30 (6), 925-939 (2016).
Wu, R., Haas, W., Dephoure, N., Huttlin, E. L., Zhai, B., Sowa, M. E., Gygi, S. P. A large-scale method to measure absolute protein phosphorylation stoichiometries. Nat Methods. 8 (8), 677-683 (2011).
Ordureau, A., Munch, C., Harper, J. W. Quantifying ubiquitin signaling. Mol Cell. 58 (4), 660-676 (2015).
Lefebvre, T., Ferreira, S., Dupont-Wallois, L., Bussiere, T., Dupire, M. J., Delacourte, A., Michalski, J. C., Caillet-Boudin, M. L. Evidence of a balance between phosphorylation and O-GlcNAc glycosylation of Tau proteins--a role in nuclear localization. Biochim Biophys Acta. 1619 (2), 167-176 (2003).
Wang, X., Li, D., Wu, G., Bazer, F. W. Functional Roles of Fructose: Crosstalk between O-Linked Glycosylation and Phosphorylation of Akt-TSC2-MTOR Cell Signaling Cascade in Ovine Trophectoderm Cells. Biol Reprod. 9 (5), 1-17 (2016).
Levkowitz, G., Waterman, H., Zamir, E., Kam, Z., Oved, S., Langdon, W. Y., Beguinot, L., Geiger, B., Yarden, Y. c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor. Genes Dev. 12 (23), 3663-3674 (1998).
Luo, H. B., Xia, Y. Y., Shu, X. J., Liu, Z. C., Feng, Y., Liu, X. H., Yu, G., Yin, G., Xiong, Y. S., Zeng, K., et al. SUMOylation at K340 inhibits tau degradation through deregulating its phosphorylation and ubiquitination. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (46), 16586-16591 (2014).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PD L1 EGF

استخدام نظام إثراء إيمونوبريسيبيتيشن شاملة لتحديد ملف تعريف تعديل بوستترانسلاشونال ذاتية للبروتينات المستهدفة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة